文章信息
- 王小青, 韩键, 文杨, 姜卫兵, 房经贵, 张斌斌, 马瑞娟
- WANG Xiaoqing, HAN Jian, WEN Yang, JIANG Weibing, FANG Jinggui, ZHANG Binbin, MA Ruijuan
- 呈色机制不同的桃叶片花色素苷积累及合成相关基因表达的季节性差异
- Seasonal difference in the expression pattern of genes related to anthocyanin accumulation and biosynthesis in leaves of peach with different coloration modes
- 南京农业大学学报, 2016, 39(6): 924-931
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(6): 924-931.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201602027
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文章历史
- 收稿日期: 2016-02-24
2. 江苏省农业科学院园艺研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室, 江苏 南京 210014
2. Institute of Horticulture, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory of Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014, China
植物叶片颜色的表现是由遗传因素和所处的环境共同作用的结果, 叶片中色素的组分、含量及在叶片中的分布变化, 形成了丰富多彩的叶片颜色。由于叶绿素、类黄酮类和类胡萝卜素类三类主要色素含量和分布不同而导致了高等植物叶片颜色表现不同。春季叶片刚刚萌发, 叶绿素合成还较少, 花色素苷在各种色素中占主导作用, 所以叶片通常呈现红色。秋季温度较低, 叶绿素净含量下降, 而类胡萝卜素类和花色素苷的稳定性较好, 所以叶片会呈现出黄色或者红色。
花色素苷属于类黄酮类色素, 是植物叶、果实和花中主要的呈色色素[1]。花色素苷是一类存在植物体内非常重要的次生代谢物质, 通过细胞质和内质网膜内合成, 然后再运输到液泡, 一般以糖苷的形式存在, 因为有吸光性而显示出蓝色、紫色、粉色及红色等[2]。葛静等[3]认为影响花色素苷生物合成的基因一般被分为调控基因和结构基因。其中结构基因是不同植物中所共有的基因, 通过编码形成的酶蛋白能够直接催化花色素苷以及其他黄酮类代谢物的生物合成; 调控基因不仅能调控其结构基因的表达, 而且还能够调控黄酮类代谢物的时空积累[4-5]。
红叶桃春季新发嫩叶颜色红艳, 但夏季高温则会有“返青”现象的出现[6-7], 叶色逐渐由红色转为绿色, 叶片中的叶绿素含量逐渐上升, 而花色素苷含量出现下降趋势。但部分早熟桃品种属于夏秋红叶型, 刚好与红叶桃呈现相反趋势; 这些早熟桃在果实采收前叶片颜色处于正常绿色, 在夏季果实采收后从新梢的叶片开始逐渐出现花色素苷的不断积累, 叶片先从叶柄、主脉开始变色并逐渐沿叶脉变成紫红色。前人的研究中也关注过这种特殊的现象[8-9], 但关于其呈色机制研究和变色过程中结构基因和调节基因表达分析研究较少。文习成[10]研究了红叶桃和早熟桃生长季中叶片4个相关基因(F3H、DFR、LDOX、UFGT)与花色素苷生物合成的关系以及该基因的时空表达, 结果表明:红叶桃叶片花色素苷积累减少时, 这4个基因的表达水平下降, 而在秋季时花色素苷开始积累, 这4个基因的表达水平又升高; 早熟桃在夏季果实采收后叶片花色素苷开始逐渐积累, 4个基因的表达水平也出现不断升高趋势。
本试验以红叶桃(Prunus persica f.atropurpruea)品种‘筑波5号’和‘洛格红叶’以及2个具有典型的夏秋红叶型的早熟桃(Prunus persica L.)品种‘早美’和‘春蕾’为试材, 以绿叶桃(Prunus persica L.)‘京蜜’作为对照, 对春、夏、秋3个不同季节中桃叶片花色素苷含量的变化和色差L*、a*、b*值的变化进行研究, 并测定、分析结构基因(CHS、CHI、F 3H、F3′H、DFR、LDOX、UFGT)和调节基因(MYB10、bHLH3、WD40、MYBPA1、MYB15、MYB16、MYB111、MYB123)的时空表达, 研究红叶桃、早熟桃以及绿叶桃的叶片中花色素苷生物合成的分子机制差异, 以期为彩叶植物叶片基因工程和叶色调控提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验材料本试验材料于2013年春(5月18日)、夏(7月16日)、秋(9月29日)三个季节在江苏省农业科学院国家果树种质南京桃资源圃中采集或者直接活体测定。选择生长良好且一致的红叶桃(‘筑波5号’和‘洛格红叶’)和早熟桃(‘早美’和‘春蕾’)成年树, 选择绿叶桃(‘京蜜’)成年树作为试验对照组, 其中每个品种选3棵植株。
选择生长良好且长势基本一致的植株, 在树冠南向正常的枝梢功能叶(从枝顶往下第5~9片叶)直接活体测定或者采用冰盒保存送回实验室进行有关生理指标测定以及冷冻保存以备基因荧光定量表达的测定。
1.1.2 生化试剂PowerScript Ⅱ TM反转录酶购自北京诺禾致源生物公司, DNA回收试剂盒、2000 Plus DNA Marker均购自TaKaRa公司, dNTP、pMD-18T、Ex-Taq酶、LA-Taq酶、DNase酶Ⅰ、DNA Marker都购自南京寿德实验器材有限公司。根据桃已登录序列, 分别使用NCBI在线(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行引物序列设计, 引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。引物序列及片段大小参考表 1。
基因 Gene | 引物对序列(5′→3′) Primer pairs sequence | 片段大小/bp Product size | 温度/℃ Temperature |
PpCHS | CATCTCCGTGAAGTTGGGCT/TAGAATTGCTGGGCCACCTG | 162 | 60.1 |
PpCHI | CCTGGCGCCTCTATCCTTTT/AGAAACGCCGTGCTTTCCTA | 159 | 59.9 |
PpF3H | TCAGAGAGGGAGAGAAGCCC/TGCAATTGTTGCTCCTTGGC | 124 | 59.7 |
PpF3′H | TTGAGTTCCGACCCGAAAGG/GTTAGCCCATCAGCCAAGGT | 196 | 59.9 |
PpDFR | GGTGAAGCATCTGCTGGAGT/TTCGTTCTCGGGGTCTTTGG | 163 | 59.0 |
PpLDOX | GCAAACAATGCTTCTGGGCA/GCCTCCCTTCTTCCAATCCC | 205 | 60.2 |
PpUFGT | GGGTCACTGTTGAGGATGGG/AAATTCTGAGCTGAGCCCCC | 163 | 60.0 |
PpMYB10 | CCAGGCAGGACTGCGAATAA/GGTCTCCCACCAATCACGTT | 204 | 60.0 |
PpbHLH3 | CAGGCGTCAGTCCAATCTGT/GGGGGCTGGTTAGTTTCTCC | 224 | 60.0 |
PpWD40 | CCAAACACGAAACCGACACC/GGGAGTTAGGGTTTGGGTGG | 185 | 59.9 |
PpMYBPA1 | ATGGGAAGGGCTCCTTGTTG/CTGCAACTCTTCCCACACCT | 161 | 59.8 |
PpMYB15 | AGGAAGCAGGAGGACTAGCA/AATGCCGCCAGATTCATCCA | 230 | 60.0 |
PpMYB16 | GCTCCAAATCAGCCCTCCTT/ACCCCACTTTTCAAGCCCAA | 198 | 60.0 |
PpMYB111 | GACGGACAACGAGGTGAAGA/GCAGCAGCAGAAACACAGTC | 141 | 59.6 |
PpMYB123 | CCCACACGCACAACAAGAAG/CTCCGAAGCTGTCGTGTCTT | 130 | 59.8 |
actin18S | TAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTG/CTAAGCGGCATAGTCCCTCTAAG | 114 | 60.0 |
取桃树冠南部外围充分接触到阳光的成熟功能叶片(一般从枝尖往下的第5~8片叶), 用冰盒保存并迅速至实验室对叶片花色素苷含量进行测定。叶片中花色素苷含量的测定按照Zapsalis等[11]的方法, 分别称取3份大约0.2 g的红叶桃叶片, 剪碎后分别用含有20 mL 0.1%(体积分数)盐酸甲醇溶液的提取液在黑暗条件下浸泡24 h, 期间可定时摇晃, 24 h后, 进行常温1 000 r ·min-1离心10 min, 然后取上清液, 用分光光度计分别测出D530和D650值。花色素苷含量计算公式为:
利用日本KONICΛ MINOLTΛ公司生产的CM-2500d型分光色差仪, 取树冠南部外围成熟功能叶片(从枝顶往下数第5~8片叶), 在光斑直径为8 mm、C/2°光源下测定叶片的a*和b*以及L*值, 每片叶片都测量叶基、叶中、叶尖3个部位, 重复3片叶, 取一叶片3个部位的平均值作为一个重复值。
1.2.3 不同季节桃叶片花色素苷生物合成相关基因荧光定量PCR参照王晨等[12]的方法, 分别提取不同季节5种桃叶片总RNA, 以P01(GACCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG)和P02(GCAGGACTGCA-GCTGACTGACTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)引物进行反转录合成cDNA。本研究参考以往实验室常用的看家基因actin 18S, 目的基因的引物以及片段大小见表 1。分别用5个桃品种叶片cDNA为模板, 使用所设计的引物进行PCR扩增, 并且把PCR扩增得到的产物进行回收并克隆, 以保证PCR引物设计的准确性。采用Eppendorf real plex2荧光定量PCR仪, 使用SYBR GreenⅠ试剂, 把5个桃品种春、夏、秋3个季节叶片的cDNA作为模板, 进行荧光定量PCR测试。扩增体系含1 μL cDNA, 上、下游引物各0.8 μL, 10 μL反应Mix, 7.4 μL ddH2O, 总体系20 μL。荧光定量PCR扩增条件为:95 ℃ 1 min; 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s, 共38个循环。试验重复3次。用2-ΔΔCT法计算相对表达量。
1.3 数据处理分析利用Excel 2003进行数据整理, SPSS 5.0软件进行差异性分析。
2 结果与分析 2.1 不同季节5个桃品种叶片花色素苷含量的变化由图 1可知:春季‘筑波5号’和‘洛格红叶’的叶片中花色素苷含量显著高于夏季, 在春季时2种红叶桃的叶片中花色素苷含量显著高于早熟桃和绿叶桃, 夏季明显下降, 秋季又显著上升; 其中‘筑波5号’和‘洛格红叶’花色素苷含量在夏季最低, 分别为1.386和0.967 mg ·g-1。早熟桃叶片中花色素苷含量在春季与绿叶桃的差异不显著, 在夏季开始大幅上升, 秋季达到最大值。整个试验过程中绿叶桃‘京蜜’叶片中花色素苷含量一直维持在极低水平。结合5个品种桃叶片颜色在不同季节的直观变化(图 2), 发现桃叶片中花色素苷含量的变化与叶片红色呈现显著相关。
2.2 不同季节5个桃品种叶片色差的变化 2.2.1 叶片色差a*值由图 3-A可知:红叶桃‘筑波5号’和‘洛格红叶’的叶片a*值在春、秋季为正值, 夏季显著下降, 处于负值, 叶片返青, ‘洛格红叶’的返青程度比‘筑波5号’大。早熟桃‘早美’和‘春蕾’叶片的a*值在春、夏、秋3个季节中与红叶桃均存在显著差异, 随着季节的推移, a*值逐渐增大, 说明早熟桃‘早美’和‘春蕾’叶片颜色随着季节的变化逐渐由绿变红。绿叶桃‘京蜜’在3个季节中叶片a*值均为负值, 且变化趋势也较小, 说明绿叶桃‘京蜜’叶片颜色一直为绿色。
2.2.2 叶片色差b*值由图 3-B可知:‘筑波5号’和‘洛格红叶’叶片的b*值表现为夏季增大秋季变小的趋势, 在夏季达到最大值。早熟桃‘早美’和‘春蕾’叶片b*值的变化趋势基本一致, 都是随着季节的变化而逐渐降低。春季时, 绿叶桃‘京蜜’叶片b*值处于最高(24.91), 然后急剧下降, 在夏季和秋季数值变化较小, 保持稳定状态。表明叶片为绿色时, 色差b*值呈现出较大值。
2.2.3 叶片色差L*值由图 4可知:5种桃叶片L*值的变化趋势和b*值变化趋势相似。其中红叶桃‘筑波5号’和‘洛格红叶’叶片的L*值表现为夏季增大秋季减少的趋势; 早熟桃‘早美’和‘春蕾’叶片L*值随着季节的变化而一直降低; 绿叶桃‘京蜜’叶片的L*值在春季较高, 而夏季和秋季数值变化较小, 保持稳定状态。
2.3 桃叶片花色素苷合成途径中结构基因和调节基因定量表达分析通过荧光定量PCR分析方法, 比较在不同季节中的待测基因与看家基因actin 18 S表达量的比值, 能直观地看出5个桃品种叶片的结构基因(图 5)和调节基因(图 6)在不同季节叶色变化过程中的相对表达量。
在春、夏、秋3个季节中, 结构基因在早熟桃和红叶桃同种类型桃叶片中表达呈现类似的趋势, 而且在不同季节之间红叶桃和早熟桃结构基因的表达水平存在显著差异, 而绿叶桃‘京蜜’的结构基因在不同季节中与红叶桃和早熟桃之间的表达水平存在显著差异。CHS、CHI、F 3′H、DFR、LDOX和UFGT基因在绿叶桃‘京蜜’叶片中春、夏、秋3个季节的表达都处于较低状态, 而F3H基因在3种类型的桃叶片中3个季节的表达都是较高水平。春季时, 红叶桃‘筑波5号’和‘洛格红叶’叶片处于红色状态, CHS、CHI、F 3′H、DFR、LDOX和UFGT基因在‘筑波5号’和‘洛格红叶’叶片表达水平较高; 随着夏季红叶桃叶片中花色素苷含量急剧下降, 这些基因表达显著下降; 秋季红叶桃叶片中花色素苷含量慢慢升高, 这些基因表达急剧升高。F 3 H基因在红叶桃‘筑波5号’和‘洛格红叶’叶片中春季表达最高, 在夏季和秋季表达降低且还处于较高水平。在春季早熟桃‘早美’和‘春蕾’叶片处于正常状态的绿色, CHS、CHI、F 3′H、DFR、LDOX和UFGT基因在早熟桃‘早美’和‘春蕾’叶片表达水平很低; 随着夏季早熟桃叶片中花色素苷含量慢慢升高, 这些基因在早熟桃叶片中表达水平显著升高; 在秋季时早熟桃叶片中花色素苷含量处于最高, 这些基因在早熟桃叶片中表达水平与夏季相当。F3H基因表达量在早熟桃品种中3个季节都处于中等水平, 保持较稳定; 在红叶桃品种中春季表达水平最高, 夏秋季节基本保持稳定。
在春、夏、秋3个季节中, MYB 10、MYBPA1、MYB16、MYB111、WD40和bHLH3基因表达水平在红叶桃‘筑波5号’和‘洛格红叶’在夏季降低, 秋季有升高的趋势, 而在早熟桃‘早美’和‘春蕾’叶片中则是一直升高的趋势。这些基因的表达水平与红叶桃、早熟桃叶片花色素苷含量变化趋势相同。其中, bHLH 3基因在早熟桃‘早美’和‘春蕾’叶片中春、夏、秋3个季节的表达有缓慢升高的趋势。而MYB 15和MYB123基因在红叶桃‘筑波5号’和‘洛格红叶’及早熟桃‘早美’和‘春蕾’叶片中的表达与红叶桃叶片中花色素苷含量积累呈相反趋势。在不同季节中转录因子的表达水平在绿叶桃‘京蜜’叶片中较为稳定。
3 讨论本研究中, 叶片色差结果显示红叶桃叶片春季红艳, 夏季褪绿, 秋季又开始变红; 早熟桃叶片春季呈现绿色, 果实采收后至秋季叶片逐渐转红, 与一些桃叶片呈色研究结果一致[10, 13]。叶片中花色素苷的含量与叶片红色表达呈正相关, 证明花色素苷含量的变化是造成不同桃叶片呈色季节变化的重要因素。雁来红秋季叶片由紫色转变为鲜红色也是由于细胞衰老、叶绿素减少, 使花色素苷的颜色显示出来的结果[14]。红叶桃叶片彩色的呈现受花色素苷和叶绿素含量的双重影响[15-16]。红叶桃和早熟桃叶片呈色春夏季节变化趋势截然相反, 表明2种桃叶片花色素苷代谢的机制存在显著差异。
花色素苷的生物合成一直受到国内外科学家们的热烈关注, 目前有关花色素苷的代谢途径已经研究得比较清楚[17-18]。在桃果实上有研究表明, 花色素苷代谢途径中结构基因的表达水平与桃果皮的红色程度有着正相关的关系[19]。本研究发现, 红叶桃和早熟桃花色素苷合成途径中的结构基因CHS、CHI、F 3′H、DFR、LDOX和UFGT表达与花色素苷含量成正比, 与花色素苷的合成密切相关。2种桃F 3′H基因表达有所差异, 在早熟桃品种中3个季节都处于中等水平, 保持较稳定; 在红叶桃品种中春季表达水平最高, 夏、秋季节基本保持稳定, 表达水平较春季显著下降, 推测F 3′H基因不是所试材料花色素苷生物合成的关键基因。
MYB、bHLH和WD40这3类转录因子在花色素苷生物合成调控进程中起主要作用[20]。大量研究结果表明, MYB转录因子参与了植物花色素苷生物合成积累的过程, 它对植物果皮、果肉、叶片和花器官等中花色素苷的形成具有重要的调控作用[18, 21-23]。桃果皮中MYB 10上调UFGT和DFR基因的表达, 但不调控LAR基因, 而MYBA 1则反向激活DFR和LAR基因, 但不激活UFGT基因[24]; MYBs的过量表达均能导致烟草和草莓花色素苷的大量积累[25]。本研究表明2种桃转录因子MYB 10、MYBPA1、MYB16、MYB111与花色素苷含量呈正比。Zhou等[13]发掘了控制观赏红叶桃叶片花色素苷着色的关键基因PpMYB 10.4, 揭示了控制植物花色素苷合成的MYB调节基因可分成2类, 分别调控叶、果花色素苷的积累, 其中将MYB 10归为控制调控果实花色素苷积累, 这与本文的结论不同, 有待进一步验证。也有研究表明R 2R3 MYB基因家族抑制花色素苷的表达, 如草莓FaMYB 1基因、红叶卷心菜BoMYB3和拟南芥AtMYB4等均抑制花色素苷的合成[26-28]。本研究也发现MYB 15和MYB123基因表达水平与2种桃花色素苷含量成反比, 反向调控花色素苷的合成。有研究表明, 多数植物花色素苷的合成是通过MYB-bHLH二元复合物或者3类转录因子相互作用形成MYB-bHLH-WD40三元复合物(MBW复合物)共同调控结构基因[29]。本研究发现, WD 40、bHLH3表达水平与红叶桃、早熟桃叶片花色素苷含量变化趋势相同, 且bHLH3基因在3类桃叶片3个季节中表达量均较高, 推测WD 40、bHLH3与MYB共同调控红叶桃、早熟桃叶片的花色素苷合成。
红叶桃是桃的变型, 与早熟桃亲缘关系很近, 但两类种质春、夏季节的叶色变化截然相反, 其分子调控机制的研究对于探索植物环境与基因互作表达的机制以及开展基因工程定向改良性状等具有重要的理论价值和现实意义。造成此差异的原因是因为两类桃本身遗传特性差异所致, 还是两类桃基因对于环境变化的不同响应所致, 抑或早熟桃采收后库源关系变化造成花色素苷合成底物的影响或是叶片类有关激素含量的变化等, 有待于今后进一步的验证。
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