纺锤体是细胞分裂过程中形成的重要细胞器,其结构在进化上高度保守,是染色体正确排列和分离的基础,在细胞分裂后期染色体分离过程中具有重要作用^[1]。与有丝分裂纺锤体不同的是,卵母细胞减数分裂纺锤体是由很多微管组织中心(microtubule organizing center,MTOC)形成的无中心体的两极纺锤体。微管是一种动态的高分子物质,它的长度通过微管末端竞争性的聚合和解聚反应来控制,这种调控是通过动力和非动力蛋白如微管解聚动力蛋白来实现。这两种互相交联的微管端与端间的距离通过动力蛋白来增加反平行滑动,其他与这种作用相反的蛋白能拮抗这种蛋白的作用,这两种相反作用的力量有助于维持纺锤体的大小^[2]。

非动力蛋白和动力蛋白在丝/苏氨酸蛋白酶磷酸化的作用下被激活,从而促进纺锤体在时空上的编排;Aurora激酶是一类丝/苏氨酸激酶。在哺乳动物细胞内主要有3种Aurora激酶,即Aurora-A、Aurora-B和Aurora-C^[3]。Aurora-C主要分布在哺乳动物睾丸中,目前发现其功能与Aurora-B类似^[4]。Aurora-B激酶是一种染色体乘客蛋白,在细胞内与INCENP、borealin、survivin等共同组成染色体乘客蛋白复合物,该复合物在细胞有丝分裂中起着调节染色体精确分离、组蛋白修饰和胞质分裂的作用,Aurora-B被认为是胞质分裂所必需的蛋白^{[5, 6]}。在有丝分裂中,Aurora-A主要分布在中心体和纺锤体附近,与中心体成熟与分离、有丝分裂启动、分裂中期染色体排列、纺锤体组装和胞质分裂等环节有关^[6]。由此可见,Aurora-A在有丝分裂进程中发挥了重要的调节作用,但其在哺乳动物卵母细胞减数分裂进程中的作用和机制迄今仍知之甚少。

MLN8054是Aurora家族的专一性抑制剂,表现为在体外酶测试中对Aurora-A的抑制活性是Aurora-B的40多倍,而在细胞测试中是Aurora-B的150多倍^[7]。因此,通常将MLN8054作为Aurora-A的选择性抑制剂,且其抑制作用类似于使用siRNA干扰和显微注射Aurora-A抗体,降低Aurora-A表达^{[8, 9]}。本试验以体外成熟培养的猪卵母细胞为研究对象,通过MLN8054特异性抑制试验进一步分析Aurora-A在卵母细胞减数分裂进程中的作用及调节机制。

猪卵巢采自南京元润食品有限公司屠宰场,置于添加青、链霉素的37 ℃生理盐水中,1 h内送达实验室。用37 ℃ PBS洗2次后用抽吸法采集2~5 mm卵泡卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COC),捡取胞质均匀、紧密包被3层及以上的卵丘细胞的COC移至含10%猪卵泡液(porcine follicular fluid,pFF)、10 μg·mL^-1人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)、10 μg·mL^-1孕马血清促性腺素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)和69 μg·mL^-1 L-Cys的TCM199培养液中,置于38.5 ℃、饱和湿度和体积分数为5%的CO₂培养箱中进行体外成熟培养。根据试验设计,分别于体外成熟培养30和44 h分别收集MⅠ期和MⅡ期卵母细胞,进行相应的免疫荧光染色分析。

为探讨Aurora-A对猪卵母细胞体外成熟的影响,将所采集的COC随机分成2组,一组COC不处理,另一组则用透明质酸酶消化成祼卵(denuded oocyte,DO)后进行后续试验。MLN8054为Aurora-A特异性抑制剂。将所获的COC或者DO随机分组,分别置于添加0、1、3和5 μmol·L^-1 MLN8054(S1100,Selleck,按说明以DMSO稀释)培养液中进行体外成熟培养,分析Aurora-A抑制后对卵母细胞成熟进程及细胞骨架的影响。虽低浓度DMSO对细胞的化学毒性极小^[10],但为排除其对卵母细胞的影响,对照组只用同等浓度DMSO处理。

将所收集卵母细胞样品,用4%多聚甲醛室温固定30 min后转入含1% TritonX-100的PBS中室温通透8 h,再用封闭液(1% BSA)封闭1 h后,于异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的鼠α-Tubulin(1∶200)单克隆抗体(F2168,Sigma)中孵育2 h,洗涤3次,再经Hoechst 33342(B2261,Sigma)染核10 min,最后用甘油封片,在激光共聚焦显微镜下观察分析。

利用激光共聚焦显微镜(LSM710),根据需要选择观察倍数(50、100、200或400),以单通道或多通道分别观察细胞并拍照,分析卵母细胞GV期、Pro-MⅠ期、MⅠ期、AITⅠ期和MⅡ期染色体形态及微管蛋白表达。纺锤体和染色体分别经FITC和Hochst 33342染色定位,在激光共聚焦显微镜下观察。

收集MⅠ期待检测卵母细胞约100个,移入12 μL含有5% 2-巯基乙醇的蛋白电泳上样缓冲液中,置于沸水中10 min,冰上冷却后瞬时离心,-20 ℃冻存。微量加样器上样,恒压80 V电泳至样品位于浓缩胶边缘,改为恒压120 V电泳1.5 h;运用半干转膜仪,恒压20 V 0.5~2.0 h,转蛋白至PVDF膜;膜转至封闭液中(含50 g·L^-1脱脂奶粉的TBST)室温下摇床振荡2 h;膜移至封闭液稀释的一抗中4 ℃放置过夜;TBST(10 mmol·L^-1 Tris,150 mmol·L^-1 NaCl,0.05% Tween 20,pH₇.5)洗3次,每次10 min;膜移至封闭液稀释的二抗中室温振荡2 h;TBST洗3次,每次10 min;将膜上液体吸干,配制新鲜的化学发光底物酶(Merck millipore,WBKLS0100),放入凝胶成像仪,根据情况选择曝光时间。

每组试验重复3次,抑制剂处理时每组卵母细胞数不少于60枚。试验数据均以平均数±标准误(x±SE)表示,采用SPSS 16.0软件进行方差分析和差异显著性检验。

与对照组相比,猪卵母细胞经不同浓度的MLN8054处理后,处理组COC的卵丘细胞扩散受到明显抑制(图 1-A),同时卵母细胞第1极体(pbⅠ)排出率也显著降低,并呈MLN8054剂量依赖性(图 1-B),对照组卵母细胞pbⅠ排出率为81.63%,而在MLN8054处理组中(分别添加1、3和5 μmol·L^-1),pbⅠ排出率分别降至69.02%、56.14%和34.09%,与对照组相比均差异显著。为排除卵丘细胞对试验结果的影响,进一步以裸卵(DO)为材料,结果显示3 μmol·L^-1 MLN8054处理组pbⅠ排出率较对照组显著下降(54.62%对24.44%,P<0.01)。

	图 1 MLN8054对猪卵母细胞(减数分裂)成熟的影响(A)及pbⅠ排出率统计(B) Fig. 1 MLN8054 effects on porcine oocyte meiosis maturation(A)and discharge percentage of pbⅠ(B) a1、a2:44 h卵丘卵母细胞复合物 Cumulus oocyte complexes(COC)at 44 h;b1、b2:44 h裸卵 Denuded oocyte(DO)at 44 h * P<0.05,** P<0.01. The same as follows.
图选项

将上述未成熟的卵母细胞进行Hoechst 33342染色,应用共聚焦显微镜观察其染色体发育情况,统计细胞发育时期。如图 2所示：与对照组相比,经MLN8054处理后各组阻滞在Pro-MⅠ期的卵母细胞比例显著升高(32.96%,n=78对62.16%,n=103对83.98%,n=96),而阻滞在MⅠ期(41.68%对34.54%对16.08%)以及AI-TⅠ期(25.36%对3.30%)的卵母细胞则显著降低,且当MLN8054浓度达到5 μmol·L^-1时,也未发现有处于AI-TⅠ期的卵母细胞。

	图 2 MLN8054对猪卵母细胞减数分裂进程的影响 Fig. 2 MLN8054 effects on porcine oocyte meiosis process
图选项

应用免疫荧光染色和激光共聚焦显微成像技术,观察MLN8054处理后的猪卵母细胞纺锤体、染色体形态结构变化,统计形态异常率。由图 3可见:对照组纺锤体,大多呈现规则典型的猪卵母细胞纺锤体状,并且染色体排列在纺锤体赤道板上;而处理组卵母细胞的纺锤体则大多呈现为排列不规则,甚至无纺锤体出现等各种异常情况,染色体也随之无规律排列,处理组纺锤体异常率显著高于对照组(28.60%,n=140对53.91%,n=102,P<0.05)。

	图 3 MLN8054处理影响pAurora-A和pTACC3(Bar=20 μm) Fig. 3 MLN8054 on meiotic spindle organization of porcine MⅠoocytes 染色体Chromosome:蓝色blue;纺锤体Spindle:绿色green
图选项

由图 4可见:与对照组中磷酸化Aurora-A(pAurora-A)有明显的表达相比,3 μmol·L^-1 MLN8054处理后检测到的pAurora-A的表达很低(图 4-A)。同样,与对照组相比,磷酸化酸性卷曲转化相关蛋白3(pTACC3)表达明显下降(图 4-B),pTACC3蛋白相对表达强度(pTACC3/GAPDH)也证实了Aurora-A抑制对pTACC3表达的影响。

	图 4 MLN8054处理影响pAurora-A和pTACC3表达的电泳图(A)和统计图(B) Fig. 4 Electrophoresis(A)and statistical figure(B) of MLN8054 effects on pAurora-A and pTACC3 expression
图选项

目前,对于Aurora-A的研究主要集中在肿瘤细胞和体细胞上,研究表明Aurora-A在有丝分裂中发挥了重要作用,但有关Aurora-A在卵母细胞中的研究并不多见,尤其是在哺乳动物更鲜有报道。本研究采用Aurora-A激酶的特异性抑制剂MLN8054探讨Aurora-A在猪卵母细胞减数分裂中的作用。结果显示卵母细胞经MLN8054处理后,成熟率受到显著抑制,并主要阻滞在Pro-MⅠ期,其卵母细胞纺锤体形态异常率也显著升高;磷酸化Aurora-A和其下游蛋白磷酸化TACC₃的表达显著降低。

本试验结果表明,随着MLN8054浓度的增加,猪卵母细胞的成熟率明显下降,大多数卵母细胞停留在Pro-MⅠ期。对非洲蟾卵的研究表明,在分裂的卵细胞中Aurora-A主要伴随着纺锤体分布^[8]。Saskova等^[11]对小鼠卵母细胞成熟过程中的检测结果表明,Aurora-A在GV期主要分布在微管组织中心(MTOC),MⅠ期和MⅡ期主要分布在纺锤体和胞质中MTOC周围。Yao等^[12]研究表明,Aurora-A在猪卵母细胞中表达稳定,它的功能与纺锤体有一定的相关性。Manfredi等^[7]用MLN8054处理人的肿瘤细胞HCT-116和PC₃,体外成熟培养后细胞停留在G₂/M期。据此推测,Aurora-A与卵母细胞的成熟和纺锤体组装密切相关,且其作用主要表现在减数分裂的前中期。

猪卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)后,染色体发生凝集,MTOC发出微管,染色体的周围,形成双极纺锤体^[13]。Yao等^[12]用秋水仙碱破坏猪卵母细胞纺锤体组装后,Aurora-A不再定位在纺锤体附近,而散布在胞质中。本试验中猪卵母细胞经MLN8054处理后,纺锤体异常率显著升高,且多出现单极或多极纺锤体,部分细胞中的染色体排列紊乱。这一结果与Glover等^[14]在有丝分裂中检测的结果相似,一旦Aurora-A激酶的功能遭到破坏,纺锤体极出现显著的异常,包括纺锤体出现单极结构,纺锤体极上有缺陷的、稀少的或较短的星体微管。Lioutas等^[13]在Hela细胞中验证Aurora A活性对于维持中期纺锤体极的稳定和组装极其重要,且其活性受抑制会影响后期染色体分离的进程。由此推测,Aurora-A功能的缺损,可导致卵母细胞内纺锤体组装受阻,使之难以维持正常的成熟。

Aurora-A激酶的激活需要Thr288位点的磷酸化^[7]。MLN8054通过竞争性的作用于疏水性的ATP结合口阻碍Aurora-A激酶的磷酸化^[9]。本试验结果显示磷酸化Aurora-A在MLN8054处理后,表达量显著降低,从而验证MLN8054降低Aurora-A激酶活性。TACC是Aurora-A激酶的一个下游底物。有研究表明在果蝇和爪蟾中,Aurora-A负责招募TACC到中心体上,并将其磷酸化^{[15, 16]}。磷酸化的TACC与网格蛋白的重链形成复合物,该复合物连接在星体微管末端,可对抗MCAK(mitotic centromere associated kinesin)对微管的解聚作用,将微管稳定在中心体周围^{[17, 18]}。本研究发现,卵母细胞在Aurora-A激酶活性降低后,MⅠ期磷酸化TACC₃表达量显著降低,表明在猪卵母细胞中Aurora-A通过磷酸化其下游蛋白TACC₃,调控纺锤体组装,促进卵母细胞成熟。