文章信息
- 任志华, 夏娟, 刘欢欢, 余树民, 沈留红, 曹随忠, 左之才, 邓俊良, 马晓平
- REN Zhihua, XIA Juan, LIU Huanhuan, YU Shumin, SHEN Liuhong, CAO Suizhong, ZUO Zhicai, DENG Junliang, MA Xiaoping
- 犬前松弛素原基因的克隆与生物信息学分析
- Cloning and bioinformatics analysis of the preprorelaxin gene in bitches
- 南京农业大学学报, 2016, 39(6): 1037-1043
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(6): 1037-1043.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201509004
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文章历史
- 收稿日期: 2015-09-06
松弛素(relaxin, RLX)是主要由动物卵巢和妊娠时胎盘合成分泌, 具有抑制子宫收缩, 松弛骨盆韧带和耻骨联合, 软化宫颈及产道, 刺激乳腺发育功能的重要生殖激素[1-4], 同时还具有降解胶原纤维, 扩张血管, 抗炎和促进伤口愈合等生理作用[5-7]。动物血清和/或尿液中的松弛素含量在未孕、假孕、怀孕、分娩后和流产等不同繁殖状态时存在显著差异, 正常妊娠时松弛素含量显著高于未孕、假孕、流产和分娩后; 在犬及其他一些动物, 松弛素是动物妊娠时胚胎附植和胎盘形成时特异产生的激素之一, 有报道证实分析血清或尿液中松弛素含量变化可用于犬、猫妊娠临床诊断[8-11]。
前松弛素原(preprorelaxin)是组织合成的松弛素初始产物, 由信号肽、A链、连接肽和B链组成, 当其由胞浆内质网转移时通过切除信号肽转变为松弛素原(prorelaxin), 最后再被加工为松弛素。在基因克隆基础上利用生物信息学软件鉴定并预测解析相应蛋白质结构和生化特性, 是松弛素或松弛素原体外表达和功能研究的基础。Klonisch等[12]已报道犬胎盘来源的前松弛素原基因cDNA序列以及蛋白结构, 国内已有关于人、小鼠和猪等[5-7]松弛素体外表达的报道, 但还未见关于犬前松弛素原基因的研究报道。本研究以犬胎盘和卵巢为研究材料, 采用RT-PCR克隆犬前松弛素原基因cDNA并测序, 再用生物信息学软件对所获得基因序列进行比对分析并预测其编码蛋白的结构和生化特性, 进而为犬松弛素基因体外表达和功能研究提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料和主要试剂组织样品取自四川农业大学教学动物医学行剖腹产的北京犬和吉娃娃胎盘各1个, 行阉割术的贵宾犬卵巢1个, 用RNA保存液浸泡, 液氮保存备用。
PrimeScript RT-PCR Kit、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒、Preminx、DNA内切酶XhoⅠ和BamHⅠ、质粒pMD19-T和大肠杆菌(E.coli)感受态细胞DH5α购自TaKaRa公司, T4 DNA连接酶、RNA提取试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒、HS DNA聚合酶和DNA标准品为TaKaRa公司产品, 其余试剂为国产或者进口分析纯。
引物以GenBank收录的犬前松弛素原基因cDNA序列(NM_001003132.1)为模板, 用软件Primer Premier 5.0设计, 预扩增片段长534 bp, 引物对序列为:5′-CGGGATCCATGCTGCGCTGGTTCTTG-3′, 5′-CCCAAGCTTTCAGCATCGGCTAGCAAGC-3′。引物由北京华大生物技术有限公司合成。
1.2 方法 1.2.1 犬前松弛素原基因的RT-PCR克隆取源自北京犬和吉娃娃的胎盘, 以及贵宾犬卵巢的组织样品, 用预冷PBS (pH7.4)漂洗, 剪碎, 液氮中研磨, 随后按RNA提取试剂盒说明书操作, 最终获得组织总RNA; 取组织总RNA适量, 按PrimeScript RT-PCR Kit说明书进行反转录, 将提取的RNA转化为cDNA, cDNA保存于-20 ℃备用或立即用于PCR。
犬前松弛素原基因cDNA的PCR反应体系(25 μL)包括cDNA、引物、HS DNA聚合酶、Preminx和dd H2O。反应条件:94 ℃ 3 min; 94 ℃变性30 s, 64 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 30个循环; 72 ℃ 5 min, 4 ℃终止反应。取PCR扩增产物于1.5 g · L-1琼脂糖凝胶电泳2 h, 凝胶成像仪拍照记录PCR结果。
1.2.2 犬前松弛素原基因cDNA的序列测定PCR扩增产物经1.5 g · L-1琼脂糖凝胶电泳分离, 切下含目的片段胶块, 按DNA纯化试剂盒说明书纯化目的片段, 将其与pMD19-T质粒载体连接, 反应体系10 μL, 包括5.0 μL DNA目的片段、0.5 μL pMD19-T、4.5 μL反应缓冲液, 16 ℃恒温水浴连接16 h; 将连接产物转化感受态细胞DH5α, 然后涂布含氨苄青霉素的LB平板, 37 ℃恒温培养18 h, 挑取白色菌落接种LB肉汤培养, 随后提取质粒DNA, 利用内切酶XhoⅠ和BamHⅠ对质粒DNA进行双酶切, 利用上述PCR反应鉴定阳性重组质粒, 命名为pMD19-T-preprorelaxin; 取阳性克隆菌落, 扩大培养并提取质粒DNA, 将重组质粒DNA送北京华大生物技术有限公司测序。每个样品所扩增DNA片段测序3次且经比对完全重复为准。
1.2.3 生物信息学分析将所获犬前松弛素原基因cDNA序列分别录入DNAStar软件EditSeq工作区, 利用其在线程序查找开放阅读框和推导录入序列编码的氨基酸序列; 同时从GenBank下载犬(NM_001003132.1)、人(A17329.1)、猪(A06051.1)、鼠(A16585.1)、骆驼(AF254739.1)、猕猴(NM_001115126.1)、猫(NM_001009317.1)、黑猩猩(XM_001171356.4)、牛(XM_002688750.3)、斑马鱼(JN215212.1)、马(AB000201.1)的前松弛素原基因cDNA序列, 用DNAStar软件MegAlign分析核酸序列同源性, 用MEGA 4.0软件建立系统进化树, 反映不同物种前松弛素原基因的遗传距离。
利用Protparam与ProtSeale预测蛋白质理化性质与疏水性, Signal P 3.0软件预测蛋白信号肽及其切割位点, 用TMHMM Server V 2.0在线程序预测蛋白质跨膜区特性, 用DNA Star软件PROTEAN和GOR算法预测蛋白质二级结构。
2 结果与分析 2.1 犬前松弛素原基因的克隆抽提北京犬、吉娃娃胎盘, 贵宾犬卵巢总RNA, 进行RT-PCR扩增, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳, 显示分别得到一条500 bp左右的特异条带(图 1条带1~3);回收扩增cDNA片段与质粒pMD19-T连接, 成功构建重组质粒pMD19-T-preprorelaxin(图 1条带4、5和6), 测序结果显示所扩增犬前松弛素原基因大小均为533 bp, 包括该基因完整的开放阅读框(图 2), 编码175个氨基酸(图 3), 3个样品之间以及与所报道犬前松弛素原基因cDNA (NM_001003132.1)的序列同源性为99.6%以上(图 2), 氨基酸序列同源性为99%(图 3), 说明从北京犬和吉娃娃胎盘、贵宾犬卵巢完整克隆了前松弛素原基因cDNA。
2.2 犬前松弛素原基因的生物信息学分析核苷酸序列比对的结果如图 2所示, 所获得3个样品犬前松弛素原基因cDNA以及NM_001003132.1序列GenBank收载同源性为99.6%以上, 不同序列间第4、145、305、388和524位的核苷酸不全一致, 犬前松弛素原基因序列与家猫和猪的同源性最高, 分别为73.2%和73.4%, 而与斑马鱼、牛的同源性最低, 分别为3.9%和3.4%;同样, 遗传进化树分析(图 4)也显示本研究所用的犬与家猫较近, 说明它们的遗传距离最近, 然后依次为猪、马和骆驼, 而与牛和斑马鱼最远。
源自北京犬、吉娃娃犬、贵宾犬和NM_001003132.1序列的犬前松弛素原基因cDNA推导出的氨基酸序列如图 3所示, 其同源性为97.2%, 在第2、49、102、130和175位氨基酸不一致; 蛋白理化性质预测结果显示, 来自北京犬胎盘、吉娃娃胎盘, 贵宾犬卵巢的前松弛素原蛋白有相同的等电点、带负电氨基酸数、带正电氨基酸数、消光系数, 阳离子特征明显, 分子式和相对分子质量、不稳定系数、脂肪系数和总平均疏水指数存在细微差异, 相对分子质量为20.5×103左右(表 1); 前松弛素原蛋白相对分子质量较小, 约20×103, 呈现较强的阳离子特征, 富含精氨酸、赖氨酸。犬前松弛素原不稳定系数约62。当蛋白不稳定系数大于40时, 则该蛋白不稳定。总平均疏水性及疏水性分析结果显示:前松弛素原蛋白亲水区占据该蛋白多肽链区域略大于疏水区, 且总平均疏水指数分别为-0.504、-0.525、-0.502, 均小于0, 说明它们是水溶性蛋白。同样, 蛋白疏水性和信号肽预测结果(图 5)显示:3个样品均一致, 蛋白疏水性最大值为2.344, 最小值为-3.611, 氨基酸序列第13位氨基酸疏水性最强, 第150、151位氨基酸疏水性最弱, 1~25位氨基酸为编码蛋白质的信号肽, 切割位点为第25~26氨基酸; 蛋白质跨膜区、糖基化位点以及其二级结构预测结果也显示3个样品均一致, 即犬前松弛素原蛋白的1~177氨基酸为胞外区, 未形成跨膜结构域, 所有氨基酸都位于膜表面, 不含糖基化位点(以0.5为阈值), 主要由α螺旋、延伸链、无规则卷曲组成但其比例有细微差异, 不包含β转角(图 6和表 2)。
理化指标Item | 北京犬Pekingese | 吉娃娃Chihuahua | 贵宾犬Poodle |
相对分子质量/103 Relative molecular weight | 20.522 9 | 20.448 7 | 20.494 8 |
等电点Isoelectric point | 9.07 | 9.07 | 9.07 |
分子式Molecular formula | C902H1477N261O262S11 | C895H1471N261O263S11 | C900H1473N261O262S11 |
带负电氨基酸数The number of negatively charged amino acid | 24 | 24 | 24 |
带正电氨基酸数The number of positively charged amino acids | 30 | 30 | 30 |
最高氨基酸Highest amino acid | Asp+Glu | Asp+Glu | Asp+Glu |
最低氨基酸Minimum amino acid | Arg+Lys | Arg+Lys | Arg+Lys |
消光系数(280 nm)/(cm2·mol-1) Extinction coefficient | 25 355 | 25 355 | 25 355 |
半衰期/h Half-life | >30 | >30 | >30 |
不稳定系数Coefficient of instability | 62.37 | 62.76 | 62.37 |
脂肪系数Fat coefficient | 92.54 | 92.54 | 92.98 |
总平均疏水指数Total average hydrophobicity index | -0.504 | -0.525 | -0.502 |
品种Variety | α螺旋Alpha helix | 延伸链Extended chain | β转角Beta angle | 无规则卷曲Irregular curl |
北京犬Pekingese | 46.89 | 11.30 | 0 | 41.81 |
吉娃娃Chihuahua | 46.33 | 11.30 | 0 | 42.37 |
贵宾犬Poodle | 46.33 | 11.86 | 0 | 41.81 |
松弛素是一种很重要的激素, 具有复杂的生物学作用。开发具有生物活性功能的松弛素已成为近年来国内外研究的热点, 国外已有猪松弛素用于临床的报道[13-14]。为进一步研究犬前松弛素原基因表达调控和其编码蛋白的结构, 本试验对采集的北京犬、吉娃娃胎盘和贵宾犬卵巢前松弛素原基因进行了克隆和序列分析。结果显示:犬的前松弛素原基因包含534个碱基对, 为一个完整的ORF, 编码177个氨基酸。来源于3个不同个体的犬前松弛素原基因与GenBank收录的犬前松弛素原基因序列核苷酸序列同源性为99.8%, 氨基酸序列同源性为99%, 存在核苷酸和氨基酸位点的改变, 但其蛋白质的功能位点并未受到影响。位点的改变可能是受单核苷酸多样性及等位基因的影响。试验表明所克隆的来源于3个不同品种的犬前松弛素原基因序列为预期的犬前松弛素原基因序列。
按照文献[15]进行多序列比对和系统进化树分析, 结果显示, 犬前松弛素原基因编码蛋白与猫较近, 具有较高同源性, 其次与猪、骆驼和马进化树距离较近。这与已报道的犬前松弛素原基因编码蛋白与猪、马同源性高, 猫前松弛素原编码蛋白与猪、马同源性高的分析结果相同[12, 16]。Min等[17]也报道马前松弛素原的核苷酸序列与猪的同源性为75.5%, 主要区别在于C肽氨基酸的变化。
利用生物信息学分析网站NCBI对北京犬、吉娃娃、贵宾犬前松弛素原基因编码蛋白质的理化学性质、疏水性、跨膜区和二级结构进行分析, 结果表明犬前松弛素原结构性质不稳定, 半衰期较短, 为水溶性蛋白, 其二级结构使其很容易接近水分子。
预测出1~25氨基酸为信号肽段, 信号肽的剪切位点位于第25~26位氨基酸间。信号肽的功能是引导蛋白质多肽链穿过内质网进入腔内[18], 但由于它可以一直和活性蛋白结合, 干扰其正确折叠与作用, 因此必须在机体外实施切除。龚婷等[19]在鸡IL-2全基因和去信号肽基因的原核表达试验中发现, 切除信号肽序列的基因可提高其在原核细胞中的表达水平。
跨膜区预测显示, 犬前松弛素原基因编码蛋白所有氨基酸都位于膜表面, 是一种表面蛋白。本试验采用Garnier-Gibrat-Robson (GGR)法预测犬前松弛素原蛋白主要由α螺旋、伸展片段、自由卷曲组成。表明这样的空间构架在保持松弛素的综合构架, 精确的折叠方式与活力问题上能够起到关键作用。
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