南京农业大学学报  2017, Vol. 40 Issue (4): 625-631   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201610003
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文章信息

张小倩, 张炜, 卢亚萍, 高胜玲, 汪瑾
ZHANG Xiaoqian, ZHANG Wei, LU Yaping, GAO Shengling, WANG Jin
短短芽孢杆菌发酵液对铜绿微囊藻的抑制效应
The inhibitory effect of the fermentation filtrate of Brevibacillus brevis on Microcystis aeruginosa
南京农业大学学报, 2017, 40(4): 625-631
Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(4): 625-631.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201610003

文章历史

收稿日期: 2016-10-09
短短芽孢杆菌发酵液对铜绿微囊藻的抑制效应
张小倩, 张炜, 卢亚萍, 高胜玲, 汪瑾    
南京农业大学生命科学学院, 江苏 南京 210095
摘要[目的]微囊藻水华给湖泊生态系统及人类健康带来很大危害,本研究旨在探寻高效环保的微生物抑藻材料。[方法]通过流式细胞仪测定短短芽孢杆菌B15不同发酵时间及添加量下无菌发酵上清液的抑藻率,通过激光共聚焦显微镜和电子显微镜观察处理后的藻细胞形态,并通过叶绿素荧光仪测定处理前、后藻细胞光合作用的变化。另外,检测了发酵上清液在不同温度、pH值和蛋白酶处理下的活性变化。[结果]0.3%、0.7%、1.0%和2.0%添加量的发酵液处理6 d后抑藻率分别为51.89%、79.89%、89.47%和86.94%。发酵液发酵48和72 h抑藻活性无明显差异,但略优于发酵24 h。发酵上清液处理6 d后,藻细胞Fv/FmETRmax值均显著下降,表明其光合作用受到抑制。激光共聚焦显微镜观察发现:许多细胞停留在分裂末期,呈2细胞或4细胞状态。1.0%发酵上清液处理6 d后藻液中2细胞和4细胞所占比例分别达到62.23%和14.95%,表明藻细胞分裂增殖严重受阻。透射电镜观察结果显示:经处理后藻细胞严重受损,出现质壁分离、类囊体结构及细胞膜断裂的现象。发酵上清液超滤结果显示抑藻活性物质相对分子质量小于10×103。将抑藻物质在4、25和37 ℃处理6 h后,抑藻活性和对照相比无显著差异,说明该活性物质在低温下有较好的稳定性。另外,在pH值2~12的范围内,抑藻物质都保持很好的活性。抑藻物质对胰蛋白酶和蛋白酶K均不敏感。[结论]短短芽孢杆菌B15通过分泌小分子化合物高效而持久地抑制铜绿微囊藻的生长繁殖,降低其光合作用效率,并阻遏细胞的分裂。
关键词短短芽孢杆菌   铜绿微囊藻   抑藻剂   抑藻效应   
The inhibitory effect of the fermentation filtrate of Brevibacillus brevis on Microcystis aeruginosa
ZHANG Xiaoqian, ZHANG Wei, LU Yaping, GAO Shengling, WANG Jin    
College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] The frequent outbreaks of algal-bloom have done great harm to ecosystems and human life. The aim of this study was to explore a high-effective and eco-friendly algicide from microbes. [Methods] The inhibitory rates of the sterile filtrate at different fermentation time and different concentrations were determined by flow cytometry. The morphology of the cyanobacterial cells was observed by laser scanning confocal microscope and electron microscope. The changes of photosynthetic activities between control and treated cells were measured by using a pulse amplitude-modulated fluorescence monitoring system. In addition, the changes of the algicidal activities of the sterile filtrate under different temperature, pH value and protease treatment were detected. [Results] The sterile filtrate with the added amount of 0.3%, 0.7%, 1.0% and 2.0% had an inhibitory rate of 51.89%, 79.89%, 89.47% and 86.94%, respectively. There was no significant difference between the inhibitory activity of 48 and 72 h fermentation filtrate, both of which were better than that of 24 h fermentation. After 6 days' treatment, Fv/Fm and ETRmax value decreased significantly, which suggested the inhibition of photosynthesis. Under the laser scanning confocal microscope, many cells were found to remain at the end of cell division, forming 2-or 4-cell aggregates. The proportion of 2-and 4-cell after treatment for 6 d by 1.0% of fermentation filtrate was 62.23% and 14.95%, respectively, showing the cell division was severely blocked. Transmission electron microscope showed that the algal cells were seriously damaged, with the phenomenon of plasmolysis, the rupture of the thylakoid and cytomembrane. The molecular weight of the main active substances was speculated to be less than 10×103 by ultrafiltration of the sterile filtrate. After treatment for 6 h at 4, 25 and 37 ℃, the inhibitory activity had no marked difference from the control, which showed that the active substances were stable at these temperatures. In addition, after treatment at pH value 2-12, the active substances remained good inhibitory activity. The fermentation filtrate was not sensitive to trypsin or protease K. [Conclusions] B15 can inhibit the growth and reproduction of M.aeruginosa by secreting small molecules, which reduce its photosynthetic efficiency and repress cell division, with a high and lasting inhibitory rate.
Key words: Brevibacillus brevis    Microcystis aeruginosa    algicide    cyanobacterial inhibition effect   

近年来, 随着水体富营养化的日益严重, 有害藻类水华频繁爆发, 严重破坏水生生态系统, 带来了巨大的经济损失和环境问题[1]。铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是形成水华的主要藻类之一[2], 其产生藻毒素, 严重威胁着人类的健康。因此, 探索有效的控藻途径已极为迫切[3]。目前已知的控藻技术主要为物理控藻、化学控藻和生物控藻[4]。由于物理控藻和化学控藻分别存在工作量大、成本高和难清除、容易产生二次污染等缺点[5], 生物控藻作为一种高效、安全、环境友好型的控藻技术已被广泛关注[6]

细菌溶藻是一种新型的生物控藻技术, 已报道的溶藻细菌主要有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和地杆菌属(Pedobacter)等[7-10]。这些细菌多分离自水华水体、底泥, 这种土著细菌在工程应用中具有安全、特异性强的优点, 但筛选过程耗时、耗力。

短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)属于短芽孢杆菌属, 广泛存在于水、空气和土壤中, 具有较强的抗逆性[11]。该种细菌能够产生短杆菌肽、几丁质酶等活性物质, 从而拮抗多种细菌和真菌, 在生物防治和临床应用等方面具有广阔前景[12]。Che等[13]发现B.brevis能够拮抗大肠杆菌、乳酸杆菌和沙门氏菌, 可以作为猪幼崽饲料添加剂。王宇婷等[14]发现B.brevis 011对番茄早殁病菌菌丝及孢子有抑制作用。此外, Majumdar等[15]发现B.brevis FF02B能够产生溶解纤维蛋白的丝氨酸蛋白酶, 该酶可以溶解血栓, 在治疗心血管疾病肽类药物开发上具有极大潜力。关于B.brevis在溶藻方面的研究至今鲜有报道。为进一步寻找有价值的溶藻微生物, 我们对从土壤中分离出的一株能够产生抑菌物质的B.brevis B15[16]进行抑藻试验, 发现该株细菌具有高效抑藻活性, 并进一步对其发酵液中活性物质性质及抑藻效应进行探讨, 以期为溶藻物质的分离、纯化和高效杀藻剂的开发应用奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

铜绿微囊藻FACHB-915(M.aeruginosa PCC7806) 购自中国科学院武汉水生生物研究所。短短芽孢杆菌B15由南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室李顺鹏教授课题组友情提供。所有生化试剂为国产分析纯。

1.2 方法 1.2.1 藻的培养

将对数生长期的M.aeruginosa PCC7806转接到新鲜的BG11培养基[17]中, 初始浓度为5×105 mL-1, 放入光照培养箱培养。培养条件为:光/暗培养时间为12 h/12 h, 光照强度为40 μmol·m-2· s-1, 温度为25 ℃。定时取样在流式细胞仪(Accuri C6, 美国Becton, Dickinson and Company)上计数。

1.2.2 细菌的培养及无菌滤液的制备

将B15接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中, 30 ℃、200 r·min-1摇床培养12 h后将种子菌悬液按1%(体积分数, 下同)的比例接种于新鲜的牛肉膏蛋白胨液体培养基中, 再培养48 h, 获得细菌发酵液。离心收集发酵上清液, 0.22 μm无菌滤膜过滤除菌, 获得溶藻细菌无菌滤液, 以下简称无菌滤液。

1.2.3 发酵时间对无菌滤液抑藻活性的影响

将种子菌悬液分别振荡培养24、48和72 h, 将各无菌滤液按0.3%和1.0%的比例分别加入到20 mL起始浓度为1.0×106的藻液中, 对照组加入对应体积的无菌培养基, 培养6 d后计数, 计算抑藻率。铜绿微囊藻的抑藻率(inhibition rate, IR)定义为:IR=(Nc-Nt)/Nc×100%。式中:Nc代表对照组铜绿微囊藻细胞浓度(mL-1); Nt代表处理组铜绿微囊藻细胞浓度(mL-1)。

1.2.4 无菌滤液浓度对抑藻活性的影响

将无菌滤液分别按0.3%、0.7%、1.0%和2.0%分别添加到20 mL起始浓度为1.0×106的藻液中进行抑藻试验, 对照组添加对应体积的无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基, 光照培养箱培养10 d, 每2 d计数1次, 计算抑藻率。

1.2.5 无菌滤液对铜绿微囊藻光合作用的影响

将0.3%和1.0%的无菌滤液处理6 d后的藻细胞, 用多波长藻类叶绿素荧光仪(PHYTO-PAM)测定各组M.aeruginosa叶绿素荧光参数。通过叶绿素调制荧光仪测定Fo(暗适应后最小荧光产量)和Fm(暗适应执行饱和脉冲后最大荧光产量), 根据FmFo可以计算出PS Ⅱ的Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm, 它反映了细胞的潜在最大光合能力。取各组藻液2 mL, 暗处理15 min后测定PS Ⅱ的Fv/Fm值。设置不同光照强度, 测定光响应曲线, 系统根据拟合方程给出最大相对电子传递速率ETRmax

1.2.6 无菌滤液中抑藻活性物质的性质测定

取3 mL无菌滤液置于截留蛋白相对分子质量为10×103的超滤管中, 4 ℃、3 500 g离心30 min, 测定上、下层滤液的抑藻率。将下层滤液转移至截留蛋白相对分子质量为3×103的超滤管中离心, 然后测定上、下层滤液的抑藻率。3种组分按1.0%的添加量进行抑藻试验, 未处理组加入等体积原无菌滤液, 培养6 d后计数, 计算抑藻率。根据抑藻率估算抑藻活性物质相对分子质量范围。

取等量无菌滤液分别在4、25、37、50和70 ℃处理6 h后按1.0%的比例接入藻液, 对照组加入等体积的无菌培养基, 6 d后取样计数, 计算抑藻率。取10 mL无菌滤液6份, 用1 mol·L-1 HCl和1 mol·L-1 NaOH溶液分别调pH值至2、4、6、8、10和12, 4 ℃静置6 h后调回至原值(pH7), 进行抑藻试验6 d后计数, 计算抑藻率。另外将胰蛋白酶和蛋白酶K(终浓度1 mg·mL-1)加入无菌滤液, 37 ℃水浴处理3 h后按1.0%接种量接入藻液中进行抑藻试验, 6 d后取样计数, 计算抑藻率。

1.2.7 无菌滤液处理前、后藻细胞的显微观察

取对照和0.3%、1.0%的无菌滤液处理6 d后的藻液各100 mL, 5 000 r·min-1离心10 min, 收集藻细胞, 用50 mmol·L-1 PBS(pH7.5) 洗3次后, 2.5%戊二醛固定过夜, 然后进行电镜制样(由南京农业大学生物学教学实验中心完成), 并在电子透射显微镜(transmission electric microscope, TEM)下观测。对照和处理组的藻细胞培养液同时于激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)下观察。

1.3 数据分析

试验数据为3次重复平均值, 表示为平均数±标准差(SD)。采用SPSS 18.0软件对试验数据进行ANOVA方差分析。

2 结果与分析 2.1 不同发酵时间无菌滤液的抑藻活性

图 1所示:发酵24、48和72 h的短短芽孢杆菌无菌滤液按0.3%添加量处理铜绿微囊藻, 6 d后抑制率分别为54.40%、79.98%和75.53%。24 h发酵液抑藻率最低, 与其他两组有显著差异。添加量为1.0%时不同发酵时间的抑藻率差异不显著, 分别为88.95%、86.86%和85.14%。

图 1 不同发酵时间下0.3%和1.0%无菌滤液处理6 d的抑藻率 Figure 1 The inhibitory rate of 0.3% and 1.0% of cell-free filtrate at different fermentation time after 6 days′ treatment 不同小写字母表示不同处理间在0.05水平差异显著。 Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 levels in the treatments. The same as follows.
2.2 无菌滤液浓度对抑藻活性的影响

图 2可知:随处理时间延长, 各处理组抑藻率不断增加。0.3%处理组在6 d时达最大值, 为51.89%。其他3组在6 d时的抑藻率分别为79.89%、89.47%和86.94%, 之后趋于稳定, 8 d时达最大值, 分别为85.88%、93.88%和92.71%。10 d时, 各处理组抑藻率分别为50.62%、77.41%、91.90%和92.26%, 说明抑藻效果稳定。

图 2 不同添加量无菌滤液的抑藻活性 Figure 2 The inhibitory rate of different amount of cell-free filtrate on Microcysis aeruginosa
2.3 无菌滤液对铜绿微囊藻光合作用的影响

和对照相比, 处理组的最大量子产量Fv/Fm和最大电子传递速率ETRmax均有所下降(图 3)。0.3%浓度处理组Fv/Fm均略低于对照组, 1.0%处理组Fv/Fm下降极为显著, 仅为对照的35.6%。0.3%和1.0%浓度处理组ETRmax分别为对照的34.1%和18.6%。

图 3 无菌滤液对M.aeruginosa最大量子产量及最大电子传递速率的影响 Figure 3 Effect of sterilized filtrate on the photosynthetic quantum yield and the maximum electron transport rate of M.aeruginosa
2.4 无菌滤液对藻细胞结构的影响

对0.3%和1.0%无菌滤液处理6 d后的藻细胞进行电子透射显微镜观察。对照组中藻细胞圆润完整, 结构紧实, 细胞壁与细胞质紧密结合, 类囊体结构完整(图 4-A)。0.3%处理组藻细胞边缘形成空泡, 出现质壁分离(图 4-B)。1.0%处理组藻细胞严重损伤, 细胞壁、细胞膜破损, 类囊体结构断裂, 细胞结构松散, 已不具有完整的细胞形态(图 4-C)。此外, 经激光共聚焦显微镜观察发现1.0%无菌滤液处理后藻液中存在大量分裂中未完全分离的细胞, 维持在分裂末期, 呈2细胞或4细胞状态(图 5)。取对照、处理组藻液进行血球计数板显微计数, 统计1 000个藻细胞中单细胞、2细胞体和4细胞体所占比例。对照组中处于分裂末期的2细胞体所占比例为20.53%, 没有发现4细胞体。处理组中出现大量2细胞体, 所占比例高达62.23%, 4细胞体所占比例达14.95%。

图 4 无菌滤液处理前、后M.aeruginosa细胞的电子透射显微镜图 Figure 4 TEM images of the M.aeruginosa under different concentrations of filtrate A.对照Control; B.0.3%无菌滤液Treated with 0.3% of filtrate; C.1.0%无菌滤液Treated with 1.0% of filtrate. CW:细胞壁Cell wall; PM:细胞膜Plasma membrane; Thy:类囊体Thylokoid.标尺为1 μm。Bar=1 μm.
图 5 无菌滤液处理前、后M.aeruginosa细胞的激光共聚焦显微图 Figure 5 The CLSM images of M.aeruginosa cells with or without treatment A.对照Control; B.1.0%无菌滤液Treated with 1.0% of filtrate
2.5 无菌滤液中溶藻活性物质的性质 2.5.1 相对分子质量

将1.0%的无菌滤液通过超滤管(截留相对分子质量为10×103和3×103)后测定各组分的抑藻活性。大于10×103组分的抑藻率为6.47%, 相对分子质量为(3~10)×103的组分和小于3×103组分的抑藻率分别为50.50%和30.59%。超滤前所用的无菌滤液抑藻率88.32%。因此可以初步判断, 主要抑藻活性物质的相对分子质量为小于10×103的化合物。

2.5.2 对温度、pH和蛋白酶的稳定性

与对照(发酵结束后立即使用的无菌滤液)相比, 4、25和37 ℃处理后抑藻率没有显著变化。50和70 ℃处理后抑藻率显著降低, 分别为对照的79.5%和39.1%(图 6-A)。抑藻活性物质有广泛的pH适应性, 在pH值为2~12时仍保持很高的活性(图 6-B)。pH12(强碱)和pH2(强酸)处理后, 抑藻活性略有下降, 抑藻率比未处理组分别下降了9.3%和6.4%。其他处理组抑藻活性均维持在较高水平, 与未处理组间无显著差异。经胰蛋白酶和蛋白酶K处理后的无菌滤液对M.aeruginosa仍有很强的抑制作用, 抑藻率分别为90.99%和89.29%, 与未处理组没有显著差异。

图 6 无菌滤液中活性物质对温度(A)和pH(B)的稳定性 Figure 6 The stability of cell-free filtrate under different temperature(A)and pH(B)
3 讨论

细菌溶藻为生物控藻打开了一个新的局面。溶藻细菌通过直接或间接的方式抑制或杀死藻类, 溶解藻细胞。直接溶藻指细菌自身直接作用于藻细胞, 甚至进入到藻细胞内杀死藻细胞。Jung等[18]从Paldang水库中筛选出了一株荧光假单胞菌SK09, 它能通过直接溶藻的方式杀死冠盘藻。间接溶藻指通过与藻类竞争营养物质或释放溶藻活性物质杀死藻细胞, 是细菌溶藻的主要方式。目前, 已经分离和鉴定的溶藻活性物质有蛋白质、氨基酸、色素、多肽、抗生素、生物碱等[19-24]

B.brevis是一种安全菌株, 不产生毒素, 且能够产生多种抗菌物质。Che等[25]发现B.brevis FJAT-0809-GLX能够产生羟基乙酯类抗菌物质。Westman等[26]发现B.brevis Vm4能够产生具有广谱抗菌活性的伊短菌素。目前关于短短芽孢杆菌抑制蓝藻生长的研究鲜有报道。蓝藻是原始的单细胞生物, 因此推测B.brevis B15对M.aeruginosa有一定的抑制活性。本研究结果显示, B15发酵液对M.aeruginosa有良好的抑制作用, 抑藻物质存在于发酵上清液中, 为间接抑藻。抑制作用与无菌滤液添加量呈正相关:当添加量为0.3%时, 第6天抑藻率达到50%以上; 添加0.7%无菌滤液的抑制率达到80%左右; 1.0%添加量的抑藻率达90%以上; 1.0%添加量的抑藻率与2.0%相比差异不大, 这说明溶藻活性物质有一定的作用饱和浓度。

温度和酸碱度是影响微生物胞外分泌物质活性的关键因素。贾雯等[27]报道了一株侧孢芽孢杆菌能够分泌耐高温、耐酸(碱)的活性物质, 对颤藻有很好的溶解作用, 该物质经121 ℃高温处理30 min, pH2和pH12的强酸、强碱处理1 h, 依然保持较高溶藻活性。Zhang等[28]从海水中筛选出一株能够溶解粽囊藻的链霉菌JS01, 它能产生不耐高温且在pH值为3、7、8和10时不稳定的活性物质。Li等[29]报道了一株溶藻细菌LY01能够产生相对分子质量小于1×103的非蛋白类溶藻活性物质, 该物质具有很强的稳定性, 能够耐高温和强酸、强碱。本试验研究结果显示, 该株短短芽孢杆菌所产生的主要抑藻活性物质相对分子质量小于10×103, 含有一种或多种抑藻活性物质。该活性物质具有较好的pH稳定性, 在常温及37 ℃下保持较高的活性, 不易被蛋白酶水解, 溶于水而不溶于有机溶剂, 具有一定的应用前景。抑藻物质可能为对蛋白酶不敏感的肽类, 或者多糖, 需要进一步分离纯化并鉴定其成分。

叶绿素荧光是研究光合作用的探针, 可用于研究和探测植物或藻类光合生理状况及各种外界因子对其细微影响。叶绿素荧光仪检测显示:处理后藻细胞光合作用效率、最大电子传递速率均显著下降, 说明光合系统是该抑藻活性物质作用的靶标之一。透射电镜观察显示:处理后藻细胞出现细胞膜破裂, 类囊体结构降解, 这会影响藻细胞光合中心的正常运作, 进而导致藻细胞光合作用效率下降。这些无法进行正常光合作用的藻细胞不再具有生长和繁殖能力, 这可能是处理后的藻液生物量维持在较低水平的一个原因。此外, 光学显微镜和激光共聚焦显微镜观察结果显示:处理后藻细胞大多处于分裂末期, 以2细胞和4细胞体形式存在, 无法完成正常分裂过程, 这使得藻细胞的繁殖受阻。由此可以推测抑藻活性物质对藻细胞分裂的遏制是处理后的藻液生物量维持在较低水平的另一原因。

本研究证实B.brevis B15能产生抑制M.aeruginosa生长繁殖的活性物质, 添加1.0%的无菌滤液时抑藻率达90%以上。该活性物质抑制了藻细胞的光合作用和分裂繁殖, 且具有较好的稳定性。本研究结果为抑藻活性物质的分离纯化、抑藻机制的揭示奠定了基础, 从而进行新型环保抑藻剂的探索。

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