文章信息
- 曾丹丹, 张海峰, 田擎, 许苗, 王源超, 郑小波
- ZENG Dandan, ZHANG Haifeng, TIAN Qing, XU Miao, WANG Yuanchao, ZHENG Xiaobo
- 基于环介导等温扩增技术检测黄淮地区大豆主栽品种种子携带的病原菌
- Detection of soybean seed-borne pathogens in Huang-huai area using LAMP assays
- 南京农业大学学报, 2016, 39(6): 947-953
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(6): 947-953.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201512038
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文章历史
- 收稿日期: 2015-12-30
种子携带病原菌从而传播病害是农作物生产中的重要问题[1-2], 种子携带的病原菌是许多农作物病害的重要初侵染源之一, 是作物种子贮藏期病害和田间苗期乃至生长期病害的重大隐患。种子携带的病原菌不仅引起出苗不良, 而且可引起植株整个生长发育阶段的田间病害, 导致作物减产和商品价值下降, 甚至可将病害带入无病区[3], 引起病害大范围传播。种子带菌检测是保证种子质量, 预防种传病害的重要手段。
大豆(Glycine max(L.) Merrill)是世界上主要的油料作物和饲料作物, 作为粮食和副食, 是人类植物蛋白质的主要来源, 同时还是重要的工业原料, 在农业生产上有着重要作用。我国大豆栽培有着悠久的历史, 是世界上大豆的种植大国。大豆生产具有良好的经济效益和生态效益, 然而大豆病害制约着大豆产量, 是影响大豆产量和品质的重要因素。
我国已报道有近40多种病原菌危害大豆, 其中大豆根腐病是目前比较常见, 危害大豆比较严重的大豆病害。可以侵染大豆引起根腐病的病原菌有:尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)、木贼镰孢菌(F.equiseti)、层出镰孢菌(F.proliferatum)、黄色镰孢菌(F.culmorum)、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、茄腐镰孢菌(F.solani)、三线镰孢菌(F.tricinctum)、燕麦镰孢菌(F.avenaceum)、半裸镰孢菌(F.semitecteum)、轮枝镰孢菌(F.verticillioides)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)等[4-8], 冬青丽赤壳菌(Calonectria ilicicola)引起的大豆红冠腐病对大豆的危害也相当严重[9]。此外, 大豆炭疽病是普遍发生于我国东北、华北、华东、西北、华南等大豆产区的重要病害, 黑龙江、吉林、辽宁等16个省均有发生[10]。迄今中国已报道平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)、胶孢炭疽菌(C.gloeosporioide)、辣椒炭疽病菌(C.capsici)、黑线炭疽菌(C.dematium)和毁灭炭疽菌(C.destructivum)等均可引起大豆炭疽病[11-12]。大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla)可侵染大豆根部、茎部和豆荚, 并且导致大豆种子品质降低[13]。研究发现Colletotrichum spp.、Phomopsis spp.和Fusarium spp.病原真菌既可存在大豆种子表面, 又存在于种子组织内部[14-15]; 也有报道指出大豆种子寄藏的真菌中Phomopsis spp.、Cercospora spp.、Fusarium spp.和Alternaria spp.占主导地位[16-17]。
种子带菌检测技术包括传统检测和分子生物学技术等, 即肉眼观察[18]、平板分离培养[19]、吸水纸法[20]、PCR技术(如生物-PCR[21]、实时荧光定量PCR[22]、PCR-RFLP[23])、血清学检测[24]和DNA探针技术等, 其中比较常用、检测效率较高的检测方法有吸水纸法、平板分离培养和PCR技术[25], 但是这些方法存在检测周期长、难以鉴定到种等诸多缺点。2000年, Notomi等[26]开发了环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP), 由于该技术具有特异性强、灵敏度高、反应时间短和结果可视化的优点, 已被成功地应用于病毒、细菌、真菌、寄生虫、肿瘤等的检测。
本研究应用本实验室研发的可以分别特异性检测13种大豆主要病原菌的13个LAMP检测体系, 对黄淮地区的29个大豆主栽品种进行种子带菌检测, 旨在了解黄淮地区主栽大豆品种的种子携带病原菌的状况, 为大豆种子产区间安全调运和实施播前种子处理及大豆苗期病害防控提供依据。这是运用LAMP方法检测大豆种子带菌的首次报道。
1 材料与方法 1.1 供试种子材料共29个大豆品种的种子, 供试品种名称见表 2, 由安徽省农科院黄志平、济宁市农科院李素真、徐州市农科院王幸提供。
1.2 检测的目标病原菌检测的13种目标病原菌均为大豆上的重要病原菌, 包括平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)、胶孢炭疽菌(C.gloeosporioide)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)、木贼镰孢菌(F.equiseti)、层出镰孢菌(F.proliferatum)、黄色镰孢菌(F.culmorum)、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、茄腐镰孢菌(F.solani)、大豆拟茎点种腐病菌(Phomapsis longicolla)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆炭腐病菌(Macrophomina phaseolina)、冬青丽赤壳菌(Calonectria ilicicola)和大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)。
1.3 大豆种子携带病原菌基因组的提取每个大豆品种的种子样本摇晃混匀后五点取样法选取50 g, 分别倒入250 mL三角瓶中。三角瓶内加入100 mL ddH2O, 滴加20%吐温3~5滴, 封住瓶口, 置于220 r · min-1摇床上振荡洗涤30 min。振荡洗涤后的混合液用200目钢筛过滤, 并用少量ddH2O冲洗钢筛上的大豆残渣。将收集的滤液置于6 500 r · min-1离心10 min, 弃上清液, 收集沉淀。将沉淀物置于37 ℃恒温箱中晾干。沉淀物DNA的提取采用美国MOBIO公司的土壤微生物DNA强力提取试剂盒PowerSoil® DNA Isolation Kit, 方法步骤参见说明书, 所提取的DNA样本作为LAMP检测的模板, 放置于-20 ℃保存。
1.4 大豆种子携带病原菌的LAMP检测 1.4.1 平头炭疽菌和胶孢炭疽菌的LAMP反应体系、条件与结果判定特异性检测平头炭疽菌、胶孢炭疽菌的LAMP检测方法仍采用前期建立的LAMP反应体系, 参见已公开的专利(专利受理号依次为:ZL201510031690.1、ZL201510030095.6)。LAMP反应体系为:2.5 μL 10×ThermoPol Buffer (0.1% Trion-X, 20 mmol · L-1 Tris-HCl, 10 mmol · L-1 KCl, 10 mmol · L-1(NH4)2SO4, pH8.8), 3 μL ddH2O, 4 μL MgSO4(50 mmol · L-1), 4 μL甜菜碱(5 mol · L-1), 3.5 μL dNTPs (10 mmol · L-1), 内引物FIP、BIP (20 μmol · L-1)各1 μL, 外引物F3、B3(10 μmol · L-1)各0.25 μL, 环引物LF、LB (10 μmol · L-1)各0.25 μL, 1 μL Bst DNA聚合酶(8 U · μL-1), 4 μL模板DNA。62 ℃恒温反应70 min。扩增结束后加入0.25 μL染料SYBR GreenⅠ作为反应指示剂, 肉眼观察。在常光下, 黄绿色表示检测为阳性, 即有目标病原菌存在, 橙色表示检测结果为阴性, 即未检测到目标病原菌。
1.4.2 其他11种病原菌的LAMP反应体系、条件与结果判定特异性检测大豆疫霉菌的LAMP检测方法参见Dai等[27]的方法, 黄色镰孢菌和大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测方法参见已公开的专利(专利受理号依次为:ZL201510758279.4、ZL2014107282259), 禾谷镰孢菌、茄腐镰孢菌、立枯丝核菌、大豆炭腐病菌、冬青丽赤壳菌的LAMP检测采用陆辰晨[28]筛选的特异性引物, 尖镰孢菌、木贼镰孢菌、层出镰孢菌的LAMP检测特异性引物见表 1。LAMP反应体系为:2.5 μL 10×ThermoPol Buffer (0.1% Trion-X, 20 mmol · L-1 Tris-HCl, 10 mmol · L-1 KCl, 10 mmol · L-1(NH4)2SO4, pH8.8), 4 μL MgSO4(50 mmol · L-1), 4 μL甜菜碱(5 mol · L-1), 3.5 μL dNTPs (10 mmol · L-1), 内引物FIP、BIP (20 μmol · L-1)各2 μL, 外引物F3、B3(10 μmol · L-1)各0.5 μL, 环引物LF、LB (10 μmol · L-1)各1 μL, 2 μL HNB (2.4 mmol · L-1), 1 μL Bst DNA聚合酶(8 U · μL-1), 2 μL模板DNA。62 ℃恒温反应80 min。反应结束后肉眼观察, 反应产物呈天蓝色为阳性, 呈紫色为阴性。
| 目标病原菌 Target pothogen |
引物名称 Primer name |
序列 Sequence (5′→ 3′) |
| 尖镰孢菌 F.oxysporum |
Fo-FIP Fo-BIP Fo-F3 Fo-B3 Fo-LB |
CGCCAAAGGGTAGATATGGGCTAGTTGATTATGGCTTCGGCG GGACGGCATCGCTGTGTTGGTGAAGCAGTCTCACAAACGT CTCGAAGGGTAATGGGGAGA ATTGGGATCAGGCTGTTCAA AGAGAACTACGCGTATGCCC |
| 木贼镰孢菌 F.equiseti |
Fe-FIP Fe-BIP Fe-F3 Fe-B3 Fe-LB |
CTTCGACTTCTTTGACGAATTTGGAAGCTTGGTCTAACTACTGAA CGCACCTCACCCTACTTCAACGGTGTAGATGGTGATTTCAG ACGATGTTCCTTAGCTTCTC GCGGACTTCATTTCCTAGA GGGCAACACAGGAATCGTCAAC |
| 层出镰孢菌 F.proliferatum |
Fp-FIP Fp-BIP Fp-F3 Fp-B3 Fp-LF Fp-LB |
TTGGTCTCGAGCGGGGTAGCGTCCTCTGCCCACCGATT TTGGTGGGGCATTTACCCCGCATTGAGGTTGTGGACAGGA CACTTTCCCTTCGATCGCG GCTGCTTGACACGTGACAAT CACGTTTCGAATCGCAAGTGA GCGATGGGCGTGTTTTTGC |
以1.3节提取的基因组为模板, 按照上述LAMP反应体系分别进行13种病原菌的检测, 同时以相应病原菌标准菌株的基因组为模板作为阳性对照, ddH2O为模板作为阴性对照。
1.5 大豆种子携带病原菌的分离验证为进一步验证大豆种子带菌的LAMP检测结果, 选择6个携带病原菌种类较多的品种(表 2)进行育苗并诱导其自然发病。随机取种, 以灭菌蛭石为基质, 在25 ℃温室育苗钵内育苗3 d后, 每个品种随机选取50株大豆幼苗。将每株豆苗的茎基部和根部用润湿的吸水纸包裹保湿, 再用锡箔纸包裹避光, 放置于25 ℃温室中诱导其自然发病。此后第3天至第10天, 将发病的叶片、子叶、茎和根采用组织分离法进行病菌分离[29], 即从病健交界处切取0.5 cm长宽的组织块, 再将组织块剪成病斑小块, 放入含4%的次氯酸钠水溶液中表面消毒1 min, 用无菌水清洗3次后, 在灭菌滤纸上将水吸干, 然后在无菌条件下把小块分别置于PDA培养基的平皿上, 25 ℃黑暗条件下培养3 d后, 切取菌落的尖端菌丝转入新的PDA平板培养基上纯化。通过病原菌形态观察, 初步鉴定病原菌的属。CTAB法提取病原菌纯菌丝基因组[30], 利用PCR技术扩增病原菌的核糖体内转录间隔区(ITS)基因区段, 然后经过序列比对鉴定大豆种子携带病原菌的种类。
2 结果与分析 2.1 大豆种子携带13种病原菌的LAMP检测结果应用本实验室前期研发的特异性针对13种大豆病原菌的13个LAMP检测体系, 对29个品种的大豆种子是否携带上述13种病原菌进行LAMP检测。以品种‘漯39001’种子带菌的LAMP检测结果为例, 平头炭疽菌、胶孢炭疽菌的LAMP检测以SYBR GreenⅠ为反应指示剂, 反应产物呈黄绿色为阳性, 呈橙色为阴性, 可以判断出其大豆种子携带有平头炭疽菌而不携带胶孢炭疽菌(图 1-a); 其他11种病原菌的LAMP检测以HNB为反应指示剂, 反应产物呈天蓝色为阳性, 呈紫色为阴性, 可以判断出其大豆种子携带有尖镰孢菌、木贼镰孢菌、层出镰孢菌、黄色镰孢菌和大豆拟茎点种腐病菌(图 1-b)。因此, 品种‘漯39001’的供试种子共携带6种病原菌。
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图 1 大豆携带病原菌的LAMP检测结果
Figure 1 Detection of soybean seed-borne pathogens using LAMP assays
a:1.平头炭疽菌; 2.胶孢炭疽菌; 3.阴性对照。 b:1.尖镰孢菌; 2.木贼镰孢菌; 3.层出镰孢菌; 4.黄色镰孢菌; 5.禾谷镰孢菌; 6.茄腐镰孢菌; 7.拟茎点种腐病菌; 8.立枯丝核菌; 9.大豆炭腐病菌; 10.冬青丽赤壳菌; 11.大豆疫霉菌; 12.阴性对照。 a:1.Colletotrichum truncatum; 2.C.gloeosporioide; 3.Negative control. b:1.Fusarium oxysporum; 2.F.equiseti; 3.F.proliferatum; 4.F.culmorum; 5.F.graminearum; 6.F.solani; 7.Phomapsis longicolla; 8.Rhizoctonia solani; 9.Macrophomina phaseolina; 10.Calonectria ilicicola; 11.Phytophthora sojae; 12.Negative control. |
29个大豆品种种子携带病原菌的检测结果(表 2)表明, 大豆种子带菌是普遍现象, 29个品种中有20个品种的种子样本携带上述某些病原菌, 即68.97%的品种种子带菌; 不同品种的大豆种子携带病原菌的种类与数量有较大差异, 如‘漯39001’种子携带6种病原菌, 而‘商豆1316’只携带大豆拟茎点种腐病菌1种病原菌; 在13种病原菌中, 供试种子样本共检测到7种病原菌, 其中平头炭疽菌的检出率最高, 达37.93%, 即11个品种检测到平头炭疽菌, 其次是大豆拟茎点种腐病菌, 检出率为34.48%, 再次是木贼镰孢菌、黄色镰孢菌, 检出率均为20.69%。另外尖镰孢菌、胶孢炭疽菌和层出镰孢菌的检出率依次为13.79%、10.34%和10.34%。
| 序号 No. |
大豆品种 Soybean cultivars |
检测到的病原菌 Pathogens detected |
| 1 | 商豆0812 Shangdou 0812 | Fc, Pl |
| 2 | 商豆1316 Shangdou 1316 | Pl |
| 3 | 商豆066 Shangdou 066 | - |
| 4 | 皖宿1202 Wansu 1202 | Ct, Pl |
| 5 | 鲁0305-2 Lu 0305-2 | Ct, Fc, Pl |
| 6 | 周07086-5-5-1 Zhou 07086-5-5-1 | Cg, Fe |
| 7 | 周09071-5混-5 Zhou 09071-5 hun-5 | Ct, Pl |
| 8 | 周09104-1-1 Zhou 09104-1-1 | - |
| 9 | 安豆5246 Andou 5246 | Fc |
| 10 | 安豆1311 Andou 1311 | Ct, Fe, Pl |
| 11 | 漯39001 Luo 39001 | Ct, Fo, Fe, Fp, Fc, Pl |
| 12 | WDC-8 | Ct, Fo, Fe |
| 13 | 山宁16 Shanning 16 | - |
| 14 | 山宁17 Shanning 17 | Fo |
| 15 | 菏豆12 Hedou 12 | - |
| 16 | 齐黄34 Qihuang 34 | - |
| 17 | 邯豆6号Handou 6 hao | Ct, Cg, Pl |
| 18 | 徐豆14 Xudou 14 | Ct |
| 19 | 徐豆16 Xudou 16 | Pl, Fo, Fe, Fp |
| 20 | 徐豆18 Xudou 18 | Ct, Fc |
| 21 | 徐豆20 Xudou 20 | - |
| 22 | 徐0117-46 Xu 0117-46 | Fc, Pl |
| 23 | 徐0117-49 Xu 0117-49 | Ct |
| 24 | 徐0118-9 Xu 0118-9 | Ct |
| 25 | 徐0212-6 Xu 0212-6 | - |
| 26 | 徐9302A Xu 9302A | Cg, Fe |
| 27 | 徐9418-2 Xu 9418-2 | - |
| 28 | 山宁14 Shanning 14 | Fp |
| 29 | 濮豆206 Pudou 206 | - |
| Note: Ct:Colletotrichum truncatum; Cg:C.gloeosporioide; Fo:Fusarium oxysporum; Fe:F.equiseti; Fp:F.proliferatum; Fc:F.culmorum; Pl:Phomapsis longicolla; -:none. The same as follows. | ||
选择携带病原菌种类较多的‘鲁0305-2’‘安豆1311’‘漯39001’‘WDC-8’‘邯豆6号’和‘徐豆16’等6个品种育苗, 并诱导幼苗自然发病后, 对发病组织进行病原菌的分离与鉴定, 进而验证LAMP检测方法的可靠性。结果(表 3)显示, LAMP检测方法所检测到的病原菌可以引起大豆幼苗发病, 而且病原菌分离与LAMP检测结果基本匹配。某些采用LAMP检测检出的病原菌在组织分离中未检出, 其主要原因可能是分离方法的检测灵敏度远远低于LAMP检测, 也可能是因为种子带菌量低而不足以引起大豆幼苗发病, 因而采用组织分离方法无法检出。
| 大豆品种 Soybean cultivars |
组织分离 Pathogens isolated |
LAMP检测 Pathogens detected |
| 鲁0305-2 Lu 0305-2 安豆1311 Andou 1311 漯39001 Luo 39001 WDC-8 邯豆6号Handou 6 hao 徐豆16 Xudou 16 |
Ct Ct Fo, Fp, Pl Fo, Fe Ct, Pl Fo, Fe, Pl |
Ct, Fc, Pl Ct, Fe, Pl Ct, Fo, Fe, Fp, Fc, Pl Ct, Fo, Fe Ct, Cg, Pl Fo, Fe, Fp, Pl |
快速、准确检测大豆种子携带的病原菌及其种类对进行合理的种子药剂处理, 防治种传病害有重要价值, 然而我国在大豆种子携带病原菌的快速准确检测方面的研究还较少。传统检测方法主要有肉眼观察和平板分离培养。Ahmad等[18]利用肉眼观察的方法检测大豆种子上的真菌, 但该方法对Alternaria spp.、Fusarium graminearum等病原菌的检出率较低, 且不适用于未显症的大豆种子带菌检测。平板分离培养方法具有敏感度较高和仪器设备简单等优点, 但检测所需时间长, 操作也较繁琐。在分子检测技术方面, 主要有生物-PCR、实时荧光定量PCR、PCR-RFLP、DNA探针技术、血清学检测等。基于PCR的检测技术是近年来应用较为广泛的分子技术, 但是其检测时间仍较长, 灵敏度、实用性也有待提高。DNA探针技术由于核酸探针制备较难、操作复杂、工作量大、成本高, 且可能出现重复性较差和杂交信号假阳性等原因, 不利于在实际中的应用。血清学方法也存在着假阳性和抗原不易制备等缺点。与现有的大豆种子带菌检测方法相比较, LAMP技术具有以下优点:1)特异性更强。在LAMP体系中, 有4条引物特异性识别靶标基因的6个区域; 2)灵敏度更高。LAMP技术检测灵敏度比普通PCR技术提高10~1 000倍, 本研究应用的13个LAMP检测体系的灵敏度均能达到pg级水平; 3)速度快。应用LAMP技术完成一次大豆种子带菌检测, 即从大豆种子样本基因组的提取至完成LAMP检测只需要4 h左右; 4)可一次性完成病原菌的检测和种的鉴定。本实验室研发的13个LAMP检测体系是分别特异性针对13种病原菌的, 因而病原菌的检测与种的鉴定可同步完成。
尽管本研究基本涵盖了黄淮地区大豆主要病害, 但还有一些病害如腐霉菌引起的根腐病、链格孢菌引起的叶斑病等未作检测, 而且在对自然发病的大豆幼苗病组织进行分离时, 还分离到轮枝镰孢菌、链状腐霉菌、链格孢菌等大豆病原菌, 但是由于本实验室目前已研发的LAMP技术体系数量仍然有限, 还需进一步研发其他大豆种传病原菌的LAMP检测体系, 以适应大豆种传病原菌快速检测的需求。已知种子带菌是大豆疫霉病菌远距离传播的主要途径之一, 虽然本研究所检测的29个品种的大豆种子中均未检测出该病菌, 但仍不能证明上述供试大豆种子不携带该病菌。本研究采用的大豆种子携带病原菌基因组的提取方法可能导致对大豆疫霉病菌等种子内藏病原菌的检测效果不佳, 进一步的改进可以考虑兼顾对大豆种皮基因组的检测。
本研究应用可以分别特异性检测13种大豆主要病原菌的13个LAMP检测体系, 对黄淮地区29个大豆主栽品种的种子进行了带菌检测, 对了解该地区大豆种子携带病原菌的状况有一定参考价值, 并为大豆种子带菌快速检测和鉴定提供了新的方法。
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