油茶(Camellia oleifera)是我国特有的、重要的木本食用油料树种，主要分布在我国秦岭-淮河以南14个省、市、自治区。炭疽病是油茶的主要病害之一，导致落叶、落花、落果，造成巨大经济损失(李河等，2017)。在前期的研究中，笔者采用形态学特征结合多基因序列分子鉴定，发现油茶成林炭疽病病原菌主要是属于胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)复合群成员，分别是果生炭疽菌(C. fructicola)、暹罗炭疽菌(C. siamense)、胶胞炭疽菌(C. gloeosporioides)、山茶炭疽菌(C. camelliae)、哈锐炭疽菌(C. horii)和卡斯特炭疽菌(C. karstii)6个种，其中果生炭疽菌分离率最高、分布范围最广(Li et al., 2016; 李河等，2014; 2017; Jiang et al., 2018)。

油茶苗圃主要采用甲基托布津或多菌灵(苯并咪唑类)和戊唑醇等内吸性杀菌剂防治油茶炭疽病(王义勋等，2014; 郑少华，2012)。但是，苯并咪唑类杀菌剂极易引起抗药性，其作用位点β-微管蛋白的单核苷酸突变就能引起病原菌产生抗性(Jung et al., 1992; 李河等，2012; 刘霞等，2013)。乙霉威与苯并咪唑类杀菌剂间存在负交互抗性，因此混合使用这2种杀菌剂效果较好，但陈聃等(2013)研究发现浙江省葡萄炭疽菌发生了乙霉威和苯并咪唑类杀菌剂双重抗性。目前，油茶苗圃炭疽病原菌种类尚不明确，不同种类炭疽病菌对多菌灵、乙霉威和戊唑醇等杀菌剂产生的抗药性是否存在差异也不清楚。本研究采用ApMat基因序列鉴定我国油茶苗圃炭疽病原菌种类，进一步揭示我国目前油茶苗圃炭疽病菌抗药性情况以及病菌种类是否与杀菌剂敏感性之间存在相关性，为防治油茶炭疽病提供依据。

1 材料与方法 1.1 样品采集和菌株分离

2017年7—8月，从湖南长沙、浏阳、攸县、道县，江西分宜，广东肇庆和海南澄迈7个地区的油茶苗圃采集了210个病叶样品。采用Cai等(2009)组织分离法和(或)单孢法分离炭疽病原菌，低温保存。

1.2 柯赫氏法则验证

采用黄俊斌等(1999)和李河等(2017)等的方法对分离获得炭疽属真菌进行形态学鉴定和柯赫氏法则验证，确定油茶苗圃炭疽病病原种类及种间致病力大小差异。

1.3 菌株DNA提取、PCR扩增及测序

用无菌牙签刮取约0.5 g菌丝，采用北京索莱宝科技有限公司生产的真菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，-20 ℃保存。使用引物对AM-F和AM-R扩增apn2和MAT1-2-1 基因(ApMat)的基因间区域并测序(Silva et al., 2012)。PCR反应程序：94 ℃ 5 min，接着95 ℃ 45 s、56 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，30个循环，然后72 ℃下延伸7 min (Shiori et al., 2017)。PCR扩增产物测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

1.4 系统发育分析

对本试验分离获得的95个炭疽病菌的ApMat序列(表 1)以及从GenBank数据库下载的33个参考菌株的ApMat序列进行系统发育分析。使用CLUSTAL W(Thompson et al., 1994)生成多重序列比对，如有必要，在MEGA 7(Tamura et al., 2016)中手动编辑。系统发育关系用距离法进行分析，使用Kimura的双参数模型(Kimura et al., 1980)计算距离矩阵，用软件MEGA 7构建所有菌株ApMat基因序列N-J (neighbor-joining)系统发育树，自举检验(bootstrap)重复1 000次以获得各分支的支持率(Felsenstein, 1985)。

1.5 抗药性测定

使用菌丝生长测量法测定所有分离获得的炭疽菌株对多菌灵、乙霉威、戊唑醇和咪鲜胺4种杀菌剂的敏感性。多菌灵和乙霉威的区分剂量设置为5、10和100 μg·mL^-1，以不含药剂为对照(CK)，每处理重复3次。各菌株先分别在PDA平板上培养4天，然后在同一圆周上取相同大小的菌丝块(直径0.5 cm)并转移到含有不同浓度杀菌剂的PDA平板中央。25 ℃下黑暗培养3天后观察生长情况：不能在5 μg·mL^-1的多菌灵或乙霉威平板上生长的为敏感菌株，能在5 μg·mL^-1而不能在10 μg·mL^-1上生长的为多菌灵或乙霉威低水平抗性菌株，能在10 μg·mL^-1而不能在100 μg·mL^-1上生长的为中等水平抗性菌株，能在100 μg·mL^-1上生长的为高水平抗性菌株(张传清等，2006)。

戊唑醇的区分剂量设置为5、20 μg·mL^-1，以不含药剂为对照(CK)，每处理重复3次。25 ℃黑暗培养7天后观察生长情况：不能在含有5 μg·mL^-1戊唑醇的平板上生长的为敏感菌株(S); 能在5 μg·mL^-1而不能在20 μg·mL^-1戊唑醇平板上生长的为戊唑醇低水平抗性菌株(LR); 能在20 μg·mL^-1平板上生长的为高水平抗药性菌株(HR)(陈聃等，2013)。

1.6 多菌灵抗药菌株β-微管蛋白突变位点分析

采用李河等(2012)的方法，对所有分离菌株的β-微管蛋白基因进行PCR扩增、测序，采用MEGA 7软件比较每个菌株该基因编码的氨基酸序列差异。统计不同病原种类、不同抗性类型菌株间氨基酸的突变位点及突变方式，分析β-微管蛋白氨基酸序列在菌株中的突变规律。

2 结果与分析 2.1 油茶炭疽病菌分离及柯赫氏法则验证

从210份病叶片样品中分离获得疑似炭疽属真菌95株，通过测序获得95条ApMat基因序列，进一步在GenBnak中Blast搜索确定这些序列均属于炭疽属真菌。通过柯赫氏法则验证，确定这95个菌株均为油茶炭疽病病原菌。

2.2 基于ApMat位点的油茶炭疽病菌系统发育分析和鉴定

对95条所测ApMat基因序列与GenBnak中炭疽属真菌其他已知种序列进行分析。908个序列位点中(空位作为完全缺失处理)，保守位点393个，变异位点480个，简约信息位点255个，单碱基变异位点225个。N-J系统发育树与bootstrap值见图 1。

从系统发育树中可以看出，95个分离菌株以非常高的支持率聚为4个明显的进化分支：83个菌株与果生炭疽菌参考菌株聚为1支(Bootstrap= 86%)，占总分离菌株的87.4%，分布在湖南、江西、海南和广东所有的采样点，说明该菌具有很强的生态适应性，适生于各种类型的环境中，是优势病菌种类；4个菌株与暹罗炭疽菌参考菌株聚为1支(Bootstrap=85%)，占总分离菌株的4.2%，分布在湖南和江西两地; 7个菌株与山茶炭疽菌参考菌株聚为一支(Bootstrap=90%)，全部采自湖南，占总分离菌株的7.4%;有1个分离自江西的菌株与胶胞炭疽菌参考菌株聚为一支(Bootstrap=99%)，占总分离菌株的1%。4个进化分支菌株与各自的模式菌株的形态特征一致(李河等，2017)。因此，基于ApMat基因序列结合形态学特征可以明确地将分离自油茶苗圃的95株炭疽病菌鉴定为果生炭疽菌、暹罗炭疽菌、山茶炭疽菌和胶胞炭疽菌4个种。

进一步对这4种病原菌和卡斯特炭疽菌等共5种油茶炭疽病菌的致病力进行测定。结果表明，根据致病力大小可以把这5种病菌分为3组：第1组果生炭疽菌对油茶的致病力最强，第2组暹罗炭疽菌和山茶炭疽菌的致病力次之，第3组胶胞炭疽菌和卡斯特炭疽菌的致病力最弱(图 2)。经统计分析可知，组间致病力差异显著，而组内致病力差异不显著(P＜0.01)。

2.3 油茶炭疽病菌对多菌灵、乙霉威的敏感性

对95株炭疽菌对多菌灵、乙霉威2种杀菌剂的敏感性测试，结果见表 1。对多菌灵产生了抗药性的菌株有31个(高水平抗性菌株29株，中等水平抗性菌株2株)，占所有分离菌株的32.6%。其中，海南10株菌对多菌灵均具有抗性，抗性频率为100%；对乙霉威的抗性菌株为1株(HANHN13为双重抗性，对多菌灵的抗性水平为中抗)，抗性频率为10%，其余9株高抗多菌灵的菌株均对乙霉威敏感(负交互抗性)。湖南菌株共29株，有8个菌株对多菌灵产生了抗药性，抗性频率为27.6%，除了1个菌株(HNLY2-4，对多菌灵的抗性水平为中抗)同时对多菌灵和乙霉威产生了抗性，其余7株均对乙霉威敏感; 其余21个菌株对乙霉威具有抗性。江西菌株总共46株，对多菌灵具有抗性的菌株10株(高抗)，抗性频率为21.7%，这10个菌株对乙霉威敏感；其余36个菌株均对乙霉威具有抗性。广东共有10个菌株，其中3个菌株对多菌灵具有抗性(高抗)但对乙霉威敏感，抗性频率为30%；其余7个菌株对乙霉威具有抗性。

2.4 油茶炭疽病菌对戊唑醇和咪鲜胺的敏感性

所有95株炭疽菌对戊唑醇和咪鲜胺杀菌剂的敏感性测试结果见表 1。对戊唑醇产生抗药性的菌株有31株，但均属于低水平抗性菌株(LR)，占所有分离菌株的32.6%。其中，海南有5个菌株对戊唑醇具有抗性，抗性频率为50%;湖南有14个菌株对戊唑醇具有抗药性，抗性频率为48.3%;江西有10个菌株对戊唑醇具有抗药性，抗性频率为17.4%;广东有2个菌株对戊唑醇具有抗药性，抗性频率为20%。

对多菌灵或戊唑醇任意一种具有抗性的菌株有56株，占所有分离菌株的58.9%;对这2种杀菌剂同时具有抗性的菌株有6株，占所有分离菌株的6.3%;对多菌灵、乙霉威和戊唑醇3种杀菌剂均有抗性的菌株有2株(HANHN13和HNLY2-4)，占所有分离菌株的2.1%。以上研究结果表明中国油茶苗圃炭疽菌产生了非常高的抗药性频率。但所有95个菌株对咪鲜胺均十分敏感，说明目前苗圃油茶炭疽病菌尚未对咪鲜胺产生抗药性(表 1)。

2.5 多菌灵抗性菌株β-微管蛋白变异位点

对95株炭疽菌的β-微管蛋白基因进行PCR扩增测序，编码的相应氨基酸序列位点的变异情况见表 1。29个高抗多菌灵而对乙霉威敏感菌株的第198位氨基酸由谷氨酸(Glu)突变为丙氨酸(Ala)，而2株(HANHN13和HNLY2-4)对多菌灵和乙霉威具有双重抗药性的菌株的第200位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)突变为酪氨酸(Tyr)。

3 讨论 3.1 油茶苗圃炭疽病菌种类鉴定及分布

本研究中分离到果生炭疽菌83株，分离率为87.4%，暹罗炭疽菌、山茶炭疽菌和胶胞炭疽菌共有12株，只占总分离菌株的12.6%，说明这3种病菌并非油茶苗圃炭疽病的主要病原种类。这与笔者生前报道的油茶成林炭疽病是以果生炭疽菌为主要致病菌的研究结果(Li et al., 2016; 李河等，2014; 2016; 2017)一致。

果生炭疽菌是最近几年才被发现，属于胶胞炭疽菌复合群的一个种(Prihastuti et al. , 2009)。但该真菌可引起多种植物病害，包括美洲杜鹃和阿拉伯咖啡(Coffea arabica)的果实腐烂病，苹果(Malus pumila)、无花果(Ficus carica)、酸橙(Citrus aurantium)、梨(Pyrus pyrifolia)、杜鹃(Rhododendron simsii)等植物的叶炭疽病。此外，果生炭疽菌地理分布广泛，在美洲、西亚和东亚、西欧、西非和澳大利亚五大洲均有报道(Prihastuti et al., 2009; Weir et al., 2012)。

形态学上，果生炭疽菌与胶胞炭疽菌复合群中的其他种非常相似或不能区分，需要借助分子标记才能与其他近似种区别。目前采用多基因位点方法对炭疽属真菌进行鉴定应用越来越广泛。Damm等(2012)基于6个基因位点的系统发育分析，确认了30个种属于C. acutatum复合群; 而Weir等(2012)采用8个基因位点系统发育分析将胶胞炭疽菌复合群重新分为22个种(包括1个亚种)。由于炭疽属真菌物种之间的核苷酸多样性较低，经常使用3~8个基因位点序列对胶胞炭疽菌复合群进行系统发育分析和分子鉴定(Munir et al., 2016; Prihastuti et al., 2009; Weir et al., 2012)。多位点测序虽然可靠，但它非常昂贵和耗时。最近有研究表明，ApMat基因座具有足够高的核苷酸多样性可鉴定胶胞炭疽菌复合群成员包括38种系统发育学种(Jayawardena et al., 2016; Liu et al., 2015; Sharma et al., 2013; 2015; Silva et al., 2012)。

3.2 病原菌种类与杀菌剂敏感性关系

因海南、广东菌株样品均是果生炭疽菌，而江西样品除了果生炭疽菌外，其他的菌株也只有暹罗炭疽菌和胶胞炭疽菌各1株，因此只分析了湖南省的病原菌种类与杀菌剂敏感性之间的关系。在本研究中，湖南样品中有3种病菌：果生炭疽菌，山茶炭疽菌和暹罗炭疽菌。其中，果生炭疽菌有4种抗药性类型菌株：Ⅰ：对多菌灵敏感-对乙霉威抗性-对戊唑醇抗性SRR; Ⅱ:对多菌灵敏感-对乙霉威抗性-对戊唑醇敏感SRS; Ⅲ:对多菌灵抗性-对乙霉威敏感-对戊唑醇敏感RSS; Ⅳ:对多菌灵抗性-对乙霉威抗性-对戊唑醇抗性RRR。山茶炭疽菌有SRR、SRS和RSS 3种抗药类型菌株，而暹罗炭疽菌只有SRR 1种抗药类型菌株。据报道，胶胞炭疽菌复合群中22种系统发育物种中只有3种在自然界中具有相应的有性型：果生炭疽菌(对应于Glomerella cingulata var. minor); 山茶炭疽菌(对应于Glomerella cingulata f. sp. camelliae)和C. kahawae(对应于Glomerella cingulata var. migrans)，而其他19个系统发育种的有性型尚无报道(Weir et al., 2012; Dickens et al., 1989; Cisar et al., 1994)。据此推测，油茶苗圃炭疽病菌中的果生炭疽菌和山茶炭疽菌可能是具有有性生殖阶段而更容易变异产生抗药性，因而可以产生较多的抗药性类型菌株，而没有有性生殖阶段的暹罗炭疽菌则只有1种抗药菌株类型。因此，需要增加样品菌株数量来验证该假设，并深入研究果生炭疽菌和山茶炭疽菌容易产生抗性的原因。另外，与笔者对湖南油茶成林炭疽病原菌研究结果相比，本研究中油茶苗圃果生炭疽菌和山茶炭疽菌的总分离率为94.8%，比成林中这2种菌72.6%的分离率高出近22%;而本研究中暹罗炭疽菌和胶胞炭疽菌总分离率为5.2%，比成林油茶中这2种菌分离率22.6%少17.4%，是否是苗圃杀菌剂胁迫远大于成林的环境下，暹罗炭疽菌和胶胞炭疽菌更容易被杀菌剂杀死，这需要进一步深入研究。

95株炭疽菌均对咪鲜胺十分敏感，说明目前苗圃油茶炭疽病菌尚未对咪鲜胺产生抗药性，可以采用该杀菌剂防治油茶炭疽病。

3.3 病原菌对苯并咪唑类杀菌剂和乙霉威的负交互抗性

苯并咪唑类杀菌剂的抗药菌株主要有Ben R1和Ben R2 2种类型。施药之前，田间主要是对苯并咪唑类杀菌剂敏感、同时对乙霉威表现抗药性(二者之间存在负交互抗药性)的Ben S菌株。大量连续使用苯并咪唑类杀菌剂以后，田间开始出现对苯并咪唑类杀菌剂表现为高水平抗药性，但对乙霉威敏感的Ben R1菌株(Peres et al., 2004)。因此苯并咪唑类杀菌剂和乙霉威的复配剂被大量用于防治BenR1病菌，但田间也开始出现抗苯并咪唑类杀菌剂，同时对乙霉威表现抗药性，即双重抗药性菌株Ben R2(Zhang et al., 2010; Young et al., 2010; 陈聃等，2013)。本研究测定了湖南、江西、海南和广东四地油茶苗圃炭疽菌群体对多菌灵的抗药性。从研究结果看，以上四地的油茶苗圃炭疽病菌已对多菌灵产生了严重的抗药性，抗性频率32.6%，这些抗性菌株会降低苯并咪唑类杀菌剂对油茶炭疽病的防治效果。另外笔者的研究发现95个分离菌株中有93个菌株对多菌灵或乙霉威其中一种具有抗性则对另一种敏感的负交互抗性规律，因此建议使用苯并咪唑类杀菌剂防治油茶炭疽病时应与乙霉威复配使用。但是值得注意的是，海南和湖南各有1个菌株(HANHN13和HNLY2-4)对多菌灵和乙霉威都产生了抗性，即为双重抗药性菌株。说明这2个地方的油茶苗圃炭疽菌群体对苯并咪唑类杀菌剂已产生Ben R2抗性类型。

3.4 抗性菌株β-微管蛋白基因变异位点

在苯并咪唑类杀菌剂大量连续使用以后，田间开始出现苯并咪唑类抗性菌株。其抗性机制主要是病菌的β-微管蛋白氨基酸第198位的氨基酸由谷氨酸(Glu)突变为丙氨酸(Ala)和/或第200位的氨基酸从苯丙氨酸(Phe)变为酪氨酸(Tyr)2类(Young et al., 2010)。笔者分析比较了对多菌灵敏感和抗性菌株的β-微管蛋白基因序列后，发现高抗菌株的均为三联密码子第198位从GAG突变为GCG，导致第198位的氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸。而多菌灵和乙霉威双重抗药性菌株均为三联密码子第200位从TTC突变为TAC，导致第200位的氨基酸从苯丙氨酸突变为酪氨酸，这与前人报导的研究结果一致(陈聃等，2013; Zhang et al., 2010)。HANHN13和HNLY2-4这2个对多菌灵和乙霉威具有双重抗药性的菌株对多菌灵的抗性都是中等抗性水平，未发现对多菌灵高抗的双重抗性情况，这是否意味着第200位氨基酸变异只能产生中等抗性，而中等抗性的菌株才能同时产生对乙霉威的抗性需要进一步研究。

因此，今后研究应重点关注和监测果生炭疽菌抗药性发生情况，减少易产生抗药性杀菌剂的使用，并深入研究该病菌数量多、分布范围广的分子机制，为有效防治油茶炭疽病奠定坚实的基础。

4 结论

湖南、江西、海南和广东四地的油茶苗圃炭疽病病原菌主要是果生炭疽菌、暹罗炭疽菌、山茶炭疽菌和胶胞炭疽菌4个系统发育学种，其中果生炭疽菌分离数量最多、分布范围最广。中国油茶苗圃炭疽病菌已对多菌灵/乙霉威和戊唑醇产生了严重的抗药性，尚未检测到咪鲜胺抗性菌株。另外，油茶苗圃优势病菌果生炭疽菌已经出现多种抗药性类型菌株，这些油茶苗携带的抗药菌株会随着幼苗的栽培扩散到油茶成林及更加广阔的自然界中，导致更加严重的病害发生。