AP2/EREBP转录因子家族是植物特有的一类转录因子,与植物激素脱落酸(abscisic acid,ABA)和糖都有关^[1]。在番茄果实中,AP2转录因子在绿色果实、转色期果实、红色果实中均有表达,在转色期果实中表达量最高,表明AP2与果实发育有关^[2]。拟南芥中的转录因子ABI4属于AP2家族^[3],在ABA和蔗糖信号中发挥作用^[4]。拟南芥ABI4可与ABA应答元件ABRE(ABA responsive element)结合调控胚胎和幼苗中基因表达,使植物对逆境冷、盐和渗透压胁迫产生应答^[4]。玉米中的ABI4可与一个启动子耦合元件(coupling element,CE1)相结合来调控很多ABA相关基因的表达,比如Em6和其他的胚胎发育晚期丰富蛋白LEA(late embryogenesis abundant protein)基因的表达,而且还可以与糖应答基因ADH 1 基因的启动子结合调控其表达水平,以及调控糖应答基因一个编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶亚基APL 3 基因的表达,转玉米ABI4的拟南芥abi 4 突变体可恢复其对糖的敏感性^[5],这说明转录因子ABI4可参与ABA和糖信号路径调控植物的发育。在草莓果实中的研究工作也发现,抑制ABA受体基因FaPYR 1 或ABA信号组分中的基因FaABAR的表达量时也抑制了草莓果实中转录因子FaABI 4 基因的转录水平^{[6, 7]}。蔗糖和ABA信号路径是草莓果实发育成熟的核心组分,FaABI4转录因子参与蔗糖和ABA信号路径,这暗示了草莓转录因子ABI4可能作为正调控因子参与草莓果实的成熟调控。草莓果实发育成熟是有一个复杂的信号网络调控的,但是信号网络中还有很多组分需要分析鉴定,转录因子FaABI4功能的鉴定可为完善果实发育成熟的信号网络奠定重要的基础。

草莓果实不仅具有重要的经济价值,而且成熟过程中从外到内发生了包括色素和糖的积累等一系列复杂的变化,并且草莓由于栽培简便、果实发育期短、持续结果能力强,种子暴露在外等特点,尤其是草莓果实中农杆菌介导的基因瞬时表达体系的建立,使得草莓成为研究非呼吸跃变型果实发育成熟的理想试验材料^[8]。为此,本研究以草莓果实为试材,通过瞬时调控转录因子FaABI 4 基因在草莓果实中的表达,分析其对草莓果实发育成熟的影响,以及对糖及ABA信号路径及成熟相关基因的影响,进一步揭示草莓果实的成熟机制。

试材为‘甜查理’草莓(Fragaria × ananassa Duch‘Sweet Charlie’),于2014年12月中旬开始取样,取自江苏农业科学院试验基地。采集花后7~28 d的果实,参照文献^[9]并根据果实大小、硬度和色泽将果实划分为7个时期:小绿(幼果期,花后7 d)、大绿(大果期,花后14 d)、浅绿(绿熟期,花后18 d)、纯白(白熟期,花后21 d)、始红(始熟期,花后23 d)、片红(转色期,花后25 d)、全红(成熟期,花后28 d)。每个时期样品设置3个重复。摘取鲜样后立即用刀片将果肉与种子分离,收集果肉液氮冷冻,贮存于-80 ℃超低温冰箱中待用。

对7个时期样品分别提取总RNA,并加入DNaseⅠ酶去除DNA污染,体系为:2 μL DNaseⅠ酶,45 μL总RNA,5 μL DNaseⅠ酶Buffer。37 ℃放置12 min,然后用RNA清洁试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)纯化RNA。以提取的总RNA为模板,利用Clontech SMARTTM Library试剂盒(Clontech)合成cDNA第一链,用于扩增FaABI 4 基因。

从草莓基因组数据库(https://strawberry.plantandfood.co.nz/index.html)中检索到FaABI 4 基因序列,其登录号为:Gene 21003。设计FaABI 4 基因的全长引物:上游:5′- GAGCTCATGGACGAAGACACTTC-3′,下游:5′- CCCGGGATCAAATCCTTTAAAATCCA-3′,上游和下游引物的下划线分别为SacⅠ和SmaⅠ酶切位点,以方便反向连接到植物双元表达载体pBI121上,用于FaABI 4 基因的干扰。PCR反应条件为:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物经回收、纯化,与pMD19-T Vector(购自宝生物工程公司)连接,转化DH5α(天根公司)感受态细胞,蓝白斑筛选后交由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

利用软件Primer Premier 5设计了荧光引物。引物FaABI 4 上游:5′-TGTCTATGTCTTCGCAGC-3′,下游:5′-ATCACCGTAGTAGTCCCAG-3′;FaCHS(登录号:XM_004306495)上游:5′-GCTGTCAAGGCCATTAAGGA-3′,下游:5′-GAGCAAACAACGAGAACACG-3′;FaUFGT(AY575056)上游:5′-GGTAAGCCACAGGAGGACA-3′,下游:5′-TATGAGCACCGAACCAAAA-3′;FaACTIN(AB116565.1)上游:5′-TGGGTTTGCTGGAGAT-GAT-3′,下游:5′-CAGTTAGGAGAACTGGGTGC-3′。以FaACTIN为内参基因,按照SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒(宝生物工程有限公司)操作指导,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法,检测基因的稀释相对表达量。对反转录所得的cDNA分别进行5个梯度(1、10^-1、10^-2、10^-3和10^-4)稀释,实施荧光定量反应,然后绘制相对标准曲线。 相关基因和内标ACTIN基因荧光定量RT-qPCR扩增的总反应体系为20 μL ,包括:10 μL SYBR Premix Ex Taq混合液,2 μL cDNA,0.4 μL上游引物(10 μmol · L^-1),0.4 μL下游引物(10 μmol · L^-1),7.2 μL无核酸污染的灭菌水。反应程序为:94 ℃ 2 min,94 ℃ 20 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40个循环,每次循环第3步进行荧光采集。最后从60 ℃升温至95 ℃,每隔30 s上升0.5 ℃,总共71个循环。检测其荧光值,绘制熔点曲线。标准品cDNA和待测样品均3次重复。

载体构建参照Chai等^[7]的方法。将构建好的载体通过液氮冻融法转入农杆菌GV3101中,待长出菌斑后,挑取菌斑放入5 mL含抗性卡那霉素和利福平的离心管中;28 ℃培育,之后转入50 mL LB培养基中再次进行培养(加入卡那霉素和利福平,10 mmol · L^-1 MES和20 μmol · L^-1乙酰丁香通),过夜摇菌;第2天进行富集菌液后放入侵染缓冲液(10 mmol · L^-1 MgCl₂,10 mmol · L^-1 MES,20 μmol · L^-1乙酰丁香通)中,调D₆₀₀至0.8~1.0,然后室温震荡4 h。取1 mL菌液注射花后14 d(大绿期)的草莓果实,然后取注射后0、7和14 d的果实并拍照,分析其生理及分子指标。3次重复。

利用SPSSPASW Statistics 17.0对数据进行统计分析,采用Duncan′s法进行差异显著性检验。

为了克隆草莓ABI 4 基因(FaABI 4 ),我们根据已经发表的玉米ABI4蛋白序列(GenBank登录号:XM_008651329.1)用于草莓基因库的搜索。结果发现与基因位点Gene 21003的蛋白序列很相似,基于它们的特异性引物,从草莓品种‘甜查理’中扩增出编码FaABI4蛋白的mRNA序列,开放阅读框长度为990 bp(图 1)。编码1个含330个氨基酸的蛋白质。

	图 1 FaABI 4 基因全长扩增Fig. 1 The amplified full-length of FaABI 4 geneM:DL 2000 marker;1,2:FaABI 4
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利用ClustalX软件,通过与其他物种拟南芥(AF040959.1)、亚麻荠(XM_010510591.1)、芜菁(XM_009144988.1)、醉蝶花(XM_010556372.1)、苹果(XM_008364521.1)、香瓜(XM_008443418.1)、玉米(XM_008651329.1)、甜菜(XM_010691143.1)、梅花(XM_008235561.1)、毛果杨(EF151452.1)和葡萄(XM_010659951.1)的ABI4蛋白进行序列比对,发现ABI4蛋白在物种中有个高度保守的区域,为AP2区域,约含有60个氨基酸残基,它是ABI4转录因子进行DNA结合调控其他基因表达的特异区域(图 2)。

图 2 草莓FaABI4蛋白的保守域和氨基酸一致性比较Fig. 2 The conserver domain and identity of amine acid from strawberry and other species1)框内标注的是AP2保守区域。Box is conserver domain of AP2 area. 2)At:拟南芥Arabidopsis thaliana;Cs:亚麻荠Camelina sativa;Br:芜菁Brassica rapa;Th:醉蝶花Tarenaya hassleriana;Bv:甜菜Beta vulgaris;Md:苹果Malus × domestica;Pm:梅花Prunus mume;Fa:草莓Fragaria × ananassa;Vv:葡萄Vitis vinifera;Pt:毛果杨Populus trichocarpa;Cm:香瓜Cucumis melo;Zm:玉米Zea mays

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利用MEGA 5软件将草莓FaABI4蛋白序列与其他物种的ABI4蛋白序列进行分析构建进化树。由图 3可见:草莓与梅花的亲缘关系最近,与苹果、葡萄、毛白杨在同一个小分支上,与醉蝶花、芜菁、拟南芥、香瓜在次分支上,与甜菜、香瓜、玉米的关系最远。

	图 3 草莓FaABI4转录因子的进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of FaABI4 from strawberry plant transcription factor
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为了分析草莓中FaABI 4 基因的表达模式,分别提取了草莓果实发育7个时期的总RNA进行FaABI 4 基因表达量的检测。结果(图 4)表明:在草莓果实中FaABI 4 基因的表达水平在小绿果和大绿果极低,然后随着草莓果实发育进程迅速增加,并在全红果阶段保持在非常高的水平。FaABI 4 的表达量和果实大小及颜色变化直接的关系表明FaABI 4 可以正向调节果实成熟。

	图 4 FaABI 4 基因在草莓果实发育中的表达量Fig. 4 FaABI 4 gene expression level in strawberry fruit development
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利用农杆菌介导的草莓瞬时基因表达系统对草莓FaABI 4 基因的表达量进行调控。用含有pBI121或pBI121-FaABI 4 质粒的农杆菌GV3101注射草莓果实。由图 5可见:在果实注射农杆菌后14 d,含有pBI121的农杆菌的果实已经全部上色,而注射含有pBI121-FaABI 4 农杆菌的果实只有部分上色。这表明在草莓果实中,FaABI 4 基因表达水平的干扰会延迟果实上色。

	图 5 农杆菌侵染后草莓果实发育情况Fig. 5 Strawberry fruit development after Agrobacterium infection1)对照:含有pBI121质粒的农杆菌侵染的果实Control:Fruit of Agrobacterium containing pBI121 plasmid infection;FaABI 4 基因干扰:含有pBI121-FaABI 4 质粒的农杆菌侵染的果实FaABI 4 -RNAi:Fruit of Agrobacterium containing pBI121-FaABI 4 plasmid infection 2)0、7、14 d表示草莓注射农杆菌后的天数。0,7,14 d indicate the days after Agrobacterium infection in strawberry fruit.
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由图 6可见:FaABI 4 基因的变化降低了草莓果实中蔗糖含量,同时花色苷的含量也下降一倍多,但提高了草莓果实的硬度,对ABA含量影响不大。pBI121注射后的草莓果实花色苷含量是pBI-FaABI 4 注射后的2倍。进一步通过分子水平进行验证发现,与对照果实相比,pBI121-FaABI 4 注射的果实中FaCHS和FaUFGT基因的表达量降低,这2个基因是花色苷合成过程中的关键酶基因,它们表达量的下降会直接导致花色苷含量的减少。因此FaABI 4 基因可以通过调控花色苷合成酶来影响果实花色苷的积累,进而影响果实的发育进程,在果实着色和成熟方面起着正向调控作用。

	图 6 FaABI 4 基因干扰后对果实生理及分子水平的影响Fig. 6 Effects of FaABI 4 gene interfere on fruit physiological and molecular levels不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level.
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植物处于逆境胁迫时能在生理和基因水平上做出调整,使植物对逆境产生应答。转录因子是植物进行应答外界环境的一类重要因子,使植物能尽快地适应逆境。因此植物体内存在着大量的转录因子,如拟南芥中15%的基因可能编码转录因子。Jofuku等^[10]从拟南芥中分离到第1个AP2转录因子,它与花发育有关。随后Liu等^[11]发现AP2转录因子不仅与花器官有关,而且调控根、叶、果实、种子等器官的生长发育和胁迫应答。但是对AP2的研究大都集中在其逆境应答及花发育方面的研究,其对果实发育的调控作用研究较少。

转录因子ABI4属于AP2家族,在拟南芥、玉米等植物中已研究很广泛^{[12, 13]},但是在草莓果实中却很少有研究。基于已经发表的其他物种的序列和草莓基因组库,我们在草莓果实中分离到1个990个碱基长度的ABI4转录因子。与其他物种一样,它也含有1个高度保守的57个氨基酸序列的AP2保守区域,并且与梅花、苹果和葡萄的亲缘关系最近。AP2类转录因子参与水杨酸、茉莉酸、乙烯、脱落酸等多种信号转导路径,而且某些家族成员是逆境信号交叉途径中的关键因子,这些信号路径与果实的发育关系密切。Chung等^[2]发现AP2转录因子在果实发育及成熟过程中表达,但是在花和叶中检测不到表达量,这说明AP2转录因子在番茄果实发育过程中起着重要的作用。我们研究发现ABI4转录因子在草莓果实发育过程中表达量是逐步增加的,到果实成熟时期,表达量最高。ABI4转录因子是ABA信号路径的下游组分,而ABA是草莓等非呼吸跃变型果实成熟的关键因子,ABA可以促进果实对蔗糖的积累,促进果实着色和提高苯丙氨酸解胺酶(PAL)的活性^{[6, 14]},因此ABI4在草莓果实发育过程中可能正向调控果实的发育及成熟进程。Alba等^[15]利用微阵列表达谱,同时结合番茄功能基因组数据库,分析表明AP2转录因子的表达与果实成熟启动有关。本研究结果发现,在FaABI 4 基因表达水平下降后,与对照相比,果实出现了部分不能正常上色的情况。进一步对不能上色部分的果实进行生理及分子水平分析发现,与对照相比,ABA水平没有很大的变化,这是因为虽然ABA水平并没有受影响,但是其下游ABI4路径出现了变化,因此导致下游其他的基因表达水平也发生了变化,最后出现了花色苷积累路径中最关键的2个基因FaCHS和FaUFGT的表达量下降,使花色苷积累水平也下降,而且伴随着果实硬度的变化和果实蔗糖含量低。总之,草莓中FaABI4转录因子通过影响果实花色苷和硬度以及蔗糖的积累水平进而调控了草莓果实发育成熟的进程。该研究有助于深入揭示果实发育信息传递的分子机制,也为今后草莓的分子改良育种奠定重要的基础,为草莓的育种工作提供思路。