化感作用是指一种植物或微生物(供体)向环境释放某些化学物质而影响其他有机体(受体)的生长和发育的化学生态学现象, 其产生的化学物质称为化感物质^[1]。许多植物的根、茎、叶、花、花序等部位中都具有化感物质, 这些化感物质可以在一定条件下释放到环境中从而影响周围作物的生长^[2-3]。化感物质对其他植物的影响体现在一个或多个方面, 如影响种子萌发、幼苗生长以及开花与结实等, 从而对植物的生长发育产生影响^[4-5]。有研究表明, 由于药用植物体内常含有大量的次生代谢产物, 这些物质可通过分泌或雨雾淋溶等方式进入土壤, 从而引起的化感自毒作用是造成连作障碍的重要原因^[6]。目前国内已对菊花、三七、蒙古黄芪、甘草、地黄等多种药用植物的化感作用进行了研究^[7-11]。

藿香(Agastache rugosa)是唇形科藿香属植物, 广布于全国各地。在实际生产中发现, 藿香种植存在比较明显的连作障碍, 严重影响产量和品质。造成连作障碍的因素繁多, 植物化感作用中特殊形式的自毒作用是产生连作障碍的重要因素之一。本试验采用水浸提液来模拟自然条件下雨雾淋溶的化感作用方式, 研究藿香不同部位浸提液对其种子萌发及幼苗生长的化感作用, 分析藿香对其幼苗的化感效应, 以及不同部位之间化感作用的差异, 初步探讨其化感作用机制, 为生产中减轻连作障碍提供依据。

供试种子采自河南商丘, 经南京农业大学王康才教授鉴定为唇形科藿香(Agastache rugosa)的种子。藿香种植于南京农业大学温室大棚, 9月中旬盛花期采收, 作为提取水浸提液的材料, 10月底采收种子, 作为藿香种子萌发试验的材料。

采集藿香的叶、茎、根, 自然风干, 然后剪成2~3 cm的小段, 用粉碎机粉碎, 过六号筛收集粉末。分别取上述粉末适量, 按1 : 10(质量体积比)的比例用蒸馏水浸泡48 h, 间歇振荡, 过滤, 减压浓缩, 最后定容配制成质量浓度为0.100 0、0.050 0、0.025 0、0.012 5 g·mL^-1的水浸提液, 置于4 ℃冰箱待用。

取7 mL不同部位、不同质量浓度的藿香水浸提液, 分别加入铺有2层滤纸的培养皿中, 以加蒸馏水为对照。选择均匀、饱满的藿香种子播种于滤纸, 每皿100粒, 播种前用5%次氯酸钠溶液灭菌15 min, 无菌水冲洗3次。各处理3次重复。将培养皿置于温度20~22 ℃, 光照度4 000 lx条件下培养。播种次日开始, 每天记录萌发的种子数, 并及时补充等量的水浸提液或蒸馏水, 使滤纸保持湿润。第3天统计发芽势, 第7天统计发芽率, 并测量地上部长(苗长)、根长和苗鲜质量。种子发芽的标准是胚根突破种皮1~2 mm。

选长势整齐一致、4~6片真叶的幼苗移栽于塑料小花盆, 基质为蛭石, 置于南京农业大学温室大棚内, 定期浇改良Hoagland培养液, 以后每3 d浇灌1次不同浓度水浸提液, 每次20 mL。25 d后结束浇灌, 进行形态指标、生理指标测定。

参照黄玉梅等^[12]的方法测定藿香种子萌发相关指标。发芽势=(第3天正常发芽的种子数/供试种子数)×100%;发芽率=(第7天正常发芽的种子数/供试种子数)×100%;发芽指数(GI)=∑G_t/D_t; 发芽活力指数(VI)=GI×S。式中:G_t为在t日的发芽数; D_t为发芽时间; S为萌发第7天幼苗的长度。可溶性蛋白含量测定采用Bradford考马斯亮蓝G-250染色法; 根系活力测定采用TTC法; 丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法; 超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性测定分别采用氮蓝四唑(NBT)法和高锰酸钾滴定法; 过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法; 叶绿素含量采用乙醇提取分光光度法; 相对电导率测定采用电导仪法^[13]。

用Williamson等^[14]提出的化感效应指数(RI)衡量化感强度:当T≥C时, RI=1-C/T; T < C时, RI=T/C-1。式中:C为对照值, T为处理值。RI>0为促进作用, RI < 0为抑制作用, 绝对值表示化感作用强度的大小。化感综合效应(SE)为同一处理下受体植物的发芽率、发芽势、发芽指数、发芽活力指数, 根系活力, 叶绿素含量, 可溶性蛋白, 相对电导率, SOD、POD和CAT活性及MDA含量的RI的算术平均值^[15]。

采用SPSS 19.0数据处理系统对结果进行方差分析。

由表 1可知:藿香茎、叶和根水浸提液处理均使其种子的发芽率和发芽势受到抑制。与对照相比, 质量浓度为0.012 5 g·mL^-1的藿香茎和根水浸提液对其种子发芽率和发芽势均未出现显著抑制作用(P>0.05);浓度为0.025 0、0.050 0和0.100 0 g·mL^-1的藿香水浸提液对其种子发芽率和发芽势均出现显著抑制作用(P < 0.05), 且随着水浸提液浓度的增加, 其抑制作用显著增强。0.100 0 g·mL^-1的叶水浸提液处理中, 藿香种子发芽率为26.0%, 发芽势为1.0%, 抑制作用最强。

表 1 藿香不同部位水浸提液对其种子萌发的影响 Table 1 Effect of aqueous extracts from different parts of A. rugoseon on the seed germination

表选项

藿香茎、叶和根水浸提液对其种子萌发的发芽指数和发芽活力指数的影响均与发芽率和发芽势一致, 各处理间的差异性也均达到显著水平。与对照相比, 0.012 5 g·mL^-1的藿香根水浸提液对其种子发芽指数和发芽活力指数均未出现显著抑制作用; 0.025 0、0.050 0和0.100 0 g·mL^-1的藿香水浸提液对其种子发芽指数和发芽活力指数均呈显著抑制作用, 且随着水浸提液质量浓度的增加, 其抑制作用显著增强。其中, 0.100 0 g·mL^-1的叶水浸提液处理的藿香种子发芽指数为6.196, 发芽势为0.135, 抑制作用最强, 与对照相比, 分别下降了83.5%和93.7%, 达到显著水平。

由图 1可知:随着藿香水浸提液处理浓度的增加, 藿香幼苗根系活力呈先上升后下降的趋势。当质量浓度为0.012 5 g·mL^-1时, 藿香叶、茎、根水浸提液处理的幼苗根系活力均显著高于对照; 质量浓度为0.025 0 g·mL^-1时, 藿香叶水浸提液处理的幼苗根系活力与对照差异不显著, 而藿香茎和根水浸提液则对根系活力表现出显著抑制作用。当水浸提液质量浓度为0.050 0和0.100 0 g·mL^-1时, 叶、茎、根水浸提液处理均对根系活力表现出显著抑制作用, 且随着浓度的增加, 抑制作用增强。说明藿香不同部位水浸提液处理对其幼苗根系活力在低浓度下具有促进作用, 高浓度时具有明显抑制作用。

	图 1 藿香不同部位水浸提液对其幼苗根系活力的影响 Figure 1 Effect of aqueous extracts from different parts of A.rugosaon on the root activity of seedling
图选项

由表 2可知:不同质量浓度的藿香叶、根和茎水浸提液处理下, 藿香幼苗的叶绿素含量均有不同程度的下降, 且浓度越大, 下降越明显。当叶水浸提液为0.100 0 g·mL^-1时, 藿香幼苗叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和叶绿素总量分别比对照下降了33.7%、57.9%、34.5%和43.7%, 且均达到显著水平; 相同质量浓度的茎水浸提液处理, 藿香幼苗叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和叶绿素总量分别比对照下降了28.4%、47.6%、30.5%和36.3%, 且均达到显著水平。说明相同浓度的叶水浸提液比茎水浸提液处理更能降低藿香幼苗的叶绿素含量。

表 2 藿香不同部位水浸提液对其幼苗叶绿素含量的影响 Table 2 Effect of aqueous extracts from different parts of A.rugoseon on the content of chlorophyll of seedling

表选项

由图 2可知:随着藿香水浸提液处理浓度的提高, 藿香幼苗可溶性蛋白含量降低, 抑制作用增强。当水浸提液质量浓度为0.012 5 g·mL^-1时, 藿香叶水浸提液处理下其幼苗可溶性蛋白含量与对照差异不显著, 而茎和根水浸提液则对可溶性蛋白含量的抑制作用达到显著水平。当叶、根、茎水浸提液质量浓度为0.100 0 g·mL^-1时, 藿香幼苗中可溶性蛋白含量分别比对照降低了48.1%、57.3%和44.5%, 且差异显著, 不同部位之间差异也达到显著水平。

	图 2 藿香不同部位水浸提液对其幼苗可溶性蛋白含量的影响 Figure 2 Effect of aqueous extracts from different parts of A. rugose on the soluble protein content of seedling
图选项

由图 3可知:藿香幼苗叶片电导率随着水浸提液质量浓度的增加呈逐渐升高的趋势。0.012 5 g·mL^-1的茎、根水浸提液处理下, 藿香幼苗叶片相对电导率与对照间差异不显著, 而叶水浸提液处理下, 藿香幼苗叶片相对电导率比对照显著提高了4.7%。其中, 当叶、根、茎水浸提液处理浓度为0.100 0 g·mL^-1时, 相对电导率分别比对照显著提高了66.2%、57.4%和47.4%。

	图 3 藿香不同部位水浸提液对其幼苗叶片相对电导率的影响 Figure 3 Effect of aqueous extracts from different parts of A. rugose on the relative conductivity of seedling
图选项

由图 4-A可知:与对照相比, 0.012 5 g·mL^-1的茎水浸提液对其幼苗SOD活性影响不显著, 而叶和根水浸提液处理则具有显著抑制作用; 当质量浓度为0.025 0 g·mL^-1时, 藿香3个部位的水浸提液均对其幼苗SOD活性有显著抑制作用, 且随着水浸提液浓度升高抑制作用增强。与对照相比, 0.012 5 g·mL^-1的藿香叶水浸提液对其幼苗POD活性影响不显著, 而茎和根水浸提液处理则具有显著抑制作用; 当质量浓度为0.025 0 g·mL^-1时, 藿香3个部位的水浸提液均对其幼苗POD活性有显著抑制作用, 且随着水浸提液浓度升高抑制作用增强(图 4-B)。随着藿香3个部位水浸提液处理浓度的提高, 藿香幼苗CAT活性降低, 抑制作用增强(图 4-C)。

	图 4 藿香不同部位水浸提液对其幼苗SOD(A)、POD(B)、CAT(C)活性及MDA含量(D)的影响 Figure 4 Effect of aqueous extracts from different parts of A.rugosa on the activities of SOD(A), POD(B), CAT(C)and MDA content(D)of the seedling
图选项

由图 4-D可知:随着藿香3个部位水浸提液浓度的升高, 藿香幼苗的MDA含量均呈上升趋势。当质量浓度为0.012 5 g·mL^-1时, 藿香根水浸提液处理对其幼苗的MDA含量作用不显著; 随着浓度的升高, 藿香幼苗的MDA含量显著升高。当水浸提液质量浓度为0.100 0 g·mL^-1时, 各处理的MDA含量最高, 与对照间差异显著。

由表 3可知:藿香3个部位水浸提液对其发芽率、发芽势、发芽指数、发芽活力指数、根系活力、叶绿素含量、可溶性蛋白含量和SOD、POD、CAT活性的化感指数均为负值, 说明藿香不同部位水浸提液处理对其幼苗具有化感抑制作用; 而对MDA含量和叶片相对电导率的化感指数则为正值, 表现为促进作用, 并且呈明显的浓度效应, 即随着水浸提液质量浓度的升高而逐渐增强。相同质量浓度下, 藿香各部位水浸提液化感作用由强到弱依次为叶、根、茎。各部位水浸提液对藿香种子发芽率、发芽势、根系活力等的化感综合效应与单一指标一致。

表 3 藿香不同部位水浸提液对其种子萌发和幼苗生长化感作用的综合效应 Table 3 Allelopathic effect of aqueous extracts from different parts of A.rugosa on the seed germination and seedling growth

表选项

氧化性损伤可能是化感物质对受体物种的抑制作用机制之一^[16]。一般认为, 化感物质能引发植物体内活性氧的增加, 并在一定程度上影响植物体内SOD、POD和CAT等抗氧化酶的活性, 干扰植物的抗氧化代谢^[17], 最终可能导致质膜受到过氧化伤害, 影响细胞正常的结构和功能。周凯等^[18]研究结果表明, 水浸提液扦插生根根系中的超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性受到抑制, 提高了根系电导率与MDA含量。张冬雨等^[19]报道, 加拿大一枝黄花水浸提液处理小麦幼苗7 d后, 小麦叶片中SOD、POD和CAT活性均受到抑制, MDA含量显著升高, 作用强度随水浸提液质量浓度的增加而增强。本研究发现, 在藿香幼苗生长过程中, 受到不同浓度的水浸提液处理胁迫, 体内发生了抗氧化反应, 与对照相比, 藿香幼苗叶片中MDA含量和相对电导率显著增加, 可能的原因是不同浓度水浸提液处理胁迫抑制了SOD和POD等抗氧化酶活性, 导致细胞内活性氧的清除机制遭到破坏。

研究表明, 同一植物不同器官间的化感作用通常存在一定差异, 这可能与不同器官中化感物质的种类和含量有关^[20-21]。周秀梅等^[22]研究了紫苏不同部位水浸提液对木香薷种子的化感作用, 结果表明化感作用由强到弱顺序是叶片、花序、茎。葛婷婷等^[23]研究结果表明, 高粱不同部位水浸提液对小麦的化感作用不同, 其化感作用由强到弱为秆、穗、叶。鲍红春等^[24]研究了沙芥水浸提液对白菜种子萌发和幼苗生长的化感作用, 结果表明沙芥不同部位水浸提液的化感作用由强到弱表现为叶、果皮、枝条。本试验中藿香不同部位水浸提液对其种子萌发和幼苗生长的抑制程度存在一定差异, 相同质量浓度下各部位水浸提液化感作用由强到弱依次为叶、根、茎, 推测可能是因为藿香叶中化感物质含量较多。这与莫建霞等^[25]报道的藿香叶中含有较多的挥发油成分相一致。藿香挥发油是藿香主要的药效成分, 同时也是藿香重要的次生代谢产物。研究表明, 藿香体内含有胡椒酚甲醚、柠檬烯、丁香烯、异薄荷酮、长叶薄荷酮等黄酮及其苷类、萜类与齐墩果酸、乌索酸、熊果酸等多种有机酸^[26-27]。挥发油为藿香的主要药用成分, 据报道许多植物挥发油中柠檬烯、蒎烯、樟脑、长叶薄荷酮、香茅醇等能够显著抑制种子发芽和幼苗生长^[28]。藿香水浸提液对其种子萌发和幼苗生长的化感作用是否由这些物质直接或间接引起的, 尚需进一步证实。

综上, 藿香不同部位水浸提液对其种子萌发和幼苗生长表现抑制作用, 表明藿香释放的化感物质有多种途径(茎、叶、根)。本试验证实叶和根的化感作用要强于茎, 推测藿香的叶和根是其释放化感物质的主要部位, 释放的化感物质的具体成分及其相关机制尚待进一步研究。