南美油藤(Plukenetia volubilis)，大戟科(Euphorbiaceae)攀援状多年生木质藤本植物，又名星油藤、美藤果、印加果等(Souza et al., 2013)。原生长在海拔80~1 700 m的南美洲安第斯山脉地区热带雨林，在南美洲已被当地土著人应用了3 000多年，其种子油含油量丰富(35%~60%)(Kumar et al., 2017)，且不含任何毒素和对健康有害的物质，不饱和脂肪酸含量可达90%以上，是世界上不饱和脂肪酸含量最高的植物油之一，其中ω-3和ω-6不饱和脂肪酸的比例为1:0.75，最接近人体的吸收比例，是世界上最好的食用油之一(刘付英，2014; Chandrasekaran et al., 2015)。一般而言，油料植物随着时空的变化，其种子所含的脂肪酸的含量会产生一定的变化，因此，油料植物的脂肪酸合成与累积及代谢机制的研究，对于生产中提取其中重要的脂质代谢物、提高油料植物的含油量和改进油脂品质具有重要的指导意义。但是，目前为止关于南美油藤种子的研究大部分集中于脂肪酸组分和部分关键基因表达等应用方面(Wang et al., 2014; Niu et al., 2015; Hu et al., 2018)，对其脂质代谢物的累积同发育阶段的关系及油脂生物合成的关键调控基因及途径尚未清晰。因此，本研究结合GC-MS代谢组学技术和第2代高通量转录组学技术(RNA-Seq)对南美油藤种子生长过程中脂质代谢物的动态变化与差异表达基因进行分析，以探明南美油藤种子油脂生物合成代谢过程中的分子调控机制，确定其种子油脂合成过程中关键调控基因与表达模式，为进一步进行基因的筛选、鉴定、克隆以及利用分子生物技术进行基因改良，提高种子油产量和改变脂肪酸成分提供备选基因和相应的理论基础，最终为合理高效开发利用南美油藤提供技术支撑。

南美油藤样品采集于广东省湛江市遂溪县南方国家级林木种苗示范基地，分别于2017年5月31日(种子形成阶段，SI-1)、2017年6月29日(种子发育初期阶段，SI-2)、2017年7月28日(种子发育中期阶段，SI-3)、2017年8月31日(种子发育中后期阶段，SI-4)、2017年9月28日(种子成熟阶段，SI-5)采集新鲜果实，去除果皮后，种子以铝箔纸包裹液氮速冻后，于-80 ℃保存，用于总RNA提取和化学成分分析。

取适量样品，加入0.5 mL PBS溶液及内标，匀浆，转移至玻璃管中，加入1 mL甲醇、2 mL氯仿，震荡10 min，4 ℃，1 500×g离心10 min，取下层溶液至新管中，吹干，加入衍生试剂(重氮甲烷)，反应1 h，吹干，加入100 μL正己烷复溶。转移至进样瓶中待测。采用气相色谱-质谱联用仪(GCMS-QP2010 Ultra，Shimadzu Corp., Kyoto, Japan)进行物质分离检测，Agilent DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 μm×0.25 μm，J&W Scientific，Folsom, CA, USA)载入高纯氦气。各个生长阶段的南美油藤种子样品均平行取6个重复。

对质谱分析后的代谢物数据进行预处理，基于24种脂肪酸标准品的标准曲线对代谢物质谱进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正，对代谢物进行定量。利用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)和单维分析(Student’s t检验)相结合的方法筛选组间差异代谢物，判定标准为VIP(Variable Importance in the Projection)>1且P < 0.05，得到不同比较组间的差异代谢物。通过对24种脂质代谢物含量标准分数(Z-Score)归一化处理后进行聚类热图分析，得到不同代谢物含量的变化趋势。

由于南美油藤种子处于形成阶段、发育初期和中期时质量较小，2~4粒种子混合成1个样品；随着种子的发育和生长，处于发育中后期和成熟期的1粒种子即为1个样品。每个样品的种子取自同一株南美油藤植株，同一时期3个重复的样品取自3株不同植株，液氮研磨后用于RNA提取。RNA提取选用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，建好的测序文库用Illumina HiSeq^TM 4000进行测序。

由于南美油藤没有可参考的基因组序列，因此采用短Reads组装软件Trinity做转录组从头组装(de novo assembly)，将获得的每个转录本与NCBI中Nr(Non-redundant protein)数据库进行比对，得到非重复序列基因(Unigene)。使用RPKM(Reads Per Kilobase per Million mapped reads)法计算基因表达量，其计算公式为：RPKM=(1 000 000×C)/(N×L/1 000)。设RPKM为Unigene A的表达量，则C为比对到Unigene A的reads数，N为比对到所有Unigene的总reads数，L为Unigene A的碱基数。

使用edgeR软件包分析SI-1 vs SI-2，SI-1 vs SI-3，SI-1 vs SI-4，SI-1 vs SI-5，SI-2 vs SI-3，SI-2 vs SI-4，SI-2 vs SI-5，SI-3 vs SI-4，SI-3 vs SI-5，SI-4 vs SI-5各组之间的差异表达基因，筛选阈值为FDR(False discovery rate)≤0.05且Fold change≥2。对筛选出的差异表达基因进行Gene Ontology功能显著性富集分析、KEGG生物途径显著性富集分析等生物信息学分析。

利用KEGG(the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路富集分析通过MBRole(http://csbg.cnb.csic.es/mbrole2/)获取代谢物的KEGG ID，并联合转录组中差异表达基因进行通路富集分析，以期从转录水平和代谢水平联合阐述不同生长发育阶段南美油藤种子脂质代谢物的累积规律，探明南美油藤种子油脂生物合成代谢过程中的分子调控机制，为提高南美油藤种子油产量和改良脂肪酸成分提供备选基因和相应的理论依据。

1) 脂肪酸含量在南美油藤种子不同生长阶段的变化分析南美油藤种子脂质代谢物主要由饱和脂肪酸：月桂酸(lauric acid, C12 :0)、肉豆蔻酸(myristic acid, C14 :0)、棕榈酸(palmitic acid, C16:0)、硬脂酸(stearic acid, C18:0)等9种，以及不饱和脂肪酸：肉豆蔻油酸(myristoleic acid, C14:1)、棕榈油酸(palmitoleic acid, C16:1)、油酸(Oleic acid, C18:1)、亚油酸(linoleic acid, C18:2)、α-亚麻酸(α-linolenic aicd, C18:3α)等15种组成(表 1)。

表 1 南美油藤种子发育过程中各脂质代谢物累积的动态变化 Tab.1 Dynamic change of accumulation of the fatty acids in Plukenetia volubilis seed development

表 1 南美油藤种子发育过程中各脂质代谢物累积的动态变化 Tab.1 Dynamic change of accumulation of the fatty acids in Plukenetia volubilis seed development nmol·g-1 脂质代谢物Lipid metabolites 不同发育阶段Different developmental stages SI-1 SI-2 SI-3 SI-4 SI-5 C12:0月桂酸Lauric acid 134.41 134.47 135.66 140.06 139.57 C14:0肉豆蔻酸Myristic acid 147.33 147.01 147.42 152.02 150.06 C15:0十五酸Pentadecanoic acid 17.68 17.08 16.80 17.92 17.69 C16:0棕榈酸Palmitic acid 282.12 271.77 250.47 240.08 297.73 C17:0十七烷酸Heptadecanoic acid 13.00 12.63 12.36 12.85 13.73 C18:0硬脂酸Stearic acid 99.40 101.60 99.93 89.37 108.40 C20:0花生酸Arachidic acid 16.46 15.06 14.93 15.51 15.77 C22:0山嵛酸Behenic acid 7.06 5.91 5.08 5.14 6.86 C24:0木蜡酸Lignoceric acid 4.85 4.95 4.17 4.28 5.97 饱和脂肪酸含量Total of saturated fatty acids 722.31 710.48 686.82 677.23 755.78 C14:1T反式肉豆蔻烯酸Transmyristelaidic acid 13.78 14.57 15.47 14.37 15.31 C14:1肉豆蔻油酸Myristoleic acid 106.44 150.85 52.53 53.38 97.44 C16:1T棕榈反油酸Palmitelaidic acid 12.89 13.62 13.31 13.77 16.24 C16:1棕榈油酸Palmitoleic acid 48.09 47.57 51.87 49.72 50.86 C18:1T异油酸Vaccenic Acid 15.56 13.58 13.97 14.35 18.16 C18:1油酸Oleic acid 112.85 92.77 90.24 91.45 166.52 C18:2亚油酸Linoleic acid 154.53 85.67 118.61 133.28 411.71 C18:3 α-亚麻酸α-Linolenic acid 50.75 29.73 42.92 69.34 683.78 C20:2二十碳二烯酸Eicosadienoic acid 4.89 4.30 4.49 4.63 4.56 C20:5二十碳五烯酸Eicosapentaenoic acid 5.16 4.56 4.10 4.31 4.50 C22:1T巴西烯酸Brassidic acid 9.21 11.22 10.57 9.88 9.73 C22:1芥酸Erucic acid 11.69 11.42 11.96 14.32 12.67 C22:2二十二碳二烯酸Docosadienoic acid 14.71 15.57 11.26 8.12 12.05 C22:6二十二碳六烯酸Docosahexaenoic acid 3.83 2.54 6.99 2.51 4.16 C24:1神经酸Nervonic acid 9.05 4.73 4.82 4.32 11.06 不饱和脂肪酸含量Total of Unsaturated fatty acids 573.43 502.70 453.11 487.75 1 518.75 脂肪酸总量Total 1 295.74 1 213.18 1 139.93 1 164.98 2 274.53

南美油藤种子生长发育的不同阶段中，各脂肪酸含量发生了不同的变化。由表 1可知，在种子发育至成熟的过程中，脂肪酸总含量在种子形成初期阶段(SI-1)至发育中期阶段(SI-3)有所下降，发育至中后期阶段(SI-4)开始缓慢回升，到种子成熟阶段(SI-5)时，脂肪酸总含量急剧增加。随着种子的发育成熟，α-亚麻酸的含量变化显著，其含量变化呈U型，由种子形成初期(SI-1)的50.75 nmol·g^-1到发育初期阶段的最低含量29.73 nmol·g^-1，在发育中期开始其含量逐渐增加，直至种子成熟阶段(SI-5)达到683.78 nmol·g^-1，为南美油藤成熟种子中含量最高的脂肪酸。亚油酸含量为成熟种子中含量第二的脂肪酸，其含量的动态变化与α-亚麻酸类似，在种子发育初期阶段(SI-2)含量最低(85.67 nmol·g^-1)，种子成熟阶段(SI-5)含量最高(411.71 nmol·g^-1)。棕榈酸是成熟种子中含量第三的脂肪酸，其含量在种子成熟阶段前(SI-1至SI-4)呈缓慢下降的趋势，至成熟阶段其含量回升并较种子形成阶段(SI-1)稍高。从各种饱和与不饱和脂肪酸含量的动态变化发现，南美油藤种子整个发育过程中，各饱和脂肪酸含量的变化比较平缓，而各不饱和脂肪酸的变化在种子成熟前与成熟后的差异较大。

根据各脂质代谢物累积的动态变化(图 1A)可知，种子成熟前(SI-1至SI-4)为油脂缓慢累积期，脂肪酸总含量比较稳定；不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸含量比(UFA/SFA)在SI-1至SI-4阶段变化平缓(0.66~0.79)(图 1B)，即饱和与不饱和脂肪酸的累积速率在SI-1至SI-4阶段基本一致；饱和脂肪酸所占比例较不饱和脂肪酸更大，且在SI-3阶段其含量百分比达到最大值(60.25%)。种子成熟阶段(SI-5)为油脂急速累积期，脂肪酸总含量急速增加至2 274.53 nmol·g^-1，是SI-1阶段各类脂肪酸总含量的1.76倍、SI-4阶段的1.95倍。SI-5阶段不饱和脂肪酸含量急剧增加，是饱和脂肪酸含量的2.01倍，说明即将成熟的南美油藤种子中油脂合成主要以不饱和脂肪酸为主。

图 1 南美油藤种子饱和与不饱和脂肪酸含量(A)和含量比(B)的动态变化 Fig. 1 Dynamic change of the UFA, SFA (A) and UFA to SFA content ratio (B) in Plukenetia volubilis seeds UFA: Unsaturated fatty acids; SFA: Saturated fatty acids.

2) 南美油藤种子不同生长阶段代谢物的差异分析通过对南美油藤种子5个生长阶段样本的两两分组比较得到不同分组间代谢物的变化情况，根据筛选的判断条件，得到不同分组比较的差异代谢物(表 2)。10个分组的差异代谢物包括6种脂肪酸，3种饱和脂肪酸(月桂酸、棕榈酸和硬脂酸)和3种不饱和脂肪酸(肉豆蔻油酸、二十二碳二烯酸和二十二碳六烯酸)。其中肉豆蔻油酸在6个分组比较中均呈现显著差异，亚油酸和α-亚麻酸在各阶段分组中VIP值均较大，即二者对南美油藤种子发育过程的阶段划分贡献最大。

表 2 南美油藤种子发育不同阶段分组间显著差异代谢物的统计^① Tab.2 Statistics of significant differences in metabolites between pairwise comparison by any two developmental stages of Plukenetia volubilis seeds

表 2 南美油藤种子发育不同阶段分组间显著差异代谢物的统计① Tab.2 Statistics of significant differences in metabolites between pairwise comparison by any two developmental stages of Plukenetia volubilis seeds P/VIP SI-1 vs SI-2 SI-1 vs SI-3 SI-1 vs SI-4 SI-1 vs SI-5 SI-2 vs SI-3 SI-2 vs SI-4 SI-2 vs SI-5 SI-3 vs SI-4 SI-3 vs SI-5 SI-4 vs SI-5 月桂酸Lauric acid 0.979/0.69 0.802/0.54 0.049/0.96 $\boxed{{{0.026} \mathord{\left/ {\vphantom {{0.026} {1.59}}} \right. } {1.59}}}$ 0.812/0.22 0.057/0.68 0.033/0.96 0.409/1.07 0.440/0.35 0.852/0.25 肉豆蔻酸Myristic acid 0.871/0.54 0.986/0.52 0.115/0.81 0.186/1.14 0.940/0.18 0.096/0.63 0.147/0.80 0.439/1.06 0.635/0.28 0.488/0.33 棕榈酸Palmitic acid 0.511/0.91 0.294/1.54 $\boxed{{\text{0}}{\text{.024/2}}{\text{.22}}} $ 0.604/2.09 0.453/1.55 $\boxed{{\text{0}}{\text{.038/2}}{\text{.05}}} $ 0.373/1.08 0.715/1.33 0.229/0.49 0.068/0.97 硬脂酸Stearic acid 0.692/1.75 0.974/1.31 0.132/1.28 0.353/0.31 0.913/0.33 $\boxed{{\text{0}}{\text{.013/1}}{\text{.11}}} $ 0.418/0.54 0.502/1.52 0.623/0.40 0.050/0.76 肉豆蔻油酸Myristoleic acid 0.309/1.95 $ \boxed{{\text{0}}{\text{.001/2}}{\text{.96}}}$ $ \boxed{{\text{0}}{\text{.001/2}}{\text{.80}}}$ 0.643/0.46 $\boxed{{\text{0}}{\text{.033/3}}{\text{.78}}} $ $\boxed{{\text{0}}{\text{.034/2}}{\text{.90}}} $ 0.234/1.89 0.727/0.31 $\boxed{{\text{0}}{\text{.012/3}}{\text{.61}}} $ $\boxed{{\text{0}}{\text{.012/3}}{\text{.53}}} $ 油酸Oleic acid 0.272/1.65 0.341/1.39 0.317/1.41 0.299/1.38 0.873/0.67 0.913/1.02 0.141/0.83 0.950/0.73 0.146/0.71 0.144/0.69 亚油酸Linoleic acid 0.129/2.58 0.452/1.99 0.681/1.25 0.151/1.67 0.209/1.72 0.167/1.82 0.070/2.17 0.703/1.78 0.100/1.42 0.119/1.32 α-亚麻酸α-Linolenic acid 0.209/1.39 0.643/1.08 0.508/1.26 0.181/2.37 0.076/1.34 0.109/1.71 0.168/2.79 0.279/2.96 0.176/2.43 0.195/2.50 二十二碳二烯酸 Docosadienoic acid 0.787/0.47 0.373/0.41 0.035/0.89 0.488/1.61 0.197/0.85 $\boxed{{\text{0}}{\text{.002/1}}{\text{.02}}} $ 0.283/1.42 0.278/1.07 0.835/0.52 0.179/0.15 二十二碳六烯酸 Docosahexaenoic acid $\boxed{{\text{0}}{\text{.044/1}}{\text{.02}}} $ 0.494/0.79 0.036/0.40 0.746/0.13 0.338/0.56 0.833/0.14 0.082/0.54 0.333/1.21 0.543/0.50 0.074/0.44 ①加框表示显著差异代谢物(VIP>1且P≤0.05)；未列出代谢物为差异不显著。The framed represents significantly different metabolites (VIP>1 and P ≤0.05); Not listed represents those metabolites without significant difference.

结合代谢物含量的动态变化发现，肉豆蔻油酸含量在南美油藤种子发育过程中变化多样，种子形成初期至种子发育初期阶段，其含量增长较快，由106.44 nmol·g^-1增加至150.85 nmol·g^-1，但当种子发育至中期阶段(SI-3)，其含量迅速降低至52.53 nmol·g^-1，中后期阶段(SI-4)含量略有升高(53.38 nmol·g^-1)，种子发育至成熟阶段(SI-5)时，其含量回升至97.44 nmol·g^-1，这与肉豆蔻油酸在不同分组比较中VIP值的变化一致(表 2)。

根据不同分组间差异代谢物的比较可得，种子发育中期和中后期阶段比较组(SI-3 vs SI-4)的各种代谢物含量差异均不显著，即各脂肪酸含量比较稳定，波动幅度较小，这与各代谢物累积的动态变化结果一致；种子发育初期阶段和成熟阶段比较组(SI-2 vs SI-5)没有筛选出差异代谢物，但从各脂肪酸含量的动态变化分析发现，种子发育初期阶段和成熟阶段中α-亚麻酸和亚油酸的含量波动最大，二者VIP值最高(分别为2.79、2.58)，对种子发育初期和成熟阶段的区别贡献最大，可作为SI-2和SI-5分组的标志代谢物。

对所有脂质代谢物在南美油藤种子5个发育阶段的含量进行聚类分析(图 2)发现，Z-score归一化处理的24种脂肪酸总体聚为2组。第1组(Group1)18种脂肪酸的总体趋势是SI-2和SI-3阶段变化较小，含量比较稳定；而在种子成熟阶段(SI-5)棕榈酸、棕榈反油酸、硬脂酸、油酸、异油酸、亚油酸、α-亚麻酸、木蜡酸和神经酸共9种脂肪酸含量最高。第2组(Group2)中6种脂肪酸呈现出波动变化，如二十二碳六烯酸、反式肉豆蔻油酸和棕榈油酸在种子发育中期阶段(SI-3)含量最高，而当种子发育至中后期阶段(SI-4)，其含量反而降低，至种子成熟(SI-5)其含量稍有回升；肉豆蔻油酸、巴西烯酸和二十二碳二烯酸则在种子发育初期阶段(SI-2)含量达到最高值，肉豆蔻油酸和二十二碳二烯酸经过SI-3和SI-4阶段的含量降低之后，在种子成熟阶段略有回升，巴西烯酸含量则在SI-2阶段后呈缓慢降低趋势。结合5个发育阶段的各代谢物的动态变化过程及差异代谢物分析结果可知，5个发育阶段可再划分为2个时期，即脂肪酸缓慢累积时期(SI-1，SI-2，SI-3和SI-4)和脂肪酸快速累积时期(SI-5)，判别依据为亚油酸和α-亚麻酸的含量。

图 2 南美油藤种子不同发育阶段中差异代谢物的聚类热图 Fig. 2 Cluster heat map of different metabolites at five developmental stages of Plukenetia volubilis seeds

将南美油藤种子不同发育阶段转录组文库的原始Reads进行数据过滤、比对和拼接后，得到44 797条参考基因，其中表达基因为44 713条。通过对5个发育阶段的样品之间进行两两比较，有助于发现各代谢物与基因之间的关联，从而获得调控重要代谢物合成与积累的关键基因。依据设定的筛选差异基因阈值，共获得20 446个显著差异的表达基因。

根据南美油藤种子5个发育阶段的差异表达基因进行分组间差异比较的结果(图 3A)可知，种子成熟阶段(SI-5)与其余几个发育阶段均存在大量的显著差异表达基因，表明随着种子的成熟，更多的基因表达出现差异，且下调的基因所占比例更大，说明大部分基因的表达出现下降趋势；SI-1 vs SI-2和SI-3 vs SI-4的显著差异表达基因数量相对较少，这表明种子形成初期阶段与种子发育初期阶段、种子发育中期与中后期阶段的基因表达差异较小。综合SI-5阶段与其余各分组间差异基因的比较发现，SI-5阶段与SI-1、SI-2、SI-3和SI-4共同存在3 026个显著差异的表达基因(图 3B)。对3 026个显著差异基因进行Z-Score归一化处理的聚类分析(图 3C)可得，729个基因在SI-5阶段表达量显著高于其余生长阶段，即这些基因在种子成熟阶段超高表达，而在种子成熟前处于超低表达。基于各阶段的基因表达量变化，5个发育阶段可分为2个时期(图 3C)，SI-5阶段的表达基因与其余4个发育阶段的表达基因存在显著差异，单独聚为一类，SI-1、SI-2、SI-3和SI-4阶段的显著差异基因量相对较少，聚为一类。这与脂质代谢组分析结果中脂肪酸缓慢累积和快速累积2个时期一致；与Wang等(2012)对南美油藤种子根据油脂形成和快速累积的2个生长阶段的转录组分析结果一致。

图 3 南美油藤种子发育不同阶段差异表达基因的统计(A、B)和聚类热图(C) Fig. 3 Statistics of differentially expressed genes (DEGs) between pairwise comparison by any two stages (A, B) and cluster heat map of 3 026 DEGs at five developmental stages (C) of Plukenetia volubilis seeds

KEGG不仅是系统分析基因功能的数据库，也是系统分析代谢物功能的数据库(Kanehisa et al., 2008)。如图 4所示，根据KEGG代谢通路联合分析脂质代谢组和转录组数据，24种脂肪酸中14种脂肪酸存在显著差异性，且主要富集在7个与脂质代谢相关的代谢通路中。其中不饱和脂肪酸生物合成途径中14种相关的脂肪酸包括7种饱和脂肪酸：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸，及7种不饱和脂肪酸：棕榈油酸、油酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。通过差异表达基因代谢途径比对，共214个显著差异表达基因富集于6个脂质相关的代谢途径，其中部分差异表达基因存在于多个代谢通路。结合转录组数据中SI-5阶段与其余生长阶段的3 026个差异表达基因进行分析发现，26个显著差异表达基因共同存在于6个脂质代谢相关途径和种子成熟阶段与其余发育阶段比较的差异表达基因中。

图 4 南美油藤种子不同发育阶段中代谢物及差异表达基因的KEGG富集通路统计 Fig. 4 KEGG enrichment pathway statistics of metabolites and DEGs at five developmental stages of Plukenetia volubilis seeds

根据26个显著差异表达基因的Nr注释结果发现，南美油藤种子生长过程中高表达量的酶蛋白有脂肪酰基载体蛋白去饱和酶(fatty acyl-ACP desaturase, FAD)、酰基ACP硫脂酶A(fatty acyl-ACP thioesterase A, FATA)、β-酮脂酰ACP合酶2(3-ketoacyl ACP synthase 2, KAS2)、β-酮脂酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase, KCS)、长链酰基辅酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase, LACS)和硬脂酰基载体蛋白去饱和酶(stearoyl-acyl-carrier-protein desaturase, SAD)。从6个关键酶基因表达量的动态变化(图 5)可知，FAD2-3、FAD7、FATA、KAS2、SAD、LACS2和LACS8基因表达量的变化趋势一致，均呈现出南美油藤种子成熟阶段后高表达量；FAD2-2、KCS10、KCS1和LACS1则呈现出在种子成熟阶段的超低表达，最高表达量出现在种子发育初期(SI-2)或中期(SI-3)或者中后期阶段(SI-4)。

图 5 关键酶基因在南美油藤种子不同发育阶段表达量的动态变化 Fig. 5 Dynamic changes of expression levels of key enzyme genes during different developmental stages of Plukenetia volubilis seeds

结合这6个酶基因转录本的表达量变化(图 5)和显著差异代谢物含量的动态变化(表 2)进行相关性分析(表 3)可知，6个关键酶基因的表达量与南美油藤种子中5种主要脂肪酸含量呈显著相关性。其中FAD2-3、FAD7、FATA、KAS2、LACS2、LACS8和SAD均表现为与脂肪酸总含量和5种主要脂肪酸含量呈极显著正相关关系，由此说明这7个关键酶基因的表达对南美油藤种子脂肪酸的累积具有促进作用。相反地，FAD2-2、KCS1、KCS10和LACS1表现为与脂肪酸总含量及5种主要脂肪酸含量呈显著负相关关系，即这4个酶基因的表达对南美油藤种子油脂的合成和累积具有抑制作用。

表 3 关键酶基因表达量与主要脂肪酸含量相关性分析 Tab.3 Correlation analysis of key enzyme genes RPKM value and main fatty acids content

表 3 关键酶基因表达量与主要脂肪酸含量相关性分析 Tab.3 Correlation analysis of key enzyme genes RPKM value and main fatty acids content 基因编号 Gene ID 酶名称 Enzyme name 棕榈酸 Palmitic acid 硬脂酸 Stearic acid 油酸 Oleic acid 亚油酸 Linoleic acid α-亚麻酸 α-Linolenic acid 总含量 Total Unigene0037808 FAD2-3 0.70 0.70 0.96 0.98 1.00 0.99 Unigene0044238 FAD7 0.70 0.71 0.96 0.98 1.00 0.99 Unigene0008403 FATA 0.67 0.68 0.95 0.98 1.00 0.99 Unigene0024371 KAS2 0.69 0.70 0.96 0.98 1.00 0.99 Unigene0037684 KCS1 -0.43 -0.28 -0.82 -0.89 -0.89 -0.85 Unigene0003904 KCS10 -0.98 -0.83 -0.87 -0.76 -0.77 -0.85 Unigene0022485 LACS1 -0.98 -0.85 -0.75 -0.60 -0.61 -0.71 Unigene0022603 LACS2 0.66 0.66 0.95 0.98 1.00 0.99 Unigene0000156 LACS8 0.69 0.69 0.96 0.98 1.00 0.99 Unigene0012943 SAD 0.67 0.70 0.94 0.98 1.00 0.98

由于南美油藤种子油中高含量的多不饱和脂肪酸，使其成为一种具有重要开发前景的油料植物。本研究利用GC-MS代谢组学技术对南美油藤种子5个发育阶段的脂质代谢物进行分析，结果表明种子成熟阶段前后，脂肪酸总含量差异显著，不饱和脂肪酸含量在种子成熟阶段急剧增加，以亚油酸和α-亚麻酸含量变化最明显，这与刘果等(2018)对南美油藤种子在发育过程中各脂肪酸相对含量的动态变化分析结果一致。

从脂肪酸总含量在南美油藤种子发育过程中的动态变化发现，伴随着种子的发育(SI-1至SI-2、SI-3阶段)，脂肪酸总含量呈下降趋势，这可能因为种子形成后主要以营养生长为主，且种子结构仍不完整，需要脂类参与其结构发育(丁健等，2016)。当种子发育至成熟阶段(SI-5)，脂肪酸总含量急剧增加，各类脂肪酸的含量均有所增加，尤以α-亚麻酸和亚油酸增加量最高，其含量相当于种子形成阶段(SI-1)的13.47倍。α-亚麻酸是人体细胞组织必需脂肪酸，是维系人类脑进化的核心物质，在体内参与磷脂的合成和代谢，更为重要的是，α-亚麻酸在人体内可进一步合成2种必需生命活动性因子，即二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)，二者都是组成神经细胞膜的重要组成成分(李铁柱等，2013)。从南美油藤种子中脂肪酸的组分发现，EPA和DHA在种子生长发育的整个阶段均有合成。其中EPA在种子形成阶段(SI-1)的含量最高(5.16 nmol·g^-1)，DHA在种子快速发育阶段(SI-3)含量达到最高值(6.99 nmol·g^-1)。这一结果能够为合理开发和利用南美油藤种子，提取其中的某一类脂肪酸提供一定的参考作用。

α-亚麻酸是南美油藤成熟种子中含量最高的脂肪酸，是其他长链多不饱和脂肪酸合成的前体(Wang et al., 2014)。研究表明，种子储存油脂中α-亚麻酸的形成主要是FAD起着主要作用(Reed et al., 2000)。饱和脂肪酸在一系列FAD的作用下，在不同位置的碳原子去饱和形成双键，从而产生不同的不饱和脂肪酸(廖晓佳等，2017)。Δ-12脂肪酸去饱和酶(FAD2和FAD6)进一步催化去饱和生产亚油酸，Δ-15脂肪酸去饱和酶(FAD3、FAD7和FAD8)则催化去饱和生成α-亚麻酸(Liu et al., 2016;廖晓佳等，2017)。本研究中，2个FAD基因(FAD2-3和FAD7)均表现出与脂肪酸总含量和5种主要脂肪酸含量显著正相关关系，并且2个基因的转录本(Unigene0037808和Unigene0044238)在南美油藤种子成熟阶段超高表达。由此推断，Unigene0037808和Unigene0044238是南美油藤种子中调控高含量亚油酸和α-亚麻酸合成的关键酶基因。

在高等植物质体游离脂肪酸的生物合成过程中，FATA能够催化释放硬脂酰ACP和油酰ACP(18：0/1-ACP)上的ACP分别形成硬脂酸和油酸(18：0/1)(Wang et al., 2013)。基因FATA(Unigene0008403)在种子成熟阶段(SI-5)超高表达，而在种子成熟阶段前的表达量较低。结合代谢组中油脂含量的动态变化可得，FATA的表达对南美油藤种子油脂合成有促进作用，这与Liu等(2016)研究白檀(Symplocos paniculata)果实油脂合成代谢关键基因中得到FATA的表达与油脂含量呈显著正相关的结果一致。

KAS是植物脂肪酸合成途径中，调控脂肪酸碳链结构的主要决定因子之一，包括KAS1、KAS2和KAS3(Yang et al., 2016)。本研究在南美油藤种子生长过程中发现显著差异表达的基因KAS2。KAS2主要存在于植物中，主要负责合成C18：0-ACP，决定着油酸C18：1脂肪酸的含量(李璐等，2017)。油酸是南美油藤种子油脂肪酸的主要成分之一，KAS2基因的表达对油酸的累积起到了至关重要的作用。

植物体中，超长链脂肪酸(烃链长度超过18个碳原子)主要以三酰甘油的形式作为储藏能源存在于种子中(Vanhercke et al., 2013)，参与种子甘油酯、生物膜膜脂及鞘脂的合成，并为角质层蜡质的合成提供前提物质，对植物生长发育、适应外界环境等起着重要的作用(夏凌峰等，2016)。KCS又称脂肪酸延长酶，是在内质网中催化超长链脂肪酸合成的第1步缩合反应的限速酶，决定超长链脂肪酸的碳链长度，掌握其动态变化对定向调控南美油藤种子的油脂成分、提供有益脂肪酸具有重要的作用(杨慧等，2012；Fan et al., 2018)。本研究中对基因KCS5的分析结果表明，南美油藤种子中KCS5对脂肪酸含量的累积和油酸、亚油酸、α-亚麻酸的合成具有显著促进作用，因此KCS5基因可作为调控脂肪酸组分的候选基因，通过基因改良技术改变南美油藤种子中目的脂肪酸的相对含量。

植物脂肪酸的代谢途径中，LACS能将游离脂肪酸活化成酰基辅酶A，是调控脂肪酸代谢的重要酶(邓舒雅等，2018)。本研究中3个酶基因LACS的转录本表达量亦表现出与代谢物含量不同的相关关系。其中LACS1酶基因的表达与脂肪酸总含量和5种主要脂肪酸含量呈负相关关系，即抑制脂肪酸的合成与累积；而LACS2和LACS8酶基因的表达与脂肪酸总含量和5种主要脂肪酸含量呈显著正相关关系，即促进脂肪酸的合成与累积。由此说明，LACS基因家族中不同成员存在生物学功能的差异性和多样性，这与顾守来等(2012)和邓舒雅等(2018)分析结果一致。

SAD是植物脂肪酸合成代谢的关键酶，位于质体基质中(曾艳玲等，2014)，作用于硬脂酰-ACP (stearoyl-ACP)生成油酰基-ACP(C18：1-ACP)，乙酰-CoA合成酶(acetyl-CoA synthase，ACS)将油酰基-ACP转化成油酰-CoA，再在硫脂复合酶(acyl-coenzyme A thioesterase)的作用下形成油酸(C18：1)(Fofana et al., 2006)。本研究中SAD酶基因(Unigene0012943)在南美油藤种子成熟阶段的超高表达及与代谢物含量呈正相关关系说明SAD基因是南美油藤种子脂肪酸合成的关键调控基因。

利用代谢组学与转录组学结合的方式，对南美油藤种子脂质代谢物和差异表达基因的动态关联分析表明，南美油藤种子成熟阶段前后脂肪酸含量存在显著差异，可将5个生长阶段划分为油脂缓慢累积时期和油脂快速累积时期，亚油酸和α-亚麻酸的含量可作为南美油藤生长时期的判别依据。通过分析6个脂肪酸代谢中的关键调控基因的动态变化与脂肪酸含量的相关关系发现，关键酶基因的表达模式与脂肪酸的合成和累积存在显著的相关性，其中FAD2-3、FAD7、FATA、KAS2、LACS2、LACS8和SAD酶基因的表达对南美油藤种子脂肪酸的累积具有积极的促进作用，而FAD2-2、KCS1、KCS10和LACS1酶基因则对种子油脂的合成和累积起到了一定的抑制作用。根据同一基因家族不同成员基因的功能分析表明，相同基因家族的不同成员可能存在不同的生物学功能，但各个基因特定的生物学功能还需进一步研究确认。