文章信息
- 黄文晓, 翁飞, 査满荣, 丁艳锋, 王绍华
- HUANG Wenxiao, WENG Fei, ZHA Manrong, DING Yanfeng, WANG Shaohua
- 水稻突变体D12W191多分蘖表型产生与细胞分裂素的关系
- Relationship of the multi-tiller phenotype of a rice mutant D12W191 with cytokinin
- 南京农业大学学报, 2016, 39(5): 711-721
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(5): 711-721.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201603056
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-28
分蘖是单子叶植物在生长发育过程中形成的一种特殊的分枝特性, 其对水稻株型的可塑性和产量至关重要[1]。在迄今发现的所有激素中, 生长素(IAA)、细胞分裂素(CTK)以及独脚金内酯(SLs)都对水稻分蘖的发生具有很重要的作用[2-3]。生长素是最早被发现的植物激素, 其在植株顶端及幼嫩组织中合成[4], 抑制腋芽的生长发育[5-6]。前人的研究表明生长素并不直接进入腋芽中调控其生长, 而是通过第二信使间接地发挥作用, 细胞分裂素和独脚金内酯是目前已知的两种生长素的第二信使[7-8]。细胞分裂素促进腋芽的生长, 与此相反, 独脚金内酯则抑制腋芽的生长[9-11]。IPT(异戊烯基转移酶)基因家族是调控细胞分裂素合成的关键基因, 而细胞分裂素氧化酶(CKX)是目前被鉴定出唯一能够降解细胞分裂素的酶, 生长素通过调控IPT和CKX的表达进而调控腋芽的生长[12]。D 10 [13]和D 17 [14]是独脚金内酯合成路径中的两个关键基因, 生长素通过诱导它们的表达来促进独脚金内酯的合成, 抑制腋芽的生长[15-16], 并发现D 14和D53通过影响独脚金内酯的信号转导而调控分蘖[17-18]。水稻多分蘖突变体D12W191是由粳稻品种‘武育粳3号’经甲基磺酸乙酯EMS诱导突变而来, 根据前期的研究结果初步推断, 突变体D12W191的多分蘖表型可能不是由独脚金内酯的合成缺陷或者信号通路被阻断所造成的。因此本试验以水稻基部分蘖节及其着生的分蘖芽为研究对象, 从植物激素水平和基因转录水平两个方面比较分析不同品种的差异, 进一步探索新型材料D12W191多分蘖表型产生的生理机制, 以期更深入地了解植物激素调控水稻分蘖的生理机制, 为更好地调控水稻分蘖提供依据。
1 材料与方法 1.1 供试材料以粳稻品种‘武育粳3号’及以‘武育粳3号’为亲本利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱导突变获得的矮秆多分蘖突变体(编号为D12W191)为供试材料。
1.2 试验设计试验一 突变体D12W191的表型特征观察:试验于2013年在南京农业大学丹阳试验基地进行, 设矮秆多分蘖突变体D12W191和野生型‘武育粳3号’2个处理, 小区面积225 m2(5 m×45 m), 重复3次, 随机区组排列。5月30日播种, 6月28日移栽, 行距30 cm, 株距13.3 cm, 每穴栽插3棵苗。其他栽培管理参照当地大面积生产进行。
试验二 突变体D12W191与‘武育粳3号’的植物激素含量差异比较(田间试验):于2015年在南京农业大学丹阳试验基地进行。5月20日播种, 6月20日单苗移栽至田间, 小区按随机区组排列, 重复3次。在水稻9叶1心期割取主茎第8叶腋处的分蘖节及其着生的分蘖芽, 液氮速冻后超低温(-70 ℃)保存, 待进行植物激素含量测定分析及相关基因表达分析。
试验三 细胞分裂素合成抑制剂Lovastatin对突变体的调控效应(盆栽试验):在突变体D12W191长出3叶时用6 mg · L-1的细胞分裂素合成抑制剂Lovastatin(Lovastatin用少量的二甲基亚砜DMSO溶解后用清水稀释, 再加入少量的吐温20)处理, 突变体幼苗种植在周转箱(46 cm×33 cm×22 cm)内, 每个周转箱种植20苗, 使用250 mL小喷壶进行叶面喷施, 直至叶面铺有一层明显的水珠为止, 平均每个周转箱的喷施量为100 mL左右, 对照为喷施含有与Lovastatin处理相同浓度DMSO的清水, 5 d后再处理1次, 于第1次处理后10 d和15 d观察不同处理的分蘖发生情况。
试验四 外源NAA对突变体D12W191与‘武育粳3号’分蘖芽生长和分蘖相关基因表达的影响(盆栽试验):于2015年在南京农业大学丹阳试验基地玻璃温室进行。8月25播种, 9月20选取生长一致的秧苗移栽至周转箱(46 cm×33 cm×22 cm)中, 单苗移栽, 每箱10苗。在主茎第10叶露尖时进行如下处理:1)NAA处理, 叶面喷施100 mg · L-1的NAA(NAA用少量的无水乙醇溶解后用清水稀释, 再加入少量的吐温20), 直至叶面铺有一层明显的水珠为止, 平均每个周转箱的喷施量为250 mL左右; 2)对照(CK), 喷施含有与NAA处理相同浓度无水乙醇的清水。从处理当天至处理后第4天每天取样1次, 取主茎第8叶腋内的分蘖芽, 每处理共取20个芽, 测量其长度。另外在处理0和6 h时, 取主茎第8叶腋处的分蘖节及其着生的分蘖芽, 液氮速冻后超低温(-70 ℃)保存, 待进行基因表达分析。
1.3 表型及产量测定茎蘖数:在移栽后21、28、35、42、49和56 d进行查苗, 每小区普查10穴。
株高:在移栽后45 d和成熟期分别调查水稻的株高, 使用卷尺进行测量。
产量及构成因素:成熟期每小区普查30穴, 调查每平方米穗数, 取代表性植株3穴并考种, 考种指标主要包括每穗实粒数、空瘪粒数、结实率和千粒质量, 计算其理论产量。
1.4 内源细胞分裂素和生长素含量测定分蘖芽和分蘖节中的内源CTK和IAA含量采用HPLC-MS/MS测定。
1.4.1 仪器与试剂吲哚乙酸(IAA)、玉米素(Z)和反式玉米素核糖苷(ZR)标准品(购自Sigma公司), 色谱级甲醇(购自Tedia公司), 其他试剂均为国产分析纯。台式高速离心机(德国SORVAL公司)、AR5120电子天平(美国AHOΜS公司)、Aglient1290高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、SCIEX-6500Qtrap(MSMS)(美国AB公司)、旋转混合器(海门市其林贝尔公司)、便携式超声波清洗仪(深圳杰拓科技)和氮吹仪(杭州米欧仪器有限公司)。
1.4.2 激素提取准确称量适量新鲜植物样品, 于液氮中研磨至粉碎; 向粉末中加入10倍体积异丙醇/盐酸提取缓冲液, 4 ℃振荡30 min; 加入2倍提取液体积的二氯甲烷, 4 ℃振荡30 min; 4 ℃、13 000 r · min-1离心5 min, 取下层有机相; 避光, 以氮气吹干有机相, 以200 μL甲醇(含0.1%甲酸)溶解; 过0.22 μm滤膜, 进HPLC-MS/MS检测。
1.4.3 液质检测标准液配置:以甲醇(0.1%甲酸)为溶剂配制梯度为0.2、0.5、1、5、10、50和200 ng · L-1的IAA、ZR、Z标准溶液。液相条件:色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-C18反相色谱柱(2.1 mm×150 mm, 3.5 μm); 柱温30 ℃; 流动相A为含0.1%(体积分数)甲酸的甲醇溶液, 流动相B为含0.1%(体积分数)甲酸的水溶液; 洗脱梯度:0~2 min, A=20%;2~14 min, A递增至80%;14~15 min, A=80%;15.1 min, A递减至20%;15.1~20 min, A=20%。进样体积2 μL。质谱条件:气帘气15 psi, 喷雾电压4 500 V, 雾化气压力65 psi, 辅助气压力70 psi, 雾化温度400 ℃。
| 物质名称 Substance name |
极性 Polarity |
母离子(m/z) Precursor ion |
子离子(m/z) Product ion |
解簇电压/V Declustering potential |
碰撞能量/V Collision energy |
保留时间/min Retention time |
| Z | + | 220.4 | 136.0/202.1/147.9 | 92 | 22/16/20 | 2.93 |
| ZR | + | 352.3 | 220.2/136.0/202.1 | 90 | 25/40/32 | 5.64 |
| IAA | + | 176.2 | 129.8/102.9 | 65 | 12/42 | 8.71 |
| 注:Z:玉米素Zeatin; ZR:玉米素核苷Ribosylzeatin; IAA:吲哚乙酸Indoleacetic acid. The same as follows. | ||||||
使用E.Z.N.A.® Plant RNA Kit(Omega Bio-tek, Inc, USA)提取分蘖芽和分蘖节RNA并除去基因组DNA。提取组织RNA后, 用紫外分光光度计测定D260和D280, 检测RNA质量并计算RNA浓度。检测合格后, 按PrimScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)说明书进行反转录。先按照说明书中所列出的组分配制反转录(RT)反应液, 然后进行反转录, 反转录仪器采用美国Bio-Rad公司的PTC-0200 DNA Engine Cycler。反转录结束后, 使用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)试剂盒和ABI 7300荧光定量PCR仪进行Real-time RT-PCR反应, 按试剂盒说明书进行操作。以ACTIN基因作为内标基因, 各基因PCR扩增所用引物序列见表 2。所有样品设3次生物学重复, 结果采用ΔΔCT法分析。
| 基因Gene | 上游引物Forward primer 5′→3′ | 下游引物Reverse primer 5′→3′ |
| OsIPT4 | TGGATGTGGTGACGAACAAGGTGAC | GATCTACGTCGACCCAGAGGAAGCA |
| OsIPT5 | AGGTGATCAACGCCGACAAGCTGCA | TCGACGAGCTCCTCGATGTAGGAGT |
| OsIPT7 | TGGACGACATGGTGGACGCTGGCAT | GCTTTGATGTCGTCGATCGCCTCGG |
| OsIPT8 | GTCGACGACGATGTTCTCGACGAAT | TGTTGGCCTTGATCTCGTCTATCGC |
| OsCKX1 | ACAAGGCGTACCTGGCGCAC | TGGCCAGGGGAGAGCAGCTT |
| OsCKX4 | GCCACAGGACCCAGTGCAGG | TTCAGCCACGGGTGTGGGACT |
| OsCKX5 | CGCTGCTGGGCGAGCTGAAT | CGCCTTGTGCACGCGGTCTA |
| OsCKX9 | GCCAGGATTCCTCTTGAACCTGC | ACGCACTGGGTCCTGCGGAT |
| OsYUCCA3 | GTGAGAACGGGCTCTACTCGGTCG | GCTTATGCATGACCGATGAACACG |
| OsYUCCA4 | GCAGAATGGCCTGTACGCTGTTGG | CAGACCAGCACATGACGTGTCTAC |
| OsYUCCA6 | CCATTCCCAGATGGTTGGAAGG | CATGTTGCGCCTCAAGATATTTG |
| OsRR6 | CCGAGGACTTCCTGCTCA | TCATCCTCTCCATGATCCAA |
| OsRR7 | TGCTCAAGAAGATCAAGGAATCG | GGCACGTTCTCTGACGACATTAT |
| OsRR11 | CTAGGCTCGGAACCAAATGT | ACGGGGATCTTCTTCAGCTT |
| OsTB1 | GCCGGATGCAAGAAATC | TCAGCAGTAGTGCCGCGAA |
| ACTIN | CAATCGTGAGAAGATGACCC | GTCCATCAGGAAGCTCGTAGC |
采用SigmaPlot 12.0软件绘图, 用Microsoft Excel 2010进行方差分析。
2 结果与分析 2.1 D12W191与‘武育粳3号’的株高和分蘖数突变体材料D12W191经过4个世代的选育, 株系内性状已经稳定。突变体D12W191相对于野生型‘武育粳3号’表现出多蘖、矮秆等特性(图 1)。如图 1-A和图 1-B所示, 在分蘖盛期和成熟期时, 两者的分蘖数和株高均表现出显著的差异。在移栽后21 d时, 野生型‘武育粳3号’的平均分蘖数为(18.1±1.7)个, 此时突变体D12W191的分蘖数已远高于野生型, 达到(28.2±1.8)个; 移栽后28 d时, 突变体D12W191的分蘖数与移栽后21 d基本相同, 但是从28 d到35 d这段时间内, D12W191的分蘖数急剧上升, 而此时野生型‘武育粳3号’的分蘖开始逐渐消亡; 35 d后, 突变体D12W191的分蘖发生速度开始减慢, 42 d后分蘖数基本稳定(图 1-C)。移栽后45 d和成熟期, 野生型的株高分别达到(59.6±3.6)cm和(88.6±2.3)cm, 而突变体的株高只分别达到(42.8±2.6)cm和(55.4±2.6)cm(图 1-D)。
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图 1 D12W191与‘武育粳3号’的株高和分蘖数
Figure 1 Plant height and tiller numbers of D12W191 and'Wuyujing 3'
1)A:分蘖期Tillering stage; B:成熟期Maturity stage; C:移栽后不同时间的分蘖数Tiller number per hill at different time after transplanting; D:移栽后45 d和成熟期的株高Plant height at 45 d after transplanting and at maturity stage 2)*表示在0.05水平上差异显著。* means significant difference at the 0.05 probability level. The same as below. |
从表 3可见, 突变体D12W191的有效穗数远远高于野生型, 而穗粒数却不到‘武育粳3号’的1/3, 且结实率和千粒质量均低于‘武育粳3号’, 最终导致产量低于‘武育粳3号’。
| 材料Material | 穗数/(104 hm-2) No.of panicles |
穗粒数 No.of grains per panicle |
结实率/% Seed-setting rate |
千粒质量/g 1 000-grain weight |
理论产量/(t·hm-2) Grain yield |
| WT | 358.3b | 98.6a | 0.95a | 26.8a | 9.0a |
| mut | 1 058.3a | 32.7b | 0.70b | 23.5b | 5.7b |
| 注: 1) WT和mut分别代表野生型‘武育粳3号’和突变体D12W191。WT and mut represent‘Wuyujing 3’and D12W191 respectively. The same as below. 2)同列数据后不同字母表示处理间在0.05水平差异显著。Values followed by different letters in the same column mean significant difference at 0.05 level. |
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田间试验获取的两种供试材料植物激素含量如图 2。突变体D12W191分蘖芽的玉米素(Z)和玉米素核苷(ZR)含量均显著高于野生型‘武育粳3号’, 但生长素(IAA)含量在供试材料的分蘖芽中没有差异; 在分蘖节中, 突变体D12W191与‘武育粳3号’的Z和ZR含量未出现显著差异, 与分蘖芽不同, 突变体D12W191分蘖节的IAA含量高于野生型。细胞分裂素(CTK)和IAA的平衡对水稻分蘖的形成起到了重要的调控作用[19], 本试验中IAA与Z+ZR含量比值分析表明, 分蘖芽和分蘖节的IAA与Z+ZR含量比值均是‘武育粳3号’大于突变体D12W191。
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图 2 D12W191和‘武育粳3号’分蘖芽和分蘖节中植物激素含量 Figure 2 Phytohormones content in tiller buds and nodes of D12W191 and'Wuyujing 3' |
突变体D12W191分蘖芽和分蘖节中OsIPT 4、OsIPT5和OsIPT7的表达量都高于野生型, 其中0sIPT5 在D12W191分蘖节中的表达量更是达到对照的10倍多(图 3)。而细胞分裂素氧化酶编码基因OsCKXs的表达情况却与此截然相反, OsCKX 4、OsCKX5和OsCKX9在突变体分蘖芽分蘖节中的表达量显著低于野生型, OsCKX1 在突变体分蘖芽中表达下调, 但是在分蘖节中的表达量与野生型无显著差异(图 4)。细胞分裂素响应调节子基因OsRR 6、OsRR7、OsRR11在突变体分蘖芽和分蘖节中基本都呈下调趋势(图 5)。本研究检测到3个与生长素合成相关基因的表达, 其中OsYUCCA 3、OsYUCCA4在突变体分蘖芽和分蘖节中的表达量与野生型相比无显著差异, 而OsYUCCA6在突变体分蘖芽的转录水平与野生型一致, 但在分蘖节中显著下调(图 6)。OsTB 1 编码TCP家族的一个转录因子, 抑制水稻侧芽的伸出, 负调节水稻分蘖数, 在分蘖芽中特异性表达[20-22], 与野生型相比, 其在突变体分蘖芽中表达也下调(图 7)。
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图 3 OsIPT在D12W191和‘武育粳3号’分蘖芽和分蘖节中的表达量 Figure 3 The expression level of OsIPT in tiller buds and nodes of D12W191 and'Wuyujing 3' |
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图 4 OsCKX在D12W191和‘武育粳3号’分蘖芽和分蘖节中的表达量 Figure 4 The expression level of OsCKX in tiller buds and nodes of D12W191and'Wuyujing 3' |
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图 5 OsRR在D12W191和‘武育粳3号’分蘖芽和分蘖节中的表达量 Figure 5 The expression level of OsRR in tiller buds and nodes of D12W191 and'Wuyujing 3' |
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图 6 OsYUCCA在D12W191和‘武育粳3号’分蘖芽和分蘖节中的表达量 Figure 6 The expression level of OsYUCCA in tiller buds and nodes of D12W191 and'Wuyujing 3' |
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图 7 OsTB 1 在D12W191和‘武育粳3号’分蘖芽中的表达量 Figure 7 The expression level of OsTB 1 in tiller buds of D12W191 and'Wuyujing 3' |
从图 8可见, 在第1次处理10 d后, 6 mg · L-1细胞分裂素合成抑制剂Lovastatin完全抑制了D12W191分蘖的发生, 主茎上没有分蘖长出。15 d时, Lovastatin对分蘖的抑制作用慢慢减弱, 喷施Lovastatin处理的植株开始长出分蘖。
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图 8 细胞分裂素合成抑制剂Lovastatin对突变体分蘖的调控 Figure 8 The regulation of cytokinin-synthesis inhibitor Lovastatin on tillers of D12W191 CK:叶面喷清水处理Treatment with distilled water; Lovastatin:叶面喷施6 mg · L-1 Lovastatin处理Treatment with 6 mg · L-1 Lovastatin |
从图 9可见, 同一处理中2个材料分蘖芽生长动态趋势基本相同。喷清水处理的突变体和野生型分蘖芽长度在48 h后开始急剧增加, 外源NAA处理显著抑制了主茎第8叶腋分蘖芽的生长, 使分蘖芽进入休眠状态, 处理后96 h内, 分蘖芽一直处于生长停滞状态。
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图 9 外源NAA对分蘖芽芽长的影响 Figure 9 Effects of exogenous NAA on the length of tiller buds CK:叶面喷清水处理Treatment with distilled water; NAA:叶面喷施100 mg · L-1 NAA处理Treatment with 100 mg · L-1 NAA |
叶面喷施NAA后, 2个材料分蘖芽中OsIPT 4、OsIPT5、OsIPT8表达量显著下降, 在处理6 h后就已经显著低于CK(图 10-A); 而OsCKX 1、OsCKX4、OsCKX9及OsTB1的表达水平在处理6 h后显著高于同期CK处理(图 10-B、C)。综上可知, NAA对分蘖相关基因的调控效果比较明显。
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图 10 外源NAA对分蘖芽中分蘖相关基因表达量的影响 Figure 10 Effects of NAA on the expression level of genes related of tiller outgrowth in tiller buds |
分蘖是影响水稻形态建成和产量的一个重要因素, 塑造合理的分蘖发生群体, 对提高水稻单产具有重要意义。本研究中所使用的突变体D12W191为野生型粳稻‘武育粳3号’经EMS诱导突变所得, 具有多分蘖、矮化、低结实率等性状。植物激素含量及相关基因表达和外源植物生长调节剂处理结果表明, 植物激素对D12W191的多分蘖表型建成发挥了重要作用。
突变体D12W191的多分蘖可能是由于其分蘖芽内较多的细胞分裂素含量引起的, 生长素的变化并不是多分蘖性状形成的原因。Thimann等[5]研究表明生长素IAA在分枝抑制中起着很重要的作用。Wang等[23]发现叶腋中生长素含量下降是叶腋分生组织起始的必要条件。茎尖产生的生长素向下运输导致主茎生长素极性运输流的增加, 从而抑制基部分枝的生长[24]。与IAA相反, 细胞分裂素作为一种促进型激素能够解除生长素对分蘖芽的抑制作用, 打破分蘖芽的休眠状态, 同时生长素可以通过下调IPTs基因或者上调CKXs基因的表达来调控CTK的积累量, 从而抑制细胞分裂素对分蘖芽的促进效应[12, 25-27]。本试验中对分蘖盛期的分蘖芽和分蘖节中CTK和IAA测定结果表明, 突变体D12W191分蘖芽的玉米素和玉米素核苷的含量均高于野生型, 在分蘖节中, 2个材料的玉米素和玉米素核苷含量均没有表现出显著差异。因此, 从分蘖芽和分蘖节的CTK比较结果可推测, CTK含量差异是使D12W191产生多分蘖的一个重要生理因素。Lovastatin是细胞分裂素的一种合成抑制剂, 叶面喷施6 mg · L-1 Lovastatin抑制了突变体分蘖的发生, 外源NAA处理通过改变突变体材料的CTK积累从而抑制了分蘖芽的生长, 这些结果从侧面也说明了突变体较高的CTK含量是多分蘖发生的一个重要原因。Symons等[28]发现豌豆体内IAA快速失活致使IAA含量下降, 从而产生茎节短、叶片小、分枝多等性状。本研究对‘武育粳3号’和突变体D12W191的分蘖芽和分蘖节的内源IAA也进行了测定, 结果表明, 突变体分蘖节中IAA含量较野生型有所下降, 但是突变体分蘖芽内的IAA含量与野生型相比基本不变, 推测IAA含量的变化不是D12W191多分蘖性状形成的原因。
为了进一步验证上述的推测, 本研究利用RT-qPCR测定了细胞分裂素和生长素相关基因在分蘖芽和分蘖节中的表达情况。突变体分蘖芽中的细胞分裂素合成基因OsIPT 4、OsIPT5、OsIPT7表达上调, 细胞分裂素氧化酶编码基因OsCKX1、OsCKX4、OsCKX5、OsCKX9表达下调, 这与突变体分蘖芽内较高的CTK含量是一致的。内源CTK主要在根部和节中局部合成, Faiss等[29]发现增加长距离运输CTK供应并不能引起分枝的增加, 只有局部产生的CTK能够促进腋芽的生长。本研究发现多分蘖突变体分蘖节中的细胞分裂素合成基因表达上调, 降解基因表达下调, 但是内源细胞分裂素的含量与野生型没有显著差异, 进一步说明分蘖节局部合成的细胞分裂素运输至分蘖芽中促进分蘖的发生。细胞分裂素信号转导是基于一个双元组分系统, 通过磷酸基团在主要组分之间的连续传递而实现的, 拟南芥A型ARR是水稻A型OsRR的同源基因, A型ARR信号接收区保守的天冬氨酸残基被认为可接受B型ARR或者AHP(拟南芥磷酸转运蛋白)的磷酸基团而调节其活性, 是执行细胞分裂素生理功能的效应元件[30]。Leibfried等[31]研究发现ARR基因可能负调控分生组织的大小, ARR 5、ARR6、ARR7和ARR15能够直接被WUS抑制, 这种抑制作用可能是分生组织保持其正常功能所必需的。生长素可以直接激活ARR 7和ARR15的表达, 从而拮抗细胞分裂素的作用, 说明A型ARR基因是细胞分裂素信号转导途径的负调控因子[32]。目前在水稻中鉴定出的A型RR共有13个, 本研究发现OsRR 7、OsRR11在突变体分蘖芽和分蘖节中都显著下调, OsRR6只在分蘖芽中出现下调, 这些基因表达量的降低增强了细胞分裂素的作用, 从而促进分蘖芽的生长发育。OsTB1与玉米的TB1基因同源, 是水稻侧向分枝的负调节因子, 调节侧芽的生长。过量表达OsTB1的转基因水稻由于腋芽形成受到影响导致分蘖数显著减少, OsTB1功能丧失型突变体fc1分蘖数显著增加[20]。Minakuchi等[33]发现OsTB 1 是一个作用于独脚金内酯下游的基因, 是多条信号调节通路的一个节点。外源GR24处理豌豆腋芽, 发现TB 1 的转录水平上调, 而用CTK或者蔗糖处理时, TB 1 的转录受到抑制[34-35]。Dun等[8]也发现SLs和CTK在腋芽生长调控中具有拮抗作用, 这种拮抗作用至少部分是通过调控TB 1的表达来实现的。本研究OsTB1 在突变体分蘖芽中表达下调, 这与突变体的表型及前人的研究结果是一致的。
水稻分蘖由分蘖芽发育而来, 植物激素在其伸长生长过程中起着关键作用。刘杨等[36]研究了外源激素对水稻分蘖芽生长和分蘖相关基因的调控效应, 表明外源激素对水稻分蘖芽生长的调控至少存在两条途径, 即通过调控CTK和SLs的合成及信号转导进而调控下游目标基因的表达来实现。本研究的结果也验证了上述结论, 外源NAA处理抑制了D12W191分蘖芽的生长, 同时发现外源NAA处理抑制了OsIPT 4、OsIPT5、OsIPT8的表达, 而使OsCKX1、OsCKX4、OsCKX5、OsCKX9及OsTB1的表达上调, 说明突变体分蘖芽内细胞分裂素含量减少能够抑制其自身的生长。
综合以上试验结果, 可以推测突变体D12W191出现多分蘖的原因:EMS诱导引起某个基因突变或miRNA等表达紊乱→CTK合成基因表达上调, 降解基因表达下调; CTK含量上升→CTK信号转导增强→分蘖负调控因子OsTB 1 的表达受抑制→水稻分蘖增多。该推断还需进一步分子试验进行验证。
4 结论分蘖芽中较高的CTK含量和较低的IAA/CTK值, 更有利于分蘖的形成, 较高的CTK积累量是突变体D12W191产生多分蘖表型的一个重要原因; 外源NAA处理抑制了OsIPTs基因表达但促进了OsCKXs基因的表达, 从而使D12W191分蘖芽内细胞分裂素含量降低, 导致分蘖芽生长受到抑制。
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