CPPU对‘阳光玫瑰’葡萄品质及香气合成相关基因表达的影响

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201603020

文章信息

王继源, 冯娇, 侯旭东, 陶建敏

WANG Jiyuan, FENG Jiao, HOU Xudong, TAO Jianmin

Effects of CPPU on aroma components and biosynthetic genes expression in'Shine Muscat'grapes

南京农业大学学报, 2016, 39(6): 915-923

Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(6): 915-923.

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201603020

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收稿日期: 2016-03-11

引用本文

王继源, 冯娇, 侯旭东, 等. CPPU对‘阳光玫瑰’葡萄品质及香气合成相关基因表达的影响[J]. 南京农业大学学报, 2016, 39(6): 915-923. 复制到剪切板

WANG Jiyuan, FENG Jiao, HOU Xudong, et al. Effects of CPPU on aroma components and biosynthetic genes expression in'Shine Muscat'grapes[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(6): 915-923. DOI: 10.7685/jnau.201603020 复制到剪切板

CPPU对‘阳光玫瑰’葡萄品质及香气合成相关基因表达的影响

王继源, 冯娇, 侯旭东, 陶建敏

南京农业大学园艺学院, 江苏南京 210095

收稿日期: 2016-03-11

基金项目: 国家现代农业葡萄产业技术体系项目（CARS-30）；国家948重点项目（2016-X19）

作者简介: 王继源, 硕士研究生

通讯作者: 陶建敏, 教授, 主要从事葡萄生理栽培和分子技术的研究, E-mail:tjm266@sina.com

摘要: [目的] 研究不同质量浓度细胞分类素（CPPU）对葡萄果实香气组分及合成相关基因表达的影响，为阐明香气物质的合成提供理论依据。 [方法] 以‘阳光玫瑰’葡萄为材料，在花期时用25 mg·L^-1 GA₃处理花序，花后2周时用25 mg·L^-1 GA₃+0 mg·L^-1 CPPU处理果穗作为对照（CK），设置25 mg·L^-1 GA₃+5 mg·L^-1 CPPU（Ⅰ）、25 mg·L^-1 GA₃+10 mg·L^-1 CPPU（Ⅱ）、25 mg·L^-1 GA₃+15 mg·L^-1 CPPU（Ⅲ）3个处理，采用实时荧光定量PCR法研究香气合成相关基因脱氧木酮糖磷酸合酶基因（DXS3）、香叶基二磷酸合酶基因（GPPS）和里那醇合成酶基因（LIS）的表达变化，并利用GC-MS技术测定葡萄香气组分。 [结果] 与对照相比，处理Ⅰ和Ⅱ的果实显著增大、增重，可滴定酸含量和可溶性固形物有所下降，外观品质提高，处理Ⅲ因CPPU浓度过高而引起葡萄品质下降。与对照相比，香气种类减少，萜类物质特征香气里那醇、顺式氧化里那醇、香叶醇等相对含量降低，风味变淡，且CPPU浓度过高，不利于香气的产生。与对照相比，经不同浓度CPPU处理的果实中香气合成相关基因DXS3、GPPS、LIS表达量高峰推迟且峰值下调，浓度越高，推迟时间越久，峰值更低，基因表达受抑制，这与萜类物质相对含量降低相一致。 [结论] 25 mg·L^-1 GA₃+5 mg·L^-1 CPPU处理能够改善‘阳光玫瑰’葡萄外观品质并保证内在品质。

关键词：葡萄 GA₃ CPPU 果实品质基因表达香气

Effects of CPPU on aroma components and biosynthetic genes expression in'Shine Muscat'grapes

WANG Jiyuan, FENG Jiao, HOU Xudong, TAO Jianmin

College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Abstract: [Objectives] This paper is to investigate the effects of CPPU on aroma components and biosynthetic genes expression in'Shine Muscat'grapes, providing theoretical bases for illumination of the aroma components biosynthesis. [Methods] Taking the grape cultivar'Shine Muscat'as the material, this experiment was treated by the 25 mg·L^-1 GA₃+0 mg·L^-1 CPPU at the florescence firstly. Then it was investigated with the treatments of 25 mg·L^-1 GA₃+5 mg·L^-1 CPPU (Ⅰ), 25 mg·L^-1 GA₃+10 mg·L^-1 CPPU (Ⅱ), 25 mg·L^-1 GA₃+15 mg·L^-1 CPPU (Ⅲ), and 25 mg·L^-1 GA₃+0 mg·L^-1 CPPU was the control. The aroma component and the expression of biosynthetic genes, DXS3, GPPS and LIS, were determined by RT-PCR and GC-MS. [Results] The fruits of treatmentsⅡand Ⅱ were bigger and heavier significantly compared with the control. It was beneficial to improving the quality. The content of titrable acidity and soluble solid were decreased. Treatment Ⅲ declined the quality because of the high CPPU concentration. The CPPU treatment decreased the species of aromatic compositions, reduced the terpenoids relative content, such as linalool, cis-linaloloxide, geraniol, and weakened the flavor. The high CPPU concentration was not conducive to the production of aroma components. Compared with the control, the peaks of the expression of biosynthetic genes of DXS3, GPPS, LIS were delayed and down-regulated, and they were delayed longer and down-regulated lower with the increasing CPPU concentration. The gene expressions were suppressed. They were consistent with the decrease of the content of the terpenoids relative content. [Conclusions] It indicated that 25 mg·L^-1 GA₃+5 mg·L^-1 CPPU treatment was the best in terms of the quality of the appearance and inner.

Key words: grape GA₃ CPPU fruit quality gene expression aroma

‘阳光玫瑰’葡萄为欧美杂交种, 原产日本, 其亲本为‘安芸津21号’和‘白南’, 二倍体葡萄品种。葡萄浆果果皮为明亮的黄绿色, 肉质脆而多汁, 具有浓郁的玫瑰香味, 果汁可溶性固形物含量为20%左右, 鲜食风味佳, 成熟期较晚, 挂果期长, 成熟后可挂果2~3个月^[1]。因其果实品质好, 易于栽培, 近年来种植面积逐渐增加。

GA₃和细胞分类素(CPPU)作为植物生长调节剂广泛用于葡萄的生产栽培。GA₃能够促进种子萌发、细胞伸长、预防落花落果、提高光合作用等; CPPU能够促进细胞分裂、诱导愈伤组织生长、细胞扩大、延缓衰老等作用, 因而能够增加产量, 提高葡萄的商品性^[2-3]。葡萄商品性评价包括外观、风味及市场适应性等。GA₃和CPPU的使用, 对于葡萄外观品质的改善是显而易见的, 同时对于葡萄风味也有一定的影响, 这方面的研究在国内鲜有报道。果实的风味物质由呈香和呈味物质组成, 包括糖、酸、酚及芳香性物质等。香气是葡萄的重要感官指标之一。香气的种类和含量决定着葡萄的风味和品种典型性^[4]。葡萄香气种类多, 主要有萜烯类、C₁₃-降异戊二稀及其衍生物、甲氧基吡嗪、硫醇化合物等^[5], 以游离态和糖苷结合态形式存在。葡萄玫瑰香味中香气成分最多的是单萜类物质, 主要呈香物质是里那醇和香叶醇^[6-7]。本试验用GA₃和CPPU处理葡萄果穗, 研究‘阳光玫瑰’果实中单萜生物合成途径中关键酶基因的转录情况和香气组分的变化, 以期为揭示香气物质合成的调控机制提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

试验于2015年4-10月在南京农业大学汤山葡萄试验基地进行。平棚架“H”型整形, 避雨栽培, 行株距为6.0 m×3.0 m, 南北方向。以6年生‘阳光玫瑰’葡萄(嫁接)为试验材料, 选取长势一致的植株, 每处理3棵, 挂牌标记, 田间土肥水及病虫害防治同常规管理。处理前修剪花序, 序尖留约4 cm, 于5月16日盛花期花序用25 mg ·L^-1 GA₃浸泡5 s, 2周后用25 mg ·L^-1 GA₃分别与0、5(Ⅰ)、10(Ⅱ)、15 mg ·L^-1 CPPU (Ⅲ)组合再次浸泡5 s, 每处理3棵树, 单株为1次重复, 其中对照(CK)为25 mg ·L^-1 GA₃+0 mg ·L^-1 CPPU处理。

1.2 方法 1.2.1 样品采集

从7月25日转色期开始, 每隔10 d取1次样, 共取6次, 从3个生物学重复的植株上随机采集, 取样时兼顾阴阳两面, 从20串果穗的上、中、下随机采集50~60粒, 每株为1个重复, 共3个重复, 采样后立即放入冰盒, 带回实验室进行荧光定量试验。9月5日, 果实成熟时, 采取检测其香气物质。

1.2.2 果实品质分析

采集的浆果首先用电子游标卡尺测量果实纵横径, 用电子天平称果实单果质量(精度0.01 g), 选取10粒浆果用RA-250手持式糖度计测定可溶性固形物含量, 10粒浆果用酸碱中和滴定法测可滴定酸含量, 20粒浆果用于RT-PCR分析, 最后20粒左右用GC-MS法检测香气物质。

1.2.3 果实芳香化合物测定

所用仪器:Trace GC-MS联用仪(Finnigam, USA), 50/30 μm PDMS/DVB/CAR SPME萃取头(Supelco, USA), 固相微萃取手柄(Supelco, USA), PC-420D数字型磁力加热搅拌装置(Corning, USA)。试剂:3-辛醇标准品, NaCl。

挥发性成分的提取:将每一份葡萄果实样品进行清洗、破碎、榨汁、离心, 取澄清液8 mL置于15 mL顶空瓶中, 加入磁力搅拌子、3.0 g NaCl和5 μL 818 mg ·L^-1的3-辛醇(内标), 加盖密封。在50 ℃下水浴30 min, 然后置于磁力搅拌器上, 插入萃取头, 于50 ℃吸附40 min, 磁力搅拌子转速为950 r ·min^-1。吸附后, 萃取头转移至220 ℃的气相色谱进样口中以无分流方式热解析2 min进行分析。

程序条件:采用J & W122-4732DB-17ms (30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱, 升温程序为:40 ℃保持5 min; 然后以2 ℃ ·min^-1升至70 ℃, 保持2 min; 以3 ℃ ·min^-1升至120 ℃, 再以5 ℃ ·min^-1升至150 ℃, 最后以10 ℃ ·min^-1升至220 ℃, 保持2 min。转移线温度为280 ℃。质谱检测器采用EI模式, 电压为70 eV; 离子源温度为230 ℃; 扫描速率为2.88 scan ·s^-1; 质谱检测范围为m/z 29~540, 载气为氦气, 流速为1.0 mL ·min^-1。

1.2.4 总RNA的提取和荧光定量PCR

采用RNA提取试剂盒(Foregene)提取果实总RNA, 以总RNA为模板利用TaKaRa Prime Script^TMRT-PCR试剂盒反转录合成cDNA。用仪器ABI 7300进行荧光定量RT-PCR, 以EFl-a、Ubiquitin为内参基因, 萜类生物合成途径中的3个关键酶基因的引物参照文献[8], 表 1中引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。20 μL反应体系为:SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)10 μL, 上、下游引物各0.4 μL, 稀释10倍的cDNA 1 μL和去离子水8.2 μL。反应程序:95 ℃ 4 min; 95 ℃ 20 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 40 s, 40个循环。计算公式为X=2^-ΔΔC_T, ΔC_T=C_T(目的基因)-C_T(内参基因)。

表 1 荧光定量PCR引物序列 Table 1 The primers for qRT-PCR

基因名称Gene name	基因功能Gene function	引物序列Primer sequence
DXS3	代谢途径前期基因Gene in the early pathway	F:GAAGGCTCTGTTGGAGGGTTT R:TCCTCTGGTGATGCCTGTTCT
GPPS	代谢途径中期基因Gene in the middle pathway	F:AGAATCTGGGATTGGCATTCC R:TGGCGGATGTCAGACAATGA
LIS	代谢途径晚期基因Gene in the late pathway	F:TGGGATTCTCTCCTGCCTTTT R:GCAGTAGGCACAAGCACAACA
Efla	内参基因Reference gene	F:GAACTGGGTGCTTGATAGGC R:AACCAAAATATCCGGAGTAAAAGA
Ubiquitin	内参基因Reference gene	F:GTGGTATTATTGAGCCATCCTT R:AACCTCCAATCCAGTCATCTAC

表选项

1.3 数据处理

质谱图采用标准谱库NIST/WILEY和相关文献搜索, 用峰面积归一法定量, 所测物质为3-辛醇的相对含量。数据采用Excel 2013和SPSS 17.0软件进行统计分析。

2 结果与分析 2.1 GA₃配合不同浓度CPPU处理对果实品质的影响

由表 2可知:GA₃配合CPPU处理的果实显著增大、增重, 其中处理Ⅰ和Ⅱ的增幅较大, 处理Ⅲ的次之。对照果实的可溶性固形物含量显著高于其他处理, 其酸度和处理Ⅲ没有显著性差异, 且显著高于处理Ⅰ和Ⅱ。以上结果表明, GA₃配合不同浓度的CPPU处理对果实品质有显著影响, 在适宜的浓度内, 提高了果实的品质, 处理Ⅰ和Ⅱ果实的品质较好, 而CPPU浓度过高, 则使果实品质有所下降。

表 2 GA₃配合不同浓度CPPU处理对成熟期‘阳光玫瑰’果实品质的影响 Table 2 Effects of GA₃with different CPPU concentration treatments on fruit quality of 'Shine Muscat'grapes in the maturation stage

处理 Treatments	果实纵径/mm Longitudinal diameter	果实横径/mm Transverse diameter	单果质量/g Average berry mass	可滴定酸含量/(mg·L^-1) Titrable acidity content	可溶性固形物含量/% Soluble solid content
CK	28.68±0.11^c	20.34±0.42^b	8.44±0.44^b	0.23±0.05^a	26.50±0.28^a
Ⅰ	34.15±0.42^a	24.18±0.68^a	12.03±0.72^a	0.18±0.07^b	24.65±0.37^b
Ⅱ	34.32±0.64^a	23.53±0.82^a	12.16±0.61^a	0.19±0.11^b	23.43±0.34^b
Ⅲ	31.79±0.21^b	21.59±0.13^b	11.12±0.87^a	0.21±0.02^a	22.85±0.40^c
注: 1) CK:25 mg · L^-1 GA₃+0 mg · L^-1 CPPU; Ⅰ:25 mg · L^-1 GA₃+5 mg · L^-1 CPPU; Ⅱ:25 mg · L^-1 GA₃+10 mg · L^-1 CPPU; Ⅲ:25 mg · L^-1 GA₃+15 mg · L^-1 CPPU; 2)不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。Values followed by different small letters are significantly different among treatments at 0.05 level. The same as follows.

表选项

2.2 GA₃配合不同浓度CPPU处理对葡萄果实香气成分的影响 2.2.1 果实香气成分种类比较

葡萄果实香气成分主要是醇、醛、酮、酯、烯烃、烷烃、酚类化合物和其他八大类。由表 3可知:经过处理的葡萄果实香气成分种类减少, 3个处理间种类总数没有明显差异。与对照相比, 处理Ⅱ果实中香气成分中醇类、烷烃类和其他类分别减少了1、3、2种, 酮类和酚类化合物都增加了1种, 其余种类与之相同, 香气成分种类比对照少了4种; 处理Ⅱ的醇类、酯类和其他类分别比对照减少了3、1、3种, 醛类、烯烃类和酚类化合物分别比对照增加了2、1、1种, 其余种类与之相同, 香气成分种类比CK少了3种; 处理Ⅲ的醇类、醛类、酯类、烷烃类和其他类分别比对照减少了4、1、2、1、2种, 烯烃类比对照增加了4种, 其余种类与之相同, 香气成分种类比对照少了4种。

表 3 GA₃配合不同浓度CPPU处理果实香气成分的种类 Table 3 Species of aromatic compositions detected in GA₃ with different CPPU concentration treatments

处理 Treatments	醇 Alcohol	醛 Aldehyde	酮 Ketone	酯 Ester	烯烃 Alkenes	烷烃 Alkanes	酚类化合物 Phenolic compounds	其他 Others	总计 Total
CK	14	6	1	3	0	9	1	3	37
Ⅰ	13	6	2	3	0	6	2	1	33
Ⅱ	11	8	1	2	1	9	2	0	34
Ⅲ	10	5	1	1	4	8	1	1	32

表选项

由表 4可知:醇类是‘阳光玫瑰’葡萄果实中主要的香气成分, 其次为醛类。与对照相比, 处理Ⅰ的果实香气成分种类相对含量中醇类、酯类、烷烃类和其他类分别减少了4.77%、0.08%、0.32%、0.22%, 醛类、酮类和酚类化合物分别增加了4.97%、0.24%、0.13%, 均未检测到烯烃类物质。处理Ⅱ中醇类、酮类、酯类、烯烃类、酚类化合物和其他类分别比对照减少了6.90%、0.05%、0.04%、0.35%、0.46%、0.23%, 醛类和烯烃类分别增加了7.70%、0.02%。与对照相比, 处理Ⅲ中醇类、酮类、酯类、酚类化合物和其他类分别减少了11.56%、0.06%、0.39%、0.59%、0.22%, 醛类、烯烃类和烷烃类分别增加了12.64%、0.13%、0.04%。

表 4 GA₃配合不同浓度CPPU处理果实香气成分种类相对含量 Table 4 Species and relative content of aromatic compositions detected in GA₃ with different CPPU concentration

%
处理 Treatments	醇 Alcohol	醛 Aldehyde	酮 Ketone	酯 Ester	烯烃 Alkenes	烷烃 Alkanes	酚类化合物 Phenolic compounds	其他 Others	总计 Total
CK	64.16	33.57	0.08	0.42	0.00	0.46	1.08	0.23	100.00
Ⅰ	59.39	38.54	0.32	0.34	0.00	0.14	1.21	0.01	99.95
Ⅱ	57.26	41.27	0.03	0.38	0.02	0.11	0.62	0.00	99.69
Ⅲ	52.60	46.21	0.02	0.03	0.13	0.50	0.49	0.01	99.99

表选项

2.2.2 果实中醇类物质组分分析

由表 5可知:醇类物质是‘阳光玫瑰’果实中主要的芳香化合物, 其中含量丰富的单萜醇有5种, 具有玫瑰木香气的里那醇含量最高。不同处理中, 对照的里那醇含量最高, 最低的为处理Ⅲ。同时, 对照的果实中含有较高相对含量的有花香的顺式氧化里那醇、α-萜品醇和玫瑰花香气的香叶醇, 其相对含量分别为0.38%、0.42%、0.12%。具有青甜的橙花和玫瑰花香气的橙花醇的相对含量在4个处理中无显著差异。除萜烯醇类化合物外, 具有青草味的己醇也有较高的相对含量, 其中以处理Ⅲ果实中含量最高。此外, 在成熟葡萄果实中, 乙醇相对含量相当高, 且随CPPU浓度升高有降低的趋势, 具有“酒化”的效应。

表 5 GA₃配合不同浓度CPPU处理果实中主要醇类香气成分 Table 5 The content of the main alcohol aromatic compositions in GA₃ with different CPPU concentration treatments

化合物种类 Compound	化合物名称 Compound name	分子式 Molecular formula	相对含量/% Relative content
化合物种类 Compound	化合物名称 Compound name	分子式 Molecular formula	CK	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ
醇Alcohol	乙醇Ethanol	C₂H₆O	40.12^a	34.65^b	29.34^c	23.82^d
	己醇Hexanol	C₆H₁₂O	6.31^c	12.94^b	17.42^a	19.32^a
	1-癸醇1-decanol	C₁₀H₂₂O	-	0.06^a	0.04^a	-
	2-癸醇2-decanol	C₁₀H₂₂O	0.51^a	0.44^a	0.27^b	0.40^a
	顺-α, α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇 cis-5-ethenyltetrahydro-alpha, alpha-5-trimethyl-2-furanmethanol	C₁₀H₁₈O₂	0.23^a	0.20^a	0.11^d	0.16^c
	2, 2, 6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-呋喃-3-醇 Ltetrahydro-2, 2, 6-etheny-6-vinyl-2H-pyran-3-ol	C₁₀H₁₈O₂	0.40^a	0.21^b	0.20^b	0.38^a
	异辛醇2-ethyl-1-hexanol	C₈H₁₈O	0.34^a	0.01^b	-	-
	1-辛烯-3-醇1-oten-3-ol	C₈H₁₆O	-	0.10	-	-
	十二醇1-dodecanol	C₁₂H₂₆O	0.05	-	-	-
	1-二十醇1-eicosanol	C₂₀H₄₂O	0.01	-	-	-
	正十八醇1-octadecanol	C₁₈H₃₈O	0.40	-	-	-
单萜醇	里那醇Linalool	C₁₀H₁₈O	14.78^a	10.05^b	9.30^b	7.85^c
Monoterpene	顺式氧化里那醇cis-linaloloxide	C₁₀H₁₈O₂	0.38^a	0.19^c	0.16^c	0.25^b
Alcohols	α-萜品醇α-terpinenol	C₁₀H₁₈O	0.42^a	0.45^a	0.30^b	0.33^b
	香叶醇Geraniol	C₁₀H₁₈O	0.12^a	0.02^b	0.07^b	0.04^b
	橙花醇cis-geraniol	C₁₀H₁₈O	0.05^a	0.03^a	0.05^a	0.05^a
注:同行数据中不同字母表示差异显著(P < 0.05)。“-”表示未检测到。 Note:Different letters within the same row indicate significant difference at 5% level.“-”indicates not detected. The same as follows.

表选项

2.2.3 果实中醛类物质组分分析

由表 6可知:醛类物质为‘阳光玫瑰’果实中第二大类芳香物质, 其中具有绿叶清香和果香的2-己烯醛的相对含量最高, 处理Ⅲ的最高, 对照最低。具有青香和果香的2, 4-己二烯醛在对照果实中含量最高, 其他处理的果实相对含量降低, 且处理间无显著差异。对照和处理Ⅰ果实中具有花香的苯乙醛和具有甜香、柑橘香、花香的癸醛相对含量无显著差异, 但均高于处理Ⅱ和Ⅲ。壬醛和十八醛为对照所独有的香气成分, 十二醛为处理Ⅰ果实独有的香气成分, 十五醛、金合欢基乙醛和十四烷醛为处理Ⅱ果实独有的香气成分。

表 6 GA₃配合不同浓度CPPU处理果实中主要醛类香气成分 Table 6 The content of the main aldehyde aromatic compositions in GA₃ with different CPPU concentration treatments

化合物种类 Compound	化合物名称 Compound name	分子式 Molecular formula	相对含量/% Relative content
化合物种类 Compound	化合物名称 Compound name	分子式 Molecular formula	CK	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ
醛Aldehyde	2-己烯醛(E)-2-hexenal	C₆H₁₀O	31.71^c	37.57^b	40.66^a	45.58^a
	2, 4-己二烯醛(E, E)-2, 4-hexadienal	C₆H₈O	1.35^a	0.36^b	0.39^b	0.49^b
	苯乙醛Benzeneacetaldehyde	C₈H₈O	0.17^a	0.15^a	0.09^b	0.06^b
	癸醛Decanal	C₁₀H₂₀O	0.16^a	0.18^a	0.09^b	0.07^b
	(E)-2-癸烯醛(E)-2-decenal	C₁₀H₁₈O
	橙花醛(E)-3, 7-dimethyl-2, 6-octadienal	C₁₀H₁₆O	-	0.01^a	0.01^a	0.01^a
	十五醛Pentadecanal	C₁₅H₃₀O	-	-	0.01	-
	金合欢基乙醛5, 9, 13-trimethyl-4, 8, 12-tetradecatrienal	C₁₇H₂₈O	-	-	0.01	-
	十四烷醛Tetradecanal	C₁₄H₂₈O	-	-	0.01	-
	十二醛Dodecanal	C₁₂H₂₄O	-	0.27	-	-
	壬醛Nonanal	C₉H₁₈O	0.10	-	-	-
	十八醛Octadecanal	C₁₈H₃₆O	0.08	-	-	-

表选项

2.2.4 果实中酮和酯类物质组分分析

由表 7可知:‘阳光玫瑰’果实香气中酮类物质种类较少, 具有青甜香、微玫瑰香气的香叶基丙酮在4个处理中均可检测到, 且对照和处理Ⅰ果实中相对含量较多。3-辛酮具有果实香味, 只在处理Ⅰ的果实中检测到, 其相对含量为0.26%。酯类物质含量较低, 处理Ⅲ果实含有的酯类物质种类和含量最少, 只有1种。具有芳香味的邻苯二甲酸二异丁酯相对含量最高, 4个处理中均含有, 处理Ⅲ果实相对含量较低。

表 7 GA₃配合不同浓度CPPU处理果实中主要酮、酯类香气成分 Table 7 The content of the main ketone and ester aromatic compositions in GA₃ with different CPPU concentration treatments

化合物种类 Compound	化合物名称 Compound name	分子式 Molecular formula	相对含量/% Relative content
化合物种类 Compound	化合物名称 Compound name	分子式 Molecular formula	CK	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ
酮Ketone	香叶基丙酮Geranyl acetone	C₁₃H₂₂O	0.08^a	0.06^a	0.03^b	0.02^b
	3-辛酮3-octanone	C₈H₁₆O	-	0.24	-	-
酯Ester	邻苯二甲酸二异丁酯Phthalic acid, bis-iso-butyl ester	C₁₆H₂₂O₄	0.40^a	0.32^a	0.35^a	0.03^b
	14-甲基十五烷酸甲酯14-methylpentadecanoic acid methyl ester	C₁₇H₃₄O₂	-	0.01^a	0.03^a	-
	亚硫酸, 丁基十二烷基酯Sulfurous acid, butyl dodecyl ester	C₁₆H₃₄O₃S	0.01	-	-	-
	2, 2, 4-三甲基-1, 3-戊二醇二异丁酸酯 Propanoic acid, 2-methyl-, 2, 2-dimethyl-1-(1-methylethyl)-1, 3-propanediyl ester	C₁₆H₃₀O₄	0.01^a	0.01^a	-	-

表选项

2.2.5 果实中烷烃类、烯烃类物质组分分析

由表 8可知:烷烃类、烯烃类物质对葡萄香气也有重要的影响。4个处理均含有3种硅氧烷类化合物:十甲基环五硅氧烷、十二甲基环六硅氧烷和十六甲基环八硅氧烷, 而处理Ⅲ果实中还含有另外2种硅氧烷类化合物:十八甲基环九硅氧烷和二十甲基环十硅氧烷。烯烃类化合物以处理Ⅲ的果实香气中最多, 达4种, 包括具有柠檬香味的柠檬烯, 松木香的3-蒈烯, 木香的长叶环烯和长叶烯; 处理Ⅱ的果实香气中只有柠檬烯, 为0.02%, 相对含量很低; 其他2个处理中不含烯烃类化合物质。

表 8 GA₃配合不同浓度CPPU处理果实中主要烷烃、烯烃类香气成分 Table 8 The content of the main alkanes and alkenes aromatic compositions in GA₃ with different CPPU concentration treatments

化合物种类 Compound	化合物名称 Compound name	分子式 Molecular formula	相对含量/% Relative content
化合物种类 Compound	化合物名称 Compound name	分子式 Molecular formula	CK	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ
烷烃Alkanes	十甲基环五硅氧烷Decamethyl-cyclopentasiloxane	C₁₀H₃₀O₅Si₅	0.15^a	0.07^b	0.02^c	0.04^c
	十二甲基环六硅氧烷Dodecamethyl-cyclohexasiloxane	C₁₂H₃₆O₆Si₆	0.08^a	0.03^b	0.02^b	0.03^b
	十六甲基环八硅氧烷Hexadecamethyl-cyclooctasiloxane	C₁₆H₄₈O₈Si₈	0.07^a	0.01^b	0.01^b	0.14^a
	十八甲基环九硅氧烷Octadecamethyl-cyclononasiloxane	C₁₈H₅₄O₉Si₉	-	-	-	0.20
	二十甲基环十硅氧烷Icosamethyl-cyclodecasiloxane	C₂₀H₆₀O₁₀Si₁₀	-	-	-	0.06
	十一烷Undecane	C₁₁H₂₄	-	-	-	0.01
	十四烷Tetradecane	C₁₄H₃₀	-	0.01^a	0.01^a	-
	十五烷Pentadecane	C₁₅H₃₂	-	-	0.01^a	0.01^a
	十六烷Hexadecane	C₁₆H₃₄	-	0.01^a	0.01^a	-
	十七烷Heptadecane	C₁₇H₃₆	0.02^a	0.01^a	0.01^a	0.01^a
	十九烷Nonadecane	C₁₉H₄₀	0.05^a	-	0.01^a	-
	二十六烷Hexacosane	C₂₆H₅₄	-	-	0.01	-
	正三十六烷Hexatriacontane	C₃₆H₇₄	0.04	-	-	-
	2-甲基十七烷2-methylheptadecane	C₁₈H₃₈	0.02	-	-	-
	2-甲基十八烷2-methyloctadecane	C₁₉H₄₀	0.01	-	-	-
	2-甲基十二烷2-methyldodecane	C₁₃H₂₈	0.02	-	-	-
烯烃Alkenes	柠檬烯1-methyl-4-(1-methylethenyl)-, (S)-cinene	C₁₀H₁₆	-	-	0.02^a	0.04^a
	3-蒈烯3-carene	C₁₀H₁₆	-	-	-	0.04
	长叶环烯Longicyclene	C₁₅H₂₄	-	-	-	0.01
	长叶烯Longifolene	C₁₅H₂₄	-	-	-	0.04

表选项

2.2.6 果实中酚类和其他类物质组分分析

由表 9可知:‘阳光玫瑰’果实香气中酚类物质种类较少, 具有刺激味的2, 4-二(1, 1-二甲基乙基)苯酚在4个处理中均可检测到, 对照和处理Ⅰ的果实香气中相对含量较多; 处理Ⅰ和Ⅱ的果实香气中还检测出了有刺激味的对叔丁基苯酚, 但相对含量较低。其他化合物以对照中最多, 有3种:丙二酰肼、二苯胺、三苯基氧化膦, 相对含量分别为0.03%、0.01%、0.19%。

表 9 GA₃配合不同浓度CPPU处理果实中主要酚类化合物、其他类香气成分 Table 9 The content of the main phenolic compounds and others aromatic compositions in GA₃ with different CPPU concentration treatments

化合物种类 Compound	化合物名称 Compound name	分子式 Molecular formula	相对含量/% Relative content
化合物种类 Compound	化合物名称 Compound name	分子式 Molecular formula	CK	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ
酚类化合物 Phenolic compounds	2, 4-二叔丁基苯酚 2, 4-bis (1, 1-dimethylethyl)-phenol	C₁₄H₂₂O	1.08^a	1.20^a	0.61^b	0.49^b
	对叔丁基苯酚4-tert-butyl phenol	C₁₀H₁₄O	-	0.01^a	0.01^a	-
其他Others	3, 6-二氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃 3, 6-dihydro-4-methyl-2-(2-methyl-1-propenyl)-2H-pyran	C₁₀H₁₆O		-	-	0.01
	丙二酰肼Malonic acid dihydrazide	C₃H₈N₄O₂	0.03	-	-	-
	二苯胺Diphenylamine	C₁₂H₁₁N	0.01	-	-	-
	三苯基氧化膦Triphenylphosphine oxide	C₁₈H₁₅OP	0.19^a	0.01^b	-	-

表选项

2.3 GA₃配合不同浓度CPPU处理对葡萄果实香气相关基因表达的影响

由图 1可知:在果实发育过程中, 对照果实的单萜合成前期关键基因脱氧木酮糖磷酸合酶基因(DXS 3)的表达量在转色期后开始缓慢上升, 到花后100 d左右时达到最高值, 之后下降, 处理Ⅰ和Ⅱ的基因表达量最高峰值推迟至花后110 d左右, 且低于对照, 无显著差异; 处理Ⅲ的基因表达量最低, 且持续上调。

	图 1 果实发育过程中单萜合成酶基因的转录变化 Figure 1 Transcript profiles of monoterpene biosynthesis genes during berry development
图选项

在单萜类物质合成中期, 对照果实中香叶基二磷酸合酶基因(GPPS)的表达量在转色期后缓慢上升, 花后100 d左右达到峰值, 之后下降; 处理Ⅰ和Ⅱ的基因表达量最高峰值出现时期推迟, 但最高峰值与对照之间无显著差异, 之后降低; 处理Ⅲ的基因表达量持续上调。

在单萜类物质合成后期, 对照果实里那醇合成酶基因(LIS)的表达量在花后80 d急剧上升, 在花后100 d达到最大。处理Ⅰ和Ⅱ的基因表达量在花后90 d之前都在缓慢上升, 最高值出现在花后110 d, 且峰值比对照低, 处理Ⅲ的LIS基因的表达量增长缓慢, 花后100 d后开始急剧上升。

以上结果说明, 高浓度的CPPU处理延缓了香气相关基因的表达, 抑制了其表达峰值, DXS 3和LIS基因表达量下调。随着果实成熟, 基因表达量缓慢上升, 之后果实因过熟而表达量降低。香气相关基因的表达趋势与果实的成熟进程相一致。

3 讨论

GA₃和CPPU作为植物生长调节剂被广泛应用于葡萄生产, GA₃主要生理效应是促进幼嫩组织的细胞分裂和细胞生长, 而CPPU具有诱导愈伤组织生长, 促进芽的发育、种子的萌发, 保绿和延缓衰老等显著的生理活性^[9-10]。GA₃配合不同浓度CPPU的处理, 相较于只用GA₃, 葡萄果实的纵横径、单果质量显著增加, 可溶性固形物含量却有所降低, 改善了其外观品质, 提高了葡萄的商品性, 这与前人结果^[11-12]相一致。有研究表明, CPPU浓度过高, 会降低果实的品质^[13]。本试验表明, 25 mg ·L^-1 GA₃+15 mg ·L^-1 CPPU处理由于CPPU浓度过高, 品质反而降低, 25 mg ·L^-1 GA₃+5 mg ·L^-1 CPPU和25 mg ·L^-1 GA₃+10 mg ·L^-1 CPPU处理浓度都是适宜的。

本研究中, 不同处理果实香气成分主要是醇、醛、酮、酯、烯烃、烷烃、酚类化合物和其他八大类, 玫瑰香型葡萄果实香气中含有丰富的单萜类物质, 主要是里那醇、香叶醇、橙花醇、萜品醇和香茅醇^[14], 对玫瑰香气贡献最大的是里那醇。与对照相比, 25 mg ·L^-1 GA₃+5 mg ·L^-1 CPPU、25 mg ·L^-1 GA₃+10 mg ·L^-1 CPPU和25 mg ·L^-1 GA₃+15 mg ·L^-1 CPPU处理的葡萄果实中香气成分种类减少, 单萜类物质相对含量也减少, 且CPPU浓度越高, 相对含量有下降的趋势。萜类物质对葡萄风味有重要的影响^[15], 本研究中, 4个处理葡萄中里那醇相对含量分别为14.78%、10.05%、9.30%、7.85%, 各个辅助性单萜类物质也有所降低, 果实的玫瑰香味会淡化。25 mg ·L^-1 GA₃+5 mg ·L^-1 CPPU、25 mg ·L^-1 GA₃+10 mg ·L^-1 CPPU和25 mg ·L^-1 GA₃+15 mg ·L^-1 CPPU处理的葡萄果实中C6化合物如2-己烯醛、己醇等(具有青草味)呈增加趋势, 是葡萄香气中的重要组分。Oliveiba等^[16]研究认为, 过多的C6化合物不利于葡萄的特征香气的形成。此外, 25 mg ·L^-1 GA₃+5 mg ·L^-1 CPPU, 25 mg ·L^-1 GA₃+10 mg ·L^-1 CPPU和25 mg ·L^-1 GA₃+15 mg ·L^-1 CPPU处理葡萄中乙醇含量显著降低, 有利于葡萄的采后贮藏^[17]。

玫瑰香型葡萄果实中含有丰富的萜类物质, 挥发性的萜类化合物主要由异戊二烯(C5)、单萜(C10)和倍半萜烯(C15)构成, 其中最为丰富的是单萜类化合物^[18], 其主要合成途径是甲基磷酸赤藓糖途径(methyl-erythritol-4-phosphate pathway, MEP)^[19], 最主要的单萜类物质是里那醇, 对玫瑰香气的贡献值最大^{[14, 20]}。DXS 3、GPPS和LIS基因是此单萜合成代谢途径前期、中期和晚期关键基因^[21]。DXS 3与单萜物质积累规律相一致, 转色期后持续上升至成熟期, 之后下降^[22]。本试验中, 25 mg ·L^-1 GA₃+5 mg ·L^-1 CPPU、25 mg ·L^-1 GA₃+10 mg ·L^-1 CPPU和25 mg ·L^-1 GA₃+15 mg ·L^-1 CPPU处理的葡萄果实与对照相比, DXS 3、GPPS和LIS基因转录峰值高峰期明显推迟, 且表达量下调。浓度越高, 高峰期后推且降低。本试验表明, 过高浓度的CPPU处理不利于葡萄香气合成相关基因的表达和香气物质的形成。

本试验表明:‘阳光玫瑰’葡萄玫瑰香味的变淡主要是由于萜类物质是里那醇、香叶醇、橙花醇、萜品醇和香茅醇等物质的减少, 其间接原因可能是CPPU抑制了ABA合成相关基因表达, 延缓了生长期, 推迟了ABA生成高峰且峰值变小^[23]。ABA是促进葡萄果实成熟衰老的首要激素, ABA的大量产生能促使乙烯释放高峰, 乙烯能加快游离脂肪酸和异亮氨酸的增加, 促进香气前体物质的形成; ABA生成受到抑制和减少, 使乙烯同时受到了抑制, 减少了香气物质的生成^[24-27]。直接原因是萜类物质合成主要基因DXS 3、GPPS和LIS表达受到抑制, 导致萜类物质合成减少, 玫瑰香味淡化。

综上所述, 25 mg ·L^-1 GA₃+5 mg ·L^-1 CPPU、25 mg ·L^-1 GA₃+10 mg ·L^-1 CPPU和25 mg ·L^-1 GA₃+15 mg ·L^-1 CPPU处理的葡萄果实与对照相比, 果实增大增重, 香气种类和单萜物质含量减少, 玫瑰风味偏淡, 基因表达量高峰推迟且峰值下调, 综合考虑, 25 mg ·L^-1 GA₃+5 mg ·L^-1 CPPU处理效果最佳, 提高了其商品价值。

参考文献(References)

[1]	Suehiro Y, Mochida K, Itamura H, et al. Skin browning and expression of PPO, STS, and CHS genes in the grape berries of'Shine Muscat'[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 2014,83(2): 122–132. DOI: 10.2503/jjshs1.CH-095

[2]	顾克余, 周蓓蓓, 宋长年, 等. 植物生长调节剂及其在葡萄生产上的应用综述[J]. 江苏农业科学, 2015, 43(7): 13–16. Gu K Y, Zhou B B, Song C N, et al. A survey on the plant growth regulator and its application in grape production[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2015,43(7): 13–16. (in Chinese)

[3]	季晨飞, 郑焕, 陶建敏. GA₃和CPPU对红宝石玫瑰葡萄果实无核率及品质的影响[J]. 中国果树, 2013(3): 47–49. Ji C F, Zheng H, Tao J M. Effects of GA₃and CPPU treatment on seedlessness and berry quality of'Ruby Seedless' grape[J]. China Fruits, 2013(3): 47–49. (in Chinese)

[4]	周建梅.鲜食葡萄香气物质的组成和代谢调控[D].泰安:山东农业大学, 2013. Zhou J M. Analysis on the constituents and metabolic regulations of aroma in table grapes[D]. Tai'an:Shandong Agricultural University, 2013(in Chinese with English abstract). http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-AHNY201613049.htm

[5]	张明霞, 吴玉文, 段长青. 葡萄与葡萄酒香气物质研究进展[J]. 中国农业科学, 2008, 41(7): 2098–2104. Zhang M X, Wu Y W, Duan C Q. Progress in study of aromatic compounds in grape and wine[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2008,41(7): 2098–2104. (in Chinese)

[6]	张克坤, 王海波, 王孝娣, 等. '瑞都香玉'葡萄果实挥发性成分在果实发育过程中的变化[J]. 中国农业科学, 2015, 48(19): 3965–3978. Zhang K K, Wang H B, Wang X D, et al. Evolution of volatile compounds during the berry development of'Ruidu Xiangyu'grape[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2015,48(19): 3965–3978. (in Chinese)

[7]	何明茜.葡萄香气物质在两类杂交群体中的遗传规律[D].武汉:华中农业大学, 2013. He M Q. Inheritance of grape (Vitis vinifera) aroma compounds in two type interbreeding populations[D]. Wuhan:Huazhong Agricultural University, 2013(in Chinese with English abstract). http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10504-1013336172.htm

[8]	Martin D M, Chiang A, Lund S T, et al. Biosynthesis of wine aroma:transcript profiles of hydroxymethylbutenyl diphosphate reductase, geranyl diphosphate synthase, and linalool/nerolidol synthase parallel monoterpenol glycoside accumulation in Gewurztraminer grapes[J]. Planta, 2012,236(3): 919–929. DOI: 10.1007/s00425-012-1704-0

[9]	余智莹, 张萌, 陶建敏. GA₃和CPPU对凉玉葡萄果实品质的影响[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2010(7): 49–51. Yu Z Y, Zhang M, Tao J M. Effects of GA₃and CPPU treatment on the berry quality of'Liang Yu'grape[J]. Sino-Overseas Grapevine and Wine, 2010(7): 49–51. (in Chinese)

[10]	高金山, 边庆华, 张永忠. 细胞分裂素CPPU的研究进展[J]. 农药, 2006, 45(3): 151–154. Gao J S, Bian Q H, Zhang Y Z. Research progress on the cytokinin, CPPU[J]. Agrochemicals, 2006,45(3): 151–154. (in Chinese)

[11]	白世践, 李超, 赵荣华, 等. 赤霉素与氯吡苯脲处理对'克瑞森'无核葡萄果实品质的影响[J]. 北方园艺, 2015(14): 7–10. Bai S J, Li C, Zhao R H, et al. Effect of GA₃ and CPPU treats on fruit quality of'Crimson'seedless grape[J]. Northern Horticulture, 2015(14): 7–10. (in Chinese)

[12]	王延书, 管恩桦, 陈修会, 等. GA₃和CPPU对藤稔葡萄品质的影响[J]. 落叶果树, 2014, 46(3): 8–9. Wang Y S, Guan E H, Chen X H, et al. Effects of GA₃and CPPU treatment on the berry quality of'Fujiminori'grape[J]. Deciduous Fruits, 2014,46(3): 8–9. (in Chinese)

[13]	王世平, 董秋洪, 杨天仪, 等. 生长调节剂对藤稔果粒膨大及其品质的影响[J]. 上海交通大学学报(农业科学版), 2004, 22(1): 37–42. Wang S P, Dong Q H, Yang T Y, et al. Effect of growth regulator on berry size and quality in Fujiminori grapevine[J]. Journal of Shanghai Jiaotong University (Agricultural Science Edition), 2004,22(1): 37–42. (in Chinese)

[14]	Fenoll J, Manso A, Hellin P, et al. Changes in the aromatic composition of the Vitis vinifera grape Muscat Hamburg during ripening[J]. Food Chemistry, 2009,114: 420–428. DOI: 10.1016/j.foodchem.2008.09.060

[15]	El Hadi M A M, Zhang F J, Wu F F, et al. Advances in fruit aroma volatile research[J]. Molecues, 2013,18(7): 8200–8229. DOI: 10.3390/molecules18078200

[16]	Oliveiba J M, Faria M, Sa F, et al. C₆-alcohols as varietal markers for assessment of wine origin[J]. Analytica Chimica Acta, 2006,563(1/2): 300–309.

[17]	赵彦莉, 张华云, 修德仁, 等. 不同气体成分对意大利葡萄贮藏中乙醇、乙醛含量的影响[J]. 果树学报, 2003, 20(6): 459–462. Zhao Y L, Zhang H Y, Xiu D R, et al. Effect of different atmospheres on the contents alcohol and aldehyde in the berries of italia grape variety during storage[J]. Journal of Fruit Science, 2003,20(6): 459–462. (in Chinese)

[18]	Dudareva N, Negre F, Nagegowa D A, et al. Plant volatiles:recent advances and future perspectives[J]. Crit Rev Plant Sci, 2006,25: 417–440. DOI: 10.1080/07352680600899973

[19]	Bohlmann J, Keeling C I. Terpenoid biomaterials[J]. Plant Journal, 2008,54(4): 656–669. DOI: 10.1111/j.1365-313X.2008.03449.x

[20]	涂崔, 潘秋红, 朱保庆, 等. 葡萄与葡萄酒单萜化合物的研究进展[J]. 园艺学报, 2011, 38(7): 1397–1406. Tu C, Pan Q H, Zhou B Q, et al. Progress in study of monoterpene compounds in grape and wine[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2011,38(7): 1397–1406. (in Chinese)

[21]	Martin D M, Aubourg S, Schowey M B, et al. Functional annotation, genome organization and phylogeny of the grapevine (Vitis vinifera) terpene synthase gene family based on genome assembly, FLcDNA cloning, and enzyme assays[J]. BMC Plant Biology, 2010,10: 226. DOI: 10.1186/1471-2229-10-226

[22]	孙磊, 朱保庆, 孙晓荣, 等. '亚历山大'葡萄果实单萜生物合成相关基因转录及萜类物质积累规律[J]. 中国农业科学, 2014, 47(7): 1379–1386. Sun L, Zhu B Q, Sun X Y, et al. Terpenes biosynthesis related gene transcript profiles and terpenes accumulation of'Alexandria'grape[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2014,47(7): 1379–1386. (in Chinese)

[23]	王央杰, 李三玉, 王向阳. CPPU对巨峰葡萄果粒肥大和内源激素水平的影响[J]. 园艺学报, 1997, 24(1): 85–87. Wang Y J, Li S Y, Wang X Y. Effect of CPPU on fruit growth and end ogenous hormones in'Kyoho'grape[J]. Acta Horticulturae Sinica, 1997,24(1): 85–87. (in Chinese)

[24]	Defilippi B G, Kader A A, Dandekar A M. Apple aroma:alcohol acyltransferase, a rate limiting step for ester biosynthesis, is regulated by ethylene[J]. Plant Science, 2005,168: 1199–1210. DOI: 10.1016/j.plantsci.2004.12.018

[25]	Fellman J K, Rudell D R, Mattinson S D, et al. Relationship of harvest maturity to flavor regeneration after CA storage of'Delicious'apples[J]. Postharvest Biology and Technology, 2003,27: 39–51. DOI: 10.1016/S0925-5214(02)00193-X

[26]	陈丹生, 苏新国, 郑永华, 等. 1-甲基环丙烯对红富士苹果贮藏品质的影响[J]. 食品科学, 2003, 24(9): 143–146. Chen D S, Su X G, Zheng Y H, et al. The effects of exogenously applied 1-MCP on physiological and quality changes in harvested apple[J]. Food Science, 2003,24(9): 143–146. (in Chinese)

[27]	秦丹, 石雪晖, 胡亚平, 等. 葡萄采后贮藏保鲜研究进展[J]. 保鲜与加工, 2006, 6(1): 9–12. Qin D, Shi X H, Hu Y P, et al. Advances of research on postthavest-storage of grape[J]. Storage and Process, 2006,6(1): 9–12. (in Chinese)