南京农业大学学报  2016, Vol. 39 Issue (6): 1037-1043   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201509004
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任志华, 夏娟, 刘欢欢, 余树民, 沈留红, 曹随忠, 左之才, 邓俊良, 马晓平
REN Zhihua, XIA Juan, LIU Huanhuan, YU Shumin, SHEN Liuhong, CAO Suizhong, ZUO Zhicai, DENG Junliang, MA Xiaoping
犬前松弛素原基因的克隆与生物信息学分析
Cloning and bioinformatics analysis of the preprorelaxin gene in bitches
南京农业大学学报, 2016, 39(6): 1037-1043
Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(6): 1037-1043.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201509004

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收稿日期: 2015-09-06
犬前松弛素原基因的克隆与生物信息学分析
任志华, 夏娟, 刘欢欢, 余树民 , 沈留红, 曹随忠, 左之才, 邓俊良, 马晓平    
四川农业大学动物医学院, 四川 成都 611130
摘要: [目的] 本试验通过对犬前松弛素原基因的分析推导获得犬松弛素基因序列,为犬松弛素多克隆抗体的制备及临床应用提供理论基础。 [方法] 以北京犬和吉娃娃新生胎盘、贵宾犬卵巢为材料,分别提取总RNA,经RT-PCR扩增,获得犬前松弛素原基因,应用生物信息学方法初步分析犬前松弛素原基因的结构及功能。 [结果] 完整克隆了从所获样品中扩增到的预期大小目的片段,包含一个534 bp的开放阅读框,编码177个氨基酸。扩增片段序列分析结果显示,与NCBI核酸数据库检索的犬前松弛素原的cDNA序列同源性为99.6%,均有3个核苷酸位点发生改变,从而引起相应氨基酸改变,但并未引起蛋白结构的变化。进化树分析结果显示,所获3条目的片段同为一支,与猫前松弛素原基因的进化距离最近。生物信息分析显示,3条序列等电点、带电荷数、最高(最低)氨基酸、消光系数、半衰期、不稳定系数均一致,相对分子质量、不稳定系数、脂肪系数、总平均疏水指数有细微差异;跨膜区、信号肽、糖基化位点分析结果一致;二级结构组成一致,包含α-螺旋、延伸链、无规则卷曲,比例存在细微差异。 [结论] 成功克隆了犬前松弛素原基因,可以生物信息学分析为基础进行犬松弛素多克隆抗体的制备。
关键词    前松弛素原基因    松弛素    生物信息学分析   
Cloning and bioinformatics analysis of the preprorelaxin gene in bitches
REN Zhihua, XIA Juan, LIU Huanhuan, YU Shumin , SHEN Liuhong, CAO Suizhong, ZUO Zhicai, DENG Junliang, MA Xiaoping    
College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
Abstract: [Objectives] The aim of our study was to know the gene sequence of relaxin gene by cloning and bioinformatics analysis of the preprorelaxin gene of canine. [Methods] This study was based on the Pekingese and the newborn Chihuahua's placenta and the Poodle ovary, total RNA was extracted and amplified by RT-PCR, and then respectively, the preprorelaxin gene was obtained, and preliminary analysis of the structure and function of the preprorelaxin gene of the dog was conducted by using bioinformatics method. [Results] Results showed that the experiment completely cloned the samples obtained from the expansion to the expected purpose fragment size, containing an open reading frame of 534 bp, encoding 177 amino acids. Sequence analysis of the amplified fragments showed that the percentage of the homology of the cDNA sequence of preprorelaxin with NCBI nucleic acid database was 99.6%, having three nucleotide site changes, so as to cause the corresponding amino acid changes, but did not cause changes in the structure of the protein. Phylogenetic tree analysis results showed that, the three target fragments were the same as one, and the evolutionary distance of the cat preprorelaxin gene was nearest. Bioinformatics analysis showed that, the 3 sequences were the same in the electric point, the charge number, the highest minimum amino acid, the extinction coefficient, the half-life and the instability coefficient. The molecular weight, the coefficient of instability, the fat coefficient, and the total average hydrophobicity index had slight differences. The crossing membrane region, signal peptide and glycosylation site analysis results were consistent. And the secondary structure was the same including a-helix, an extended chain, a non regular, and having a slight difference. [Conclusions] We successfully cloned the preprorelaxation gene of canine. And the polyclonal antibody against canine can be prepared depending on the bioinformatics analysis.
Key words: canine    preprorelaxin gene    clone    bioinformatics analysis   

松弛素(relaxin, RLX)是主要由动物卵巢和妊娠时胎盘合成分泌, 具有抑制子宫收缩, 松弛骨盆韧带和耻骨联合, 软化宫颈及产道, 刺激乳腺发育功能的重要生殖激素[1-4], 同时还具有降解胶原纤维, 扩张血管, 抗炎和促进伤口愈合等生理作用[5-7]。动物血清和/或尿液中的松弛素含量在未孕、假孕、怀孕、分娩后和流产等不同繁殖状态时存在显著差异, 正常妊娠时松弛素含量显著高于未孕、假孕、流产和分娩后; 在犬及其他一些动物, 松弛素是动物妊娠时胚胎附植和胎盘形成时特异产生的激素之一, 有报道证实分析血清或尿液中松弛素含量变化可用于犬、猫妊娠临床诊断[8-11]

前松弛素原(preprorelaxin)是组织合成的松弛素初始产物, 由信号肽、A链、连接肽和B链组成, 当其由胞浆内质网转移时通过切除信号肽转变为松弛素原(prorelaxin), 最后再被加工为松弛素。在基因克隆基础上利用生物信息学软件鉴定并预测解析相应蛋白质结构和生化特性, 是松弛素或松弛素原体外表达和功能研究的基础。Klonisch等[12]已报道犬胎盘来源的前松弛素原基因cDNA序列以及蛋白结构, 国内已有关于人、小鼠和猪等[5-7]松弛素体外表达的报道, 但还未见关于犬前松弛素原基因的研究报道。本研究以犬胎盘和卵巢为研究材料, 采用RT-PCR克隆犬前松弛素原基因cDNA并测序, 再用生物信息学软件对所获得基因序列进行比对分析并预测其编码蛋白的结构和生化特性, 进而为犬松弛素基因体外表达和功能研究提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料和主要试剂

组织样品取自四川农业大学教学动物医学行剖腹产的北京犬和吉娃娃胎盘各1个, 行阉割术的贵宾犬卵巢1个, 用RNA保存液浸泡, 液氮保存备用。

PrimeScript RT-PCR Kit、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒、Preminx、DNA内切酶XhoⅠ和BamHⅠ、质粒pMD19-T和大肠杆菌(E.coli)感受态细胞DH5α购自TaKaRa公司, T4 DNA连接酶、RNA提取试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒、HS DNA聚合酶和DNA标准品为TaKaRa公司产品, 其余试剂为国产或者进口分析纯。

引物以GenBank收录的犬前松弛素原基因cDNA序列(NM_001003132.1)为模板, 用软件Primer Premier 5.0设计, 预扩增片段长534 bp, 引物对序列为:5′-CGGGATCCATGCTGCGCTGGTTCTTG-3′, 5′-CCCAAGCTTTCAGCATCGGCTAGCAAGC-3′。引物由北京华大生物技术有限公司合成。

1.2 方法 1.2.1 犬前松弛素原基因的RT-PCR克隆

取源自北京犬和吉娃娃的胎盘, 以及贵宾犬卵巢的组织样品, 用预冷PBS (pH7.4)漂洗, 剪碎, 液氮中研磨, 随后按RNA提取试剂盒说明书操作, 最终获得组织总RNA; 取组织总RNA适量, 按PrimeScript RT-PCR Kit说明书进行反转录, 将提取的RNA转化为cDNA, cDNA保存于-20 ℃备用或立即用于PCR。

犬前松弛素原基因cDNA的PCR反应体系(25 μL)包括cDNA、引物、HS DNA聚合酶、Preminx和dd H2O。反应条件:94 ℃ 3 min; 94 ℃变性30 s, 64 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 30个循环; 72 ℃ 5 min, 4 ℃终止反应。取PCR扩增产物于1.5 g · L-1琼脂糖凝胶电泳2 h, 凝胶成像仪拍照记录PCR结果。

1.2.2 犬前松弛素原基因cDNA的序列测定

PCR扩增产物经1.5 g · L-1琼脂糖凝胶电泳分离, 切下含目的片段胶块, 按DNA纯化试剂盒说明书纯化目的片段, 将其与pMD19-T质粒载体连接, 反应体系10 μL, 包括5.0 μL DNA目的片段、0.5 μL pMD19-T、4.5 μL反应缓冲液, 16 ℃恒温水浴连接16 h; 将连接产物转化感受态细胞DH5α, 然后涂布含氨苄青霉素的LB平板, 37 ℃恒温培养18 h, 挑取白色菌落接种LB肉汤培养, 随后提取质粒DNA, 利用内切酶XhoⅠ和BamHⅠ对质粒DNA进行双酶切, 利用上述PCR反应鉴定阳性重组质粒, 命名为pMD19-T-preprorelaxin; 取阳性克隆菌落, 扩大培养并提取质粒DNA, 将重组质粒DNA送北京华大生物技术有限公司测序。每个样品所扩增DNA片段测序3次且经比对完全重复为准。

1.2.3 生物信息学分析

将所获犬前松弛素原基因cDNA序列分别录入DNAStar软件EditSeq工作区, 利用其在线程序查找开放阅读框和推导录入序列编码的氨基酸序列; 同时从GenBank下载犬(NM_001003132.1)、人(A17329.1)、猪(A06051.1)、鼠(A16585.1)、骆驼(AF254739.1)、猕猴(NM_001115126.1)、猫(NM_001009317.1)、黑猩猩(XM_001171356.4)、牛(XM_002688750.3)、斑马鱼(JN215212.1)、马(AB000201.1)的前松弛素原基因cDNA序列, 用DNAStar软件MegAlign分析核酸序列同源性, 用MEGA 4.0软件建立系统进化树, 反映不同物种前松弛素原基因的遗传距离。

利用Protparam与ProtSeale预测蛋白质理化性质与疏水性, Signal P 3.0软件预测蛋白信号肽及其切割位点, 用TMHMM Server V 2.0在线程序预测蛋白质跨膜区特性, 用DNA Star软件PROTEAN和GOR算法预测蛋白质二级结构。

2 结果与分析 2.1 犬前松弛素原基因的克隆

抽提北京犬、吉娃娃胎盘, 贵宾犬卵巢总RNA, 进行RT-PCR扩增, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳, 显示分别得到一条500 bp左右的特异条带(图 1条带1~3);回收扩增cDNA片段与质粒pMD19-T连接, 成功构建重组质粒pMD19-T-preprorelaxin(图 1条带456), 测序结果显示所扩增犬前松弛素原基因大小均为533 bp, 包括该基因完整的开放阅读框(图 2), 编码175个氨基酸(图 3), 3个样品之间以及与所报道犬前松弛素原基因cDNA (NM_001003132.1)的序列同源性为99.6%以上(图 2), 氨基酸序列同源性为99%(图 3), 说明从北京犬和吉娃娃胎盘、贵宾犬卵巢完整克隆了前松弛素原基因cDNA。

图 1 犬前松弛素原基因的克隆 Figure 1 Cloning of canine preprorelaxin gene M:DNA分子质量标准; 1~3分别为北京犬胎盘、吉娃娃胎盘、贵宾犬卵巢样品前松弛素原基因的RT-PCR电泳图; 4~6依次为北京犬胎盘、吉娃娃胎盘、贵宾犬卵巢样品前松弛素原基因cDNA重组质粒的PCR鉴定电泳图。 M:DNA Marker; Line 1-3:Indicated RT-PCR electrophoresis of canine preprorelaxin gene from Peking canine placenta, Chihuahua canine placenta and Poodle canine ovary; Line 4-6:Indicated PCR identification of the recombinant plasmids pMD19-T containing canine preprorelaxin gene cDNA fragments from Peking canine placenta, Chihuahua canine placenta and Poodle canine ovary, respectively.
图 2 犬前松弛素原基因cDNA序列同源性比较 Figure 2 Homologous comparison of canine preprorelaxin gene cDNA sequences Pekingese:北京犬; Poodle:贵宾犬; Chihuahua:吉娃娃; NM_001003132.1为GenBank收录的序列
图 3 犬前松弛素原基因cDNA推导的氨基酸序列同源性比较 Figure 3 Homologous comparison of amino acid sequences deduced from canine preprorelaxin gene cDNA
2.2 犬前松弛素原基因的生物信息学分析

核苷酸序列比对的结果如图 2所示, 所获得3个样品犬前松弛素原基因cDNA以及NM_001003132.1序列GenBank收载同源性为99.6%以上, 不同序列间第4、145、305、388和524位的核苷酸不全一致, 犬前松弛素原基因序列与家猫和猪的同源性最高, 分别为73.2%和73.4%, 而与斑马鱼、牛的同源性最低, 分别为3.9%和3.4%;同样, 遗传进化树分析(图 4)也显示本研究所用的犬与家猫较近, 说明它们的遗传距离最近, 然后依次为猪、马和骆驼, 而与牛和斑马鱼最远。

图 4 部分动物基于前松弛素原基因的系统进化树 Figure 4 Phylogenetic tree of preprorelaxin gene cDNA from partial animals

源自北京犬、吉娃娃犬、贵宾犬和NM_001003132.1序列的犬前松弛素原基因cDNA推导出的氨基酸序列如图 3所示, 其同源性为97.2%, 在第2、49、102、130和175位氨基酸不一致; 蛋白理化性质预测结果显示, 来自北京犬胎盘、吉娃娃胎盘, 贵宾犬卵巢的前松弛素原蛋白有相同的等电点、带负电氨基酸数、带正电氨基酸数、消光系数, 阳离子特征明显, 分子式和相对分子质量、不稳定系数、脂肪系数和总平均疏水指数存在细微差异, 相对分子质量为20.5×103左右(表 1); 前松弛素原蛋白相对分子质量较小, 约20×103, 呈现较强的阳离子特征, 富含精氨酸、赖氨酸。犬前松弛素原不稳定系数约62。当蛋白不稳定系数大于40时, 则该蛋白不稳定。总平均疏水性及疏水性分析结果显示:前松弛素原蛋白亲水区占据该蛋白多肽链区域略大于疏水区, 且总平均疏水指数分别为-0.504、-0.525、-0.502, 均小于0, 说明它们是水溶性蛋白。同样, 蛋白疏水性和信号肽预测结果(图 5)显示:3个样品均一致, 蛋白疏水性最大值为2.344, 最小值为-3.611, 氨基酸序列第13位氨基酸疏水性最强, 第150、151位氨基酸疏水性最弱, 1~25位氨基酸为编码蛋白质的信号肽, 切割位点为第25~26氨基酸; 蛋白质跨膜区、糖基化位点以及其二级结构预测结果也显示3个样品均一致, 即犬前松弛素原蛋白的1~177氨基酸为胞外区, 未形成跨膜结构域, 所有氨基酸都位于膜表面, 不含糖基化位点(以0.5为阈值), 主要由α螺旋、延伸链、无规则卷曲组成但其比例有细微差异, 不包含β转角(图 6表 2)。

表 1 犬前松弛素原蛋白理化性质分析 Table 1 Physical-chemical property analysis of canine preprorelaxin protein
理化指标Item 北京犬Pekingese 吉娃娃Chihuahua 贵宾犬Poodle
相对分子质量/103 Relative molecular weight 20.522 9 20.448 7 20.494 8
等电点Isoelectric point 9.07 9.07 9.07
分子式Molecular formula C902H1477N261O262S11 C895H1471N261O263S11 C900H1473N261O262S11
带负电氨基酸数The number of negatively charged amino acid 24 24 24
带正电氨基酸数The number of positively charged amino acids 30 30 30
最高氨基酸Highest amino acid Asp+Glu Asp+Glu Asp+Glu
最低氨基酸Minimum amino acid Arg+Lys Arg+Lys Arg+Lys
消光系数(280 nm)/(cm2·mol-1) Extinction coefficient 25 355 25 355 25 355
半衰期/h Half-life >30 >30 >30
不稳定系数Coefficient of instability 62.37 62.76 62.37
脂肪系数Fat coefficient 92.54 92.54 92.98
总平均疏水指数Total average hydrophobicity index -0.504 -0.525 -0.502
表 2 犬前松弛素原基因编码蛋白的二级结构预测 Table 2 Prediction for secondary structure of canine preprorelaxin gene cDNA-deduced protein %
品种Variety α螺旋Alpha helix 延伸链Extended chain β转角Beta angle 无规则卷曲Irregular curl
北京犬Pekingese 46.89 11.30 0 41.81
吉娃娃Chihuahua 46.33 11.30 0 42.37
贵宾犬Poodle 46.33 11.86 0 41.81
图 5 犬前松弛素原基因编码蛋白疏水性(A)和信号肽(B)预测 Figure 5 Prediction for hydrophobicities (A) and signal peptides (B) of canine preprorelaxin gene-encoding proteins 1.北京犬胎盘Pekingese placenta; 2.吉娃娃犬胎盘Chihuahua canine placenta; 3.贵宾犬卵巢Poodle caine ovary
图 6 犬前松弛素原基因编码跨膜区(A)和糖基化位点(B)预测 Figure 6 Prediction for transmembrance helices (A) and glycosylation sites (B) of canine preprorelaxin gene cDNA-deduced proteins
3 讨论

松弛素是一种很重要的激素, 具有复杂的生物学作用。开发具有生物活性功能的松弛素已成为近年来国内外研究的热点, 国外已有猪松弛素用于临床的报道[13-14]。为进一步研究犬前松弛素原基因表达调控和其编码蛋白的结构, 本试验对采集的北京犬、吉娃娃胎盘和贵宾犬卵巢前松弛素原基因进行了克隆和序列分析。结果显示:犬的前松弛素原基因包含534个碱基对, 为一个完整的ORF, 编码177个氨基酸。来源于3个不同个体的犬前松弛素原基因与GenBank收录的犬前松弛素原基因序列核苷酸序列同源性为99.8%, 氨基酸序列同源性为99%, 存在核苷酸和氨基酸位点的改变, 但其蛋白质的功能位点并未受到影响。位点的改变可能是受单核苷酸多样性及等位基因的影响。试验表明所克隆的来源于3个不同品种的犬前松弛素原基因序列为预期的犬前松弛素原基因序列。

按照文献[15]进行多序列比对和系统进化树分析, 结果显示, 犬前松弛素原基因编码蛋白与猫较近, 具有较高同源性, 其次与猪、骆驼和马进化树距离较近。这与已报道的犬前松弛素原基因编码蛋白与猪、马同源性高, 猫前松弛素原编码蛋白与猪、马同源性高的分析结果相同[12, 16]。Min等[17]也报道马前松弛素原的核苷酸序列与猪的同源性为75.5%, 主要区别在于C肽氨基酸的变化。

利用生物信息学分析网站NCBI对北京犬、吉娃娃、贵宾犬前松弛素原基因编码蛋白质的理化学性质、疏水性、跨膜区和二级结构进行分析, 结果表明犬前松弛素原结构性质不稳定, 半衰期较短, 为水溶性蛋白, 其二级结构使其很容易接近水分子。

预测出1~25氨基酸为信号肽段, 信号肽的剪切位点位于第25~26位氨基酸间。信号肽的功能是引导蛋白质多肽链穿过内质网进入腔内[18], 但由于它可以一直和活性蛋白结合, 干扰其正确折叠与作用, 因此必须在机体外实施切除。龚婷等[19]在鸡IL-2全基因和去信号肽基因的原核表达试验中发现, 切除信号肽序列的基因可提高其在原核细胞中的表达水平。

跨膜区预测显示, 犬前松弛素原基因编码蛋白所有氨基酸都位于膜表面, 是一种表面蛋白。本试验采用Garnier-Gibrat-Robson (GGR)法预测犬前松弛素原蛋白主要由α螺旋、伸展片段、自由卷曲组成。表明这样的空间构架在保持松弛素的综合构架, 精确的折叠方式与活力问题上能够起到关键作用。

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