猪肉是目前人们食用最为广泛的肉类,随着食品安全的深入推广和生活水平的不断提高,人们对猪肉的品质要求也越来越高。肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)是位于横纹肌的肌束间和肌细胞内的脂肪,其直接影响猪肉的风味和口感,在肉质评价中具有重要意义^[1-2]。目前,肌内脂肪的测定方法有多种,如大理石纹评分法、索氏抽提法、甲醇-氯仿法等;近年来还涌现出一些无损检测技术,如计算机视觉技术、近红外光谱技术、高光谱成像技术及活体超声波检测,这些方法因无损、快速等优点正逐渐被应用^[3]。根据测定方法的不同,将肌内脂肪的测定方法分为溶剂萃取和仪器估测两大类^[4]。本文使用2种传统的方法,索氏抽提法和甲醇-氯仿法对肌内脂肪含量进行测定并分析其相关性,以期探讨2种方法的准确性及优缺点。

肌内脂肪含量作为肉质评定的重要指标,其与多种肉质性状、胴体性状存在显著的相关性。研究表明,肌内脂肪含量与肉的嫩度、多汁性、适口性等肉质性状呈显著正相关^[5],与胴体质量呈显著正相关、与背膘厚呈极显著正相关^[6]。影响肌内脂肪含量的因素有性别、日龄、品种、日粮等^[7]。研究表明,使用高能低蛋白饲料能显著提高猪肌内脂肪的含量^[8],从而提高肉的品质。周小娟等^[9]的研究显示,鸡日龄越大,肌内脂肪含量越高,这表明肌内脂肪增加是一个逐渐沉积的过程。另外,品种是影响肌内脂肪含量的关键因素。大量的研究显示,中国地方猪种具有相对较高的肌内脂肪含量,且肌内脂肪含量显著高于国外猪种及杂交猪种,如莱芜猪肌内脂肪含量可达10%以上,杂交猪的肌内脂肪含量则介于地方品种和引进的瘦肉型品种之间^[10]。另外,在国外的常见猪种中,杜洛克猪的肉质好于白色猪种,且肌内脂肪含量显著高于白色猪种^[11]。肉的嫩度是指肉在咀嚼或切割时所需的剪切力,一般来说肌肉的剪切力值越小,肉越易被嚼碎,肉质越嫩;而肌纤维直径越细,系水力越强,肉质越嫩^[12]。研究表明肌内脂肪含量在2%~3%时,猪肉品质较好^[13]。尽管肌内脂肪含量与其他性状间的相关性分析已经被广泛研究,但在不同的研究结果中,由于所用品种、群体大小等的差异,其结果仍存在出入。因此,本文在比较分析了不同肌内脂肪含量测定方法的基础上,进一步对肌内脂肪含量与胴体质量、背膘厚、嫩度之间的相关性进行了研究,并使用多元逐步回归分析建立了性状间的最优回归方程,通过通径分析研究了各性状对肌内脂肪含量的影响,以剖析各性状间的真实关系。

以江苏淮安苏食肉品有限公司屠宰的279头四元(皮特兰×杜洛克×长白×大白,简称皮杜长大)商品猪为试验动物,按统一的管理水平进行饲喂,自由采食饮水。所有试验猪在170日龄左右进行屠宰测定。宰前禁食24 h,自由饮水。

胴体质量测定参考农业行业标准《NY/T 825—2004瘦肉型猪胴体性状测定技术规范》进行测定,动物处死后,煺毛,去头、蹄和内脏(保留板油和肾脏),称取两边胴体质量,沿耳根后缘及下颌第一条自然横褶切离寰枕关节去头;沿前肢断离腕掌关节,沿后肢跗关节内侧断离第一间褶关节去蹄;紧贴肛门切断尾根去尾。背膘厚用数显电子游标卡尺(LINKS/哈量-300,上海力衡仪器仪表有限公司)测定最后肋骨处的背膘厚。嫩度参考农业行业标准《NY/T 1180—2006肉嫩度的测定剪切力测定法》,取厚度约为2.54 cm的样品肉,水浴加热至肉中心温度达到75 ℃取出,自然冷却至中心温度为0~4 ℃,用直径为1.27 cm的圆形空心取样器沿肌纤维平行方向钻切肉柱10个,用肌肉嫩度计(C-LM3,北京维欣仪奥科技发展有限公司)测定每个肉柱的剪切力值。

甲醇-氯仿法简称JL法。根据文献^[14]的方法,参考《NY/T 821—2004 猪肌肉品质测定技术规范》中的规定操作。稍作如下改动:天平称量肉糜后置于研钵内,分次加入甲醇充分研磨并转入锥形瓶;浸提液过滤于刻度分液漏斗时,用20 mL甲醇、30 mL氯仿分次洗涤残渣,取下漏斗,加入40 mL蒸馏水,旋摇分液漏斗静止分层。

索式抽提法简称SS法。根据文献^[11]的方法,参考国家标准《GB/T 14772—2008 食品中粗脂肪的测定》中的规定操作,用乙醚提取待测样品中的脂肪。烘干后称量3次,直至质量恒定。

用Excel 2003进行原始数据的整理,所有统计分析采用SPSS软件(IBM SPSS Statistics 20.0) 中的相关分析法进行。利用非参数检验中的单样本K-S方法对所有表型数据进行正态分布性检验;利用双变量简单相关进行Pearson相关系数计算以及差异显著性检验。利用配对样本t检验对甲醇-氯仿法和索氏抽提法测得数据进行差异显著性检验;利用多元逐步回归分析及通径分析,建立最优回归方程。

在所测定的性状指标中,除甲醇-氯仿法测得肌内脂肪含量的样本数为92头外,其他均为279头。所测得的胴体质量、背膘厚、嫩度、索氏抽提法(SS法)测定的肌内脂肪湿含量与肌内脂肪干含量、甲醇-氯仿法(JL法)测定的肌内脂肪湿含量见表 1。该群体的平均背膘厚仅为1.77 cm,这与该商品猪的终端父本皮特兰猪有着密切关系。而2种方法测得的肌内脂肪湿含量均在2%~3%范围内,该研究结果与以前的研究报道相一致^[13]。另外,本试验所获得的该群体的肌内脂肪含量数据变异非常大,甲醇-氯仿法和索氏抽提法所测肌内脂肪湿含量的变异系数分别达到了33.14%与34.45%,而索氏抽提法所测肌内脂肪干含量的变异系数达到了31.32%,表明在这些瘦肉型商品猪群中,虽然肌内脂肪含量整体相对偏低,但由于变异非常大,在进行这些种猪的选育时仍有很大的空间来提高种猪的肌内脂肪含量,从而达到改善这些瘦肉型猪种的肉品质量的目的。除此之外,胴体质量、背膘厚、嫩度等性状的变异系数也较大,分别达到了13.46%、27.05%和26.63%。尽管如此,作为数量性状,本试验所测定的胴体质量、背膘厚、嫩度、肌内脂肪含量K-S正态性检验的概率值均大于0.05(表 1),表明所有性状均符合正态分布。

使用JL法随机测定92头试验猪只样本的肌内脂肪含量,并将相应样本SS法测得的肌内脂肪干含量、湿含量结果与之进行相关性分析。由表 2可知,JL法和SS法测得的结果之间存在极显著正相关(P<0.01) 。其中,JL法和SS法测得的肌内脂肪湿含量之间的相关系数为0.909,JL法测得的肌内脂肪湿含量和SS法测得的肌内脂肪干含量之间的相关系数为0.898,SS法测得的肌内脂肪干含量和湿含量之间的相关系数为0.996。以上结果说明各种肌内脂肪含量的测定结果两两之间均呈明显的一致性,2种方法测定的结果均能有效描述个体肌内脂肪含量的差异。

将SS与JL法测得的肌内脂肪湿含量进行差异显著性检验。检验结果如表 3所示:JL法和SS法的肌内脂肪含量测定结果之间存在显著性差异,且SS法测定结果极显著地高于JL法(P<0.01) ,因此在对同一群体进行肌内脂肪含量分析时应使用同一种方法测得的数据,以免数据交叉造成结果不准确。

肌内脂肪湿含量、干含量与胴体质量、背膘厚和肉的嫩度均存在极显著的相关性(P<0.01) ,湿含量与胴体质量、背膘厚、嫩度等性状的相关系数分别为0.228、0.241、-0.230,而肌内脂肪干含量与胴体质量、背膘厚、嫩度等性状的相关系数分别为0.213、0.227和-0.242(表 4)。总体而言,肌内脂肪含量与胴体质量、背膘厚呈极显著的正相关,即胴体质量越大、背膘越厚,肌内脂肪含量就越高;肌内脂肪含量与嫩度呈极显著的负相关,即肉越嫩,剪切力越小,肌内脂肪含量越高。另外,从表 4中还能发现,肌肉嫩度与胴体质量、背膘厚无显著相关(P>0.05) ;背膘厚除与肌内脂肪极显著相关外,与胴体质量也存在极显著的相关性(P<0.01) ,相关系数达到了0.629;肌内脂肪干含量和湿含量的相关系数为0.996(P<0.01) 。

肌内脂肪含量与胴体质量、背膘厚、嫩度均存在极显著的相关关系,因此本试验对肌内脂肪含量与其他性状间进行了多元回归分析与通径分析,建立最优回归方程。以肌内脂肪含量为因变量(Y),背膘厚(X₁)、胴体质量(X₂)、嫩度(X₃)为自变量进行多元逐步回归分析。结果表明,在该回归模型中第一步纳入X₁,剔除X₂,第二步纳入X₃,即胴体质量虽与肌内脂肪含量存在极显著相关性,但不是影响肌内脂肪含量的因素。由表 5可知,最优回归方程为Y=2.618+0.439X₁-0.016X₃,经F检验回归关系达到极显著水平(P<0.01) ;背膘厚的偏回归系数为0.232,嫩度的偏回归系数为-0.220,也都达到极显著水平(P<0.01) ;该回归方程的复相关系数R²呈较低水平,仅为0.106。

通径分析研究背膘厚、嫩度对肌内脂肪含量的影响,计算背膘厚、嫩度对肌内脂肪含量的直接作用和间接作用,分析结果如表 6所示:背膘厚对肌内脂肪含量的直接作用P_Y,1为0.232,间接作用为0.009,嫩度对肌内脂肪含量的直接作用P_Y,3为-0.220,间接作用为-0.010。结果表明,背膘厚和嫩度影响肌内脂肪含量的直接作用均大于其间接作用,这说明两者对肌内脂肪含量的影响主要是通过直接作用实现的。

在本研究中,索氏抽提法和甲醇-氯仿法测得的肌内脂肪含量间存在极显著正相关,且2种方法单样本多次重复测定结果的标准差非常小,表明2种方法都能较准确地测得肌内脂肪含量。与索氏抽提法相比,甲醇-氯仿法所需的人力物力多、操作时间长、步骤繁琐且在肉样的浸润、转移,浸提液的滴定等过程中易造成损失,因此,该方法所测定的结果相对偏小。为保证结果的准确性,甲醇-氯仿法在静置抽提过程中应轻轻旋摇锥形瓶3~4次,使肉样完全浸润,并尽量减少肉糜在壁上的附着。抽提结束后,肉糜应呈白色均匀沉于壁底。另外,如果时间允许,采用甲醇-氯仿法测定肌内脂肪含量时浸润的时间尽可能长一些,以便将肉样中的脂肪萃取完全。索氏抽提法较甲醇-氯仿法方便快捷,所需人力相对较少,但抽提所需的时间长、仪器多,测定结果易受样品制备和保存方法的影响;另外,在样品收集过程中,如果肌内脂肪含量要用湿重比值描述,在现场对样品进行抽提前处理较为麻烦,需要将绞肉机、微量称量仪器、烘箱等仪器设备带入现场。

目前,索氏抽提法测定肌内脂肪湿含量一般不在现场对鲜样进行前处理,而是低温带回实验室再进行处理。如果测定样品少,采样地点距实验室很近,对样品进行真空包装后及时带回实验室对样品进行前处理,所测定的肌内脂肪含量则能真实反映样品的肌内脂肪含量。但如果样品多,采样地点距实验室较远,将鲜样带回实验室进行前处理就必须考虑鲜肉样品成份的变化给肌内脂肪测定结果所带来的影响。相比而言,甲醇-氯仿法进行现场采样前处理相对简单,只需要对肉样进行绞碎、称量、研磨,然后加入甲醇与氯仿试剂即可完成前处理工作,后续的工作可将样品带回实验室处理。因此,若要真实准确地测定家畜动物肌内脂肪含量水平,建议采用甲醇-氯仿法进行现场鲜样处理,回实验室后优化萃取环节对肌内脂肪含量进行测定。测定的样品非常多,鲜样真空包装送回实验室后,如不能在短时间内将样品测定完,而且只要群体中个体肌内脂肪含量的一个排序,建议采用索氏抽提法测定肌内脂肪干含量来对肌内脂肪干含量进行描述。

索氏抽提法和甲醇-氯仿法都属于经典的溶剂萃取法,目前应用较多且准确性较高,但乙醚、甲醇和氯仿都会影响人体健康。因此,越来越多的新技术如计算机视觉、超声波检测等正被应用到肌内脂肪含量的测定上。王笑丹等^[15]应用计算机视觉系统对肉样图像加工处理,将其转变为二值图像,从而获得大理石花纹的百分比,说明计算机视觉能在肌内脂肪含量的测定上应用。张哲等^[16]也用相同的方法验证了计算机视觉系统在测定肌内脂肪含量上的可行性。在国外,使用超声波技术预测肌内脂肪含量的技术正被逐渐应用,Hassen等^[17]使用兽用B超仪检测牛的肌内脂肪含量且获得较好结果。Newcom等^[18]、Kim等^[19]、Bahelka等^[20]等均使用超声波技术预测家畜IMF含量,并与其他方法进行相关分析,结果发现使用超声波检测肌内脂肪含量与使用其他肌内脂肪测定方法之间存在显著的相关性。在我国,张金霜等^[21]以猪的B超图像为研究对象,根据传统方式测得的IMF反推图像参数,经检验发现两者间具有显著的相关性。尽管如此,这些新技术所获得的肌内脂肪含量的准确性与精确性仍有待进一步的提高,但从安全、环保、方便的角度来讲,这些新技术、新方法的应用定将成为必然的趋势。

本研究中肌内脂肪含量与胴体质量、背膘厚呈极显著正相关,与嫩度呈极显著负相关,该研究结果与以往的许多研究结果一致。李俊英^[22]屠宰测定210只10周龄、5个杂交组合的鸡,结果发现肌内脂肪含量与腹脂率、皮下脂厚呈显著相关,但不同杂交组合存在显著差异。朱良瑞等^[23]的研究发现,肌内脂肪含量与屠宰率呈极显著负相关且r为-0.39,与背膘厚呈极显著正相关且r为0.84。除嫩度外,肌内脂肪含量还与其他肉质性状,如瘦肉率、滴水损失、pH等存在显著的相关性。研究表明,背膘厚与瘦肉率呈显著负相关,且回归及通径分析发现其对瘦肉率的直接影响和决定系数大,是胴体瘦肉量的最主要影响因素^[24],同时肌内脂肪含量与瘦肉率呈正相关^[23]。此外,研究还发现肌内脂肪含量与肉色、大理石纹、系水力均存在相关性^[25]。滴水损失是指在不施加任何外力的条件下,肌肉蛋白质在测定时的损失量,研究表明,滴水损失与剪切力呈正相关,即滴水损失越大,剪切力越大,肉嫩度越差;肌内脂肪含量与滴水损失成负关系^[25],即肌内脂肪越高,滴水损失越小。嫩度是评价猪肉品质的另一重要指标,除研究发现其与动物的胴体性状、肉质性状显著相关外,还有研究表明嫩度与动物生长速度显著相关^[26]。由此可以看出,肌内脂肪含量与许多肉质性状存在密切关联,在不同的家畜动物、不同的品种或群体中均存在非常一致的结果。因此,使食用家畜动物保持一定的肌内脂肪含量,对改善家畜动物肉品质具有十分重要的意义。

目前针对各性状与瘦肉率之间的回归与通径分析研究较多,但针对肌内脂肪含量的回归分析较少。肌内脂肪含量与许多胴体性状、肉质性状均存在显著相关性,因此,研究多种肉质和胴体性状与肌内脂肪含量的回归关系,建立合适的回归模型,对利用其他方便测定的性状来预测肌内脂肪含量将有着重要的意义。本研究发现背膘厚和嫩度对肌内脂肪含量均存在显著影响且回归关系达到显著水平,但复相关系数较小,暗示着仍存在其他许多与肌内脂肪含量相关的影响因素。因此,在所建议的回归模型中纳入更多与肌内脂肪含量显著相关的性状指标,提高预测肌内脂肪含量结果的准确性将成为未来研究的重点。

本试验所用的试验猪为皮杜长大四元商品猪,其终端父本为皮特兰猪,皮特兰猪的特点是背膘薄,而本试验所测的该群体的平均背膘厚为1.77 cm,这与使用皮特兰猪作为终端父本有着密切关系。肌内脂肪是一个复杂性状,其含量受诸多因素的影响,其中品种是一个非常关键的因素。大量的研究结果表明,中国地方猪种的肌内脂肪含量显著高于国外猪种^[25]。本实验中使用甲醇-氯仿法和索式抽提法所测得的肌内脂肪湿含量均在2%~3%范围内,该结果符合皮杜长大四元杂交猪的基本特征。皮特兰、杜洛克、长白与大白猪是目前国内外使用最为广泛的猪种,均具有生长快、瘦肉率高的特点,但这些猪种的肌内脂肪含量相对较低^[10-25],这表明遗传因素在肌内脂肪沉积过程中起着重要作用。另外,本研究中所获得的测定数据变异系数非常大,各种方法测定的变异系数均大于30%,暗示在该商品猪群中个体间的肌内脂肪含量也存在明显的差异,其变异的遗传基础仍有待进一步的深入研究。目前,许多研究人员从群体、个体水平开展了关于影响肌内脂肪沉积功能基因的鉴定^[27-31],如刘吉英等^[32]的研究表明黑素皮质素受体4(MC 4 R)的表达水平与湖羊肌内脂肪含量呈显著的负相关,但到目前为止所鉴定的功能明确、效应显著的主效基因或标记位点仍十分有限。我们期望利用所测定的肌内脂肪含量数据,结合所收集的样品深入挖掘肌内脂肪形成关键基因,为将来利用这些主效基因或标记位点培育高肌内脂肪新品种或新品系奠定基础。