近年来随着对天然抗氧化剂研究的深入,从植物、动物、微生物等原料中采用酶法降解和分离提取抗氧化多肽的报道也逐渐增多。与人工合成的抗氧化剂如丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)等相比,这些多肽具有分子质量小、结构简单、活性强、易于吸收及无毒害等优点^[1]。目前,从植物中提取抗氧化肽的研究多见于大豆、豌豆、大米等原料中^{[2, 3, 4]},从动物和微生物中提取抗氧化肽的研究多见于奶、鱼、肉制品等原料中^{[5, 6, 7, 8]}。研究发现,抗氧化肽对清除人体新陈代谢过程中产生的自由基、维持组织器官的正常细胞代谢具有重要作用^[9]。因此,开发研制具有抗氧化功能的天然添加剂具有重要意义。

宣威火腿产自于我国云南省宣威市,是与金华火腿、如皋火腿齐名的中国传统肉制品之一。传统的宣威火腿加工时间长达16个月,在发酵成熟的过程中,蛋白质和脂肪均在酶的作用下发生水解,并产生丰富的风味物质^[10]。肌肉蛋白经内源酶降解后可形成不同分子质量大小的多肽片段,这些多肽不仅赋予了火腿良好的感官风味,而且部分多肽还具有抗氧化、抗高血压的功效^{[9, 11]}。

对于宣威火腿的研究,目前主要集中在加工工艺标准化、风味物质的鉴定、菌落微生物的生成、发酵过程中蛋白质降解等方面^{[12, 13, 14, 15]},而对其中可能含有的多肽、氨基酸的提取和抗氧化活性物质的鉴定等方面还没有相关的报道。因此,本试验以宣威火腿为材料,提取其在长期发酵过程中形成的粗肽,并测定其清除自由基及螯合金属离子能力,以此研究宣威火腿粗肽的抗氧化活性,从而为解释其长期发酵成熟过程中的蛋白质变化及食用后对人体的保健效果提供了理论基础。

试验所选取的火腿材料均购于云南省宣威市浦记火腿食品有限公司。选取经传统加工工艺发酵成熟后约16个月的后腿瘦肉,随机抽取6份样品于-20 ℃冰箱中保存。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、丁基羟基甲苯(BHT)和谷胱甘肽(GSH)购于美国Sigma公司;四氮唑蓝(NBT)、还原型辅酶(NADH)和吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)购于国药集团;其他试剂均为分析纯,购于南京建成化学试剂公司。

T25匀浆机购于德国IKA公司;RE-52AA旋转蒸发器购于上海亚荣生化仪器厂;冷冻干燥机购于德国Christ公司;Spectral Max M2e多功能酶标仪购于美国伯腾仪器有限公司;UV-2450购于日本岛津公司;水浴锅购于德国优莱博公司。

参考Zhu等^[8]的方法,并略作改进。取发酵成熟16个月的火腿产品后腿肉,去除瘦肉中肌腱及肌膜,切碎斩匀后准确称取30 g,加入90 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol · L^-1,pH 7.2);22 000 r · min^-1,匀浆3次,每次10 s,中间间歇10 s。取火腿匀浆液于4 ℃下静置20 min后,4 ℃、12 000 g离心20 min;取上清液先用滤纸过滤,再加入3倍体积的40%(体积分数)的乙醇溶液,4 ℃下静置12 h后,4 ℃、12 000 g离心10 min。最后取上清液用0.45 μm滤膜过滤,旋转蒸发器浓缩,经冷冻干燥后即为粗肽粉,-20 ℃冰箱中保存。

参考Church等^[16]的方法并适当改进。邻苯二甲醛混合试剂的配制方法:取40 mg邻苯二甲醛溶解于1 mL甲醇中,依次加入25 mL四硼酸钠溶液(0.1 mol · L^-1)、2.5 mL SDS(20%,质量分数)和100 μL β-巯基乙醇,最后用去离子水将溶液定容至50 mL。为保证试验数据准确性,试剂现用现配。取100 μL质量浓度为1 mg · mL^-1的粗肽液(水溶液)与2.0 mL邻苯二甲醛混合试剂,室温下孵育2 min。采用紫外分光光度计测定反应液在340 nm波长处的吸光值。用胰酪蛋白胨作为标准蛋白配制梯度溶液,并测定其吸光值,制定标准曲线后计算出宣威火腿粗肽粉中的多肽含量,并计算多肽提取率。

参照Liu等^[17]的方法,并作适当修改。宣威火腿粗肽液、NBT、NADH、PMS均用Tris-HCl缓冲溶液(50 mmol · L^-1,pH 8.0)配制。取质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg · mL^-1的粗肽液各1.5 mL,依次加入0.5 mL NBT(300 μmol · L^-1)、0.3 mL NADH(468 μmol · L^-1)及0.5 mL PMS(60 μmol · L^-1),混匀后置于25 ℃水浴5 min,取出后在560 nm波长处检测其吸光值记为A_样品,将Tris-HCl缓冲溶液代替宣威火腿粗肽液作为空白对照记为A₀。按照下列公式计算宣威火腿粗肽对O₂^·的清除率:O₂^·清除率=(1-A_样品/A₀)×100%。

同时,配制相同质量浓度梯度的GSH作为对照,按照上述方法测定其对超氧自由基(O₂^·)的清除情况。

参考Sheih等^[18]的方法,并作适当改进。用去离子水将宣威火腿粗肽粉配制成质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg · mL^-1的溶液,取1 mL粗肽液与1 mL DPPH自由基溶液[0.2 mmol · L^-1,95%(体积分数),乙醇溶解],充分混匀后于室温下避光放置30 min。517 nm波长处检测混合溶液的吸光值记为A_样品,1 mL 95%乙醇与1 mL去离子水混合为空白对照,吸光值记为A₀;1 mL DPPH自由基溶液与1 mL 95%乙醇混合作为对照组,吸光值记为A_对照。宣威火腿粗肽对DPPH自由基清除率的计算公式为:DPPH自由基清除率=[1-(A_样品-A₀)/(A_对照-A₀)]×100%。

同时,配制相同质量浓度梯度的GSH和BHT作为对照,按照上述方法测定其对DPPH自由基的清除情况。

参考Lee等^[19]的方法并作相应的改进。用去离子水将宣威火腿粗肽配制成质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg · mL^-1的溶液,取1 mL粗肽液与0.05 mL FeCl₂(2 mmol · L^-1,超纯水溶解)混合,加入啡啰嗪(Ferrozine,5 mmol · L^-1)启动反应,剧烈摇动后室温下静置10 min。562 nm波长处检测混合溶液的吸光值记为A_样品,以去离子水代替样品作为对照测定其吸光值记为A_对照。宣威火腿粗肽液对Ferrozine-Fe²⁺复合物形成的螯合情况可用以下公式计算:Fe²⁺螯合率=(A_对照-A_样品)/A_对照×100%。
同时,配制相同质量浓度梯度的GSH和BHT作为对照,按照上述方法测定其对亚铁离子螯合的情况。

参考Zhu等^[8]的方法,并作相应修改。配制质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg · mL^-1的粗肽液,并以相同质量浓度的BHT和GSH为对照。取0.6 mL 5 mmol · L^-1邻二氮菲溶液加入0.4 mL磷酸缓冲溶液(0.2 mol · L^-1)充分混匀后加入0.6 mL粗肽液及0.6 mL EDTA二钠盐(pH 7.4),混匀,加入0.6 mL FeSO₄溶液(5.0 mmol · L^-1)及0.8 mL H₂O₂(0.1%),37 ℃水浴,保温1 h后测定其在536 nm波长处的吸光值记为A_样品;以去离子水代替样品作为损伤管测定其吸光值记为A_损伤;以去离子水代替H₂O₂,测定其吸光值记为A_未损伤。宣威火腿粗肽液对 · OH自由基的清除率计算公式为: · OH清除率=(A_样品-A_损伤)/(A_未损伤-A_损伤)×100%。

参考Jayaprakasha等^[20]的方法,配制质量浓度为5.0、10.0、15.0、20.0和25.0 mg · mL^-1的粗肽液,并以相同质量浓度的GSH作对照。磷酸盐缓冲溶液(0.02 mol · L^-1,pH 7.0)溶解0.56 g亚油酸和0.056 g吐温-20,定容至100 mL制备亚油酸乳化液。取2.0 mL粗肽液与0.5 mL无水乙醇、2.5 mL亚油酸乳化液及2.0 mL磷酸盐缓冲溶液(0.2 mol · L^-1,pH 7.0)混合;空白对照以去离子水和无水乙醇代替样品,将此混合体系置于37 ℃,避光。采用硫氰酸铁法检测过氧化值的变化:0.1 mL混合体系溶液与4.7 mL乙醇(75%)、0.1 mL硫氰酸铵(30%)混合,加入0.1 mL FeCl₂计时反应3 min,在500 nm波长处检测吸光值。0时刻测定的吸光值记为A₀,以间隔120 h后检测吸光值记为A_{120 h}。宣威火腿粗肽液抑制脂质氧化的计算公式为:脂质氧化抑制率=[100-(A_{样,120 h}-A_{样,0 h})/(A_{空,120 h}-A_{空,0 h})]×100%。

统计分析采用SAS(Win,V8)软件完成,用方差分析中的线性模型来分析单因素质量浓度对不同物质的抗氧化活性影响,Duncan′s Multiple-Range Test比较单个均值之间的差异性(P<0.05),试验重复数为5,从而降低偶然误差对试验数据的影响。 2 结果与分析 2.1 宣威火腿粗肽粉的提取

经提取得到的宣威火腿粗肽粉颜色呈乳白色,粗肽粉中多肽含量为60.00%,多肽提取率为3.44%,比Zhu等^[8]利用盐酸溶解方法所得的金华火腿肽类提取率高2.96倍。所得粗肽粉中含有少量的非肽类物质,其中可能含有大分子蛋白、脂肪酸及矿物离子等。

由图 1可知:随着质量浓度的增加,宣威火腿粗肽液和GSH对超氧阴离子自由基的清除效果均显著增强(P<0.05);0.1 mg · mL^-1的宣威火腿粗肽液对超氧阴离子的清除率为25.15%,为GSH清除率的6.2倍。同等质量浓度下,宣威火腿粗肽液对超氧阴离子自由基(O₂^·)的清除效果显著高于GSH。

	图 1 宣威火腿粗肽液和GSH对超氧自由基(O2·)的清除效果 Fig. 1 The scavenging effect of crude peptides from Xuanwei ham and GSH on O2·
图选项

由图 2可以看出:当质量浓度低于0.5 mg · mL^-1时,宣威火腿粗肽液对DPPH自由基的清除效果均低于3.00%;GSH和BHT对DPPH自由基的清除效果均高于10.00%,且GSH的清除率大于BHT;当质量浓度高于1.0 mg · mL^-1时,宣威火腿粗肽液和GSH的清除效果均随质量浓度的增加而增强,但清除率显著低于同等浓度的BHT。

	图 2 宣威火腿粗肽液、GSH和BHT对DPPH自由基的清除效果 Fig. 2 The scavenging effect of crude peptides from Xuanwei ham,GSH and BHT on DPPH
图选项

由图 3可见:随着质量浓度的增加,宣威火腿粗肽液、GSH和BHT的螯合金属离子能力均增强。质量浓度在1.0~5.0 mg · mL^-1之间时,宣威火腿粗肽液的Fe²⁺螯合率均在70.00%以上,变化幅度较小;GSH的Fe²⁺螯合率由18.61%增至63.02%,变化幅度最大;BHT的Fe²⁺螯合率呈缓步上升的趋势,5.0 mg · mL^-1时的金属螯合率为27.61%;宣威火腿粗肽液对Fe²⁺螯合能力显著高于GSH和BHT。

	图 3 宣威火腿粗肽液、GSH和BHT对Fe2+螯合效果 Fig. 3 The chelating effect of crude peptides from Xuanwei ham,GSH and BHT on Fe2+
图选项

由图 4可知:质量浓度为0.5~2.5 mg · mL^-1时,宣威火腿粗肽液、GSH和BHT对 · OH自由基的清除率均呈现逐步上升的趋势;与GSH和BHT相比,宣威火腿粗肽液对 · OH自由基的清除率增幅最小;质量浓度为2.5 mg · mL^-1的GSH和BHT的清除率分别达到了74.82%和86.78%,而宣威火腿粗肽液的清除率为20.61%,清除能力显著低于GSH和BHT(P<0.05)。

	图 4 宣威火腿粗肽液、GSH和BHT对 · OH自由基的清除效果 Fig. 4 The scavenging effect of crude peptides from Xuanwei ham,GSH and BHT on · OH
图选项

由图 5可知:随着质量浓度的增加,宣威火腿粗肽液和GSH对脂质氧化的抑制作用逐步增强,BHT对脂质氧化的抑制效果随质量浓度的增加没有显著变化。在5.0~20.0 mg · mL^-1范围内,宣威火腿粗肽液的抑制能力显著高于GSH。质量浓度为5.0 mg · mL^-1时,宣威火腿粗肽液对脂质氧化的抑制率为39.42%,是GSH抑制率的2.75倍;当质量浓度为25.0 mg · mL^-1时,宣威火腿粗肽液、GSH和BHT抑制脂质氧化的能力均达到85.00%以上,且差异不显著。

	图 5 宣威火腿粗肽液、GSH和BHT抑制脂质过氧化的效果 Fig. 5 The inhibition effect of crude peptides from Xuanwei ham,GSH and BHT on lipid oxidation
图选项

本试验通过测定粗肽液的抗氧化指标,发现宣威火腿粗肽液的抗氧化活性随质量浓度的增加而增强,对不同自由基的清除效果呈现较大差异。超氧自由基(O₂^·)因参与不饱和脂肪酸及其他活性物质的前期氧化而对机体造成氧化损伤^[21]。本试验中,同等质量浓度下宣威火腿粗肽液对超氧阴离子的清除率是GSH的2.0~6.2倍,说明宣威火腿粗肽中可能含有特有的可清除超氧阴离子自由基的基团,如酚羟基基团^[8]。

本研究中,不同质量浓度范围的GSH和BHT对DPPH自由基的清除效果差异显著,当质量浓度小于0.5 mg · mL^-1时,GSH对DPPH自由基的清除率高于BHT;当质量浓度高于1.0 mg · mL^-1时,BHT对DPPH自由基的清除率高于GSH。基于DPPH自由基和BHT均为脂溶性,在浓度较高时,其亲和力作用更加显著^[18];浓度较低时,GSH对DPPH自由基的清除作用则主要依靠巯基及酸性基团^[22]。Shi等^[23]研究提出,5×10³以下的短肽对DPPH自由基的清除效果最好,肽链越长,清除率越低,这与短肽具有的疏水作用相关。宣威火腿粗肽液所表现的清除效果可能与蛋白质降解过程中形成的短肽有关,而短肽的组成及相对分子质量的大小还有待于进一步研究。Xie等^[24]研究发现带有酚类基团的化合物可通过氢原子转移机制与DPPH自由基发生反应,但质子转移和电子转移的发生顺序与反应物的结构及反应介质的组成有关,因此宣威火腿粗肽中可能含有色氨酸、酪氨酸等带酚类基团的片段。

Wang等^[25]的研究发现,Fe²⁺是活性氧自由基形成的前体物质,其含量在体内的积累会加剧活性氧对DNA和脂质的氧化损伤。同时,Babbas^[26]研究发现在肉类消费较多的国家,人们患结肠癌的比率较高,且癌症患者的肠道中可检测出的Fe²⁺含量比正常人要高。由此可见,体内铁离子含量的增多可能是引发心血管疾病及癌症等慢性病的重要因素。本试验中宣威火腿粗肽液对Fe²⁺螯合能力显著高于GSH和BHT。Qian等^[27]研究中提出,短肽中暴露的中性和酸性氨基酸如Asp,因其带有游离的羧基基团而具有抑制金属离子产生自由基的作用。GSH的螯合金属离子能力较宣威火腿粗肽液低,可能与其分子结构中不含有游离的羧基基团有关。

本试验中,质量浓度为2.5 mg · mL^-1的宣威火腿粗肽液对 · OH自由基的清除率为20.61%,与GSH(74.82%)和BHT(86.78%)相比差异显著。郭瑶^[28]研究了罗非鱼皮胶原酶解液对 · OH自由基的清除效果,当质量浓度为2.5 mg · mL^-1时,其对 · OH自由基的清除率为30.00%,与宣威火腿粗肽液对 · OH自由基的清除率相比差异明显。H₂O₂/Fe²⁺体系对 · OH自由基的检测受抗氧化剂对Fe²⁺螯合能力的影响,即抗氧化剂对Fe²⁺螯合的能力越强,则会抑制Fenton反应的进行,进而可能造成检测结果偏低的现象^[20]。

Chen等^[29]研究发现,具有5个氨基酸以上的肽链具有更强的抑制脂质氧化的效果。在本试验中,宣威火腿粗肽液对脂质氧化的抑制能力高于GSH,可能与宣威火腿粗肽液中含有较多的5个氨基酸以上的肽链有关^[8];GSH肽链较短,亲水活性较强,因而其表现出较弱的抑制脂质氧化的能力。

通过磷酸盐缓冲溶液溶解提取的宣威火腿粗肽,经检测其具有清除O₂^·、DPPH、 · OH自由基及螯合Fe²⁺和抑制脂质氧化的能力,初步证实了宣威火腿在长期发酵成熟过程中会生成具有抗氧化活性的肽类物质。关于宣威火腿活性肽的抗氧化稳定性、氨基酸组成及消化吸收后的抗氧化活性等方面还有待进一步研究。