林业科学  2019, Vol. 55 Issue (4): 84-96   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20190409
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文章信息

郭松, 李在留, 薛建辉, 李雪萍, 陈晶晶.
Guo Song, Li Zailiu, Xue Jianhui, Li Xueping, Chen Jingjing.
掌叶木不同种源种子的经济性状
Economic Properties of Seeds of Handeliodendron bodinieri from Different Provenances
林业科学, 2019, 55(4): 84-96.
Scientia Silvae Sinicae, 2019, 55(4): 84-96.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20190409

文章历史

收稿日期:2018-05-28
修回日期:2018-10-19

作者相关文章

郭松
李在留
薛建辉
李雪萍
陈晶晶

掌叶木不同种源种子的经济性状
郭松1,2, 李在留2, 薛建辉1,3, 李雪萍4, 陈晶晶2     
1. 南京林业大学 江苏省林业生态工程重点实验室 南京 210037;
2. 广西大学林学院 南宁 530004;
3. 江苏省中国科学院植物研究所 南京 210014;
4. 河南科技大学林学院 洛阳 471003
摘要:【目的】研究掌叶木种子千粒质量、出仁率、含油率和籽油脂肪酸等经济性状在种源间的差异及变异规律,评估并筛选最优生物柴油原料种源。【方法】以广西乐业、田林、凤山、环江和贵州独山5个种源掌叶木种子为试验材料,测定千粒质量和出仁率后,采用索氏抽提法分别测定种子、种仁和种皮含油率,利用气相色谱法分析籽油脂肪酸组成和含量;对种子经济性状间及其与地理-气候因子进行相关性分析,并对各种源进行聚类分析;基于脂肪酸燃料特性因子对各种源进行评估。【结果】1)各种源间的种皮含油率差异不显著,千粒质量、出仁率、种子和种仁含油率差异均极显著(P < 0.01),此5个性状在种源间变异系数均值为13.7%,其中凤山种源除种皮含油率外,千粒质量(210.02 g)、出仁率(68.89%)、种子含油率[43.23 g·(100 g)-1]和种仁含油率[56.56 g·(100 g)-1]均最高。2)掌叶木籽油含有14种长链脂肪酸,包括6种饱和脂肪酸、5种单不饱和脂肪酸和3种多不饱和脂肪酸,其中不饱和脂肪酸平均质量分数高达94.08%,种源间变异系数仅为0.53%;8种主要脂肪酸(质量分数>1%)占籽油脂肪酸组成的98.19%,它们在种源间的变异系数均值为7.21%,其中神经酸平均质量分数(7.8%)排在已知含有神经酸木本植物第4位。3)相关性分析结果表明:种子含油率与种仁含油率呈极显著正相关(P < 0.01,R=0.997);除亚麻酸外,主要脂肪酸间均呈较多的显著或极显著相关,这些脂肪酸按碳链长度22划分为2大类群,群内各组分相互促进,群间反促进;千粒质量与亚麻酸、出仁率与饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸、种子含油率与棕榈酸、亚油酸、芥酸和单不饱和脂肪酸均呈极显著相关(P < 0.01),相关系数分别为-0.983、-0.964、0.964、-0.998、-0.981、0.995和0.976;种子经济性状与地理-气候因子间的相关性不显著。4)聚类分析结果显示:5个种源被分为3组,其中,乐业和独山2个种源聚为一组,田林和环江2个种源聚为一组,凤山种源单独聚为一组。5)掌叶木籽油作为生物柴油原料须分离木焦油酸和神经酸,且不能满足冷滤点-10℃要求,凤山种源各项评估数值均为最优。【结论】掌叶木种子千粒质量、出仁率、种子含油率和种仁含油率等经济性状在种源间存在丰富变异;籽油经济利用价值较高,籽油低温流动性较好,主要脂肪酸质量分数在种源间离散程度和变异幅度均较小,性状稳定;种子经济性状受地理-气候因子影响不显著,在种源间具有随机变异的特点,且广西凤山为最优生物柴油原料种源。
关键词:掌叶木    种子经济性状    脂肪酸    燃料特性    变异    
Economic Properties of Seeds of Handeliodendron bodinieri from Different Provenances
Guo Song1,2, Li Zailiu2, Xue Jianhui1,3, Li Xueping4, Chen Jingjing2     
1. Jiangsu Key Laboratory of Forestry Ecological Engineering Nanjing Forestry University Nanjing 210037;
2. College of Forestry, Guangxi University Nanning 530004;
3. Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences Nanjing 210014;
4. College of Forestry, Henan University of Science and Technology Luoyang 471003
Abstract: 【Objective】The difference and variation patterns of seed economic properties of 1 000-grain weight, kernel rate, oil yield, and seed oil fatty acid of Handeliodendron bodinieri among provenances were studied, and the best provenance for biodiesel material was evaluated and screened.【Method】Seeds of H. bodinieri from five provenances including Leye, Tianlin, Fengshan, and Huanjiang in Guangxi, and Dushan in Guizhou were used as experimental materials. The oil yield of seed, seed kernel and seed coat was determined by Soxhlet extraction after measuring the 1 000-grain weight and kernel rate. The fatty acid composition and content of seed oil were analyzed by gas chromatography. Correlation analysis among seed economic traits and between the traits and geographic-climatic factors were conducted, and cluster analysis of different provenances was performed. On the basis of fuel property of fatty acids, evaluation of different provenances was conducted.【Result】1) The difference in oil content of seed coat among different provenances was not significant, but extremely significant (P < 0.01) in 1 000-grain weight, kernel rate, seed oil yield and seed kernel oil yield, and the average coefficient of variation of these five traits among provenances was 13.7%, in which, 1 000-grain weight (210.02 g), kernel rate (68.89%), seed oil yield (43.23 g·(100 g)-1) and seed kernel oil yield (56.56 g·(100 g)-1) of Fengshan provenance were all the highest except for seed coat oil yield. 2) 14 long chain fatty acids, including 6 saturated fatty acid, 5 monounsaturated fatty acids and 3 polyunsaturated fatty acids were found in the seed oil of H. bodinieri, among which the average mass fraction of unsaturated fatty acid was as high as 94.08%, and the average coefficient of variation among provenances was only 0.53%. Eight major fatty acids (mass fraction >1%) accounted for 98.19% of the total fatty acid of seed oil, and their average coefficient of variation among provenances was 7.21%, among them the average mass fraction of nervonic acid (7.80%) was ranked the 4th in the list of woody plants known to contain nerve acid. 3)The correlation analysis showed that there was an extremely significant positive correlation(P < 0.01, R=0.997) between oil yield of seed and kernel. There were many significant or extremely significant correlations between the major fatty acids except linolenic acid. These main fatty acids were divided into two groups according to the length of carbon chain 22, and promoted each other within group, but reversely promoted between groups. There were extremely significant correlations(P < 0.01)among 1 000-grain weight with linolenic acid, kernel rate with saturated and unsaturated fatty acids, seed oil yield with palmitic acid, linoleic acid, erucic acid and single unsaturated fatty acids, and their correlation coefficients were -0.983, -0.964, 0.964, -0.998, -0.981, 0.995 and 0.976, respectively. The correlations between seed economic traits and geographic-climatic factors were not significant. 4) The cluster analysis showed that five provenances were clustered in 3 groups, in which, 2 provenances of Leye and Dushan were clustered in one group, 2 provenances of Tianlin and Huanjiang were clustered in one group, and Fengshan provenance was separately clustered in one group. 5) As raw material for biodiesel, the tetracosanoic acid and nervonic acid must be isolated from the seed oil of H. bodinieri which could not meet the CFPP requirement of -10℃. All the evaluated values of Fengshan provenance were the best.【Conclusion】There are abundant variation among provenance of seed economic traits of 1 000-grain weight, kernel rate, seed oil yield, seed kernel oil yield of H. bodinieri. The economic utilization value of seed oil is higher and the low temperature fluidity of seed oil is better. Mass fractions of major fatty acids are in a stable condition with a small degree of dispersion and variation among provenances. The seed economic traits are not significantly affected by geographic-climatic factors and have the characteristics of random variation among provenances, and Fengshan is the best provenance for raw material for biodiesel.
Key words: Handeliodendron bodinieri    seed economic trait    fatty acid    fuel property    variation    

掌叶木(Handeliodendron bodinieri)为中国特有植物,隶属无患子科(Sapindaceae)掌叶木属(Handeliodendron),仅分布于云南东南部、广西西北部和贵州南部海拔500~1 500 m的岩溶石山地区,现处于濒危状态,属国家Ⅰ级重点保护植物(贵州省林业厅,2000金鉴明等,1992)。掌叶木根系发达,耐瘠薄,能够在裸露的岩石上生长,花果艳丽,叶形奇特,是一种适合当地生长的优良造林绿化树种(李在留等,2015);其种子含油率为42.92%(陈波涛等,2007),种仁含油率高达52.6%(吕清华等,1980),曾被当地人作为食用油来源之一(Wang et al., 2008);掌叶木还被评为贵州省生物柴油原料林优先选择树种(陈波涛等,2010)之一。由于油料植物的经济价值主要集中于种子油脂中,而油脂在食用和工业上具有重要地位和战略价值,因此,对木本油料植物掌叶木的种子经济性状开展相关研究具有重要意义。

木本油料植物可以在不适合作物生长的边际土地上种植,具有“不与粮争地、不与人争粮”的优点(许新桥等,2015),还可增加山区贫困居民就业和收入。而生物柴油利用的关键制约因素是原料不足,可通过人工选育优良生物柴油特性品种、扩大种植规模,提高质量和产量进行解决。可见科学发展掌叶木产业,能在一定程度上解除掌叶木的濒危状态和解决石漠化贫困山区生态与经济问题。目前,虽有学者对掌叶木单个种源种子经济性状进行了相关研究(程菊英等,1981陈波涛等,2007曹丽敏等,2016陈晶晶等,2018),但尚未见多个种源掌叶木种子经济性状分析的研究报道。由于对掌叶木不同种源间种子特性和籽油脂肪酸组成特点的认知不足,一定程度上制约了掌叶木优良种源的筛选和育种工作。

鉴于此,在对掌叶木分布区域进行全面调查的基础上,对广西和贵州的5个掌叶木种源种子性状进行了分析,对各经济性状间及其与种源地地理气候因子进行了相关性分析,并对5个种源进行了聚类分析,基于脂肪酸燃料特性因子对5个种源进行了评价,旨在揭示掌叶木种子经济性状在种源间的变异规律及其与地理-气候因子的关系,评估并筛选最优生物柴油原料种源,为掌叶木的开发利用、良种选育和引种栽培提供基础研究数据。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

根据掌叶木分布范围的海拔变化,于2017年8—9月掌叶木种子成熟期,分别在广西乐业(Leye,LY)、田林(Tianlin,TL)、凤山(Fengshan,FS)、环江(Huanjiang,HJ)和贵州独山(Dushan,DS)5个种源随机选取10~20株生长正常、树龄10~20年、无明显缺陷和病虫害的母株,采样单株间距25 m以上。在各样株阳面树冠的中上部位随机采集10个果序,对取下的果实均匀混合作为该种源的供试材料。所选掌叶木种源均为当地起源、天然群体,结实情况为平年或大年,相关地理和气候条件见表 1

表 1 供试5个掌叶木种源地的地理和气候条件 Tab.1 Geographical and climatic conditions of 5 test provenances of Handeliodendron bodinieri

试剂包括60~90 ℃沸程的石油醚、氢氧化钠、无水硫酸钠、氯化钠、三氟化硼甲醇溶液(质量分数为15%),均为分析醇;甲醇、正庚烷,均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

电子分析天平,上海梅特勒-托利多仪器有限公司;DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;DFT-200手提式高速万能粉碎机,温岭市林大机械有限公司;OM-6A索氏提取器,上海欧蒙实业有限公司;N-1200B旋转蒸发仪,上海泉杰仪器有限公司;500 mL真空抽滤器,津腾玻璃仪器有限公司;HHS型电热恒温水浴锅,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;AGILENT 7890A气相色谱仪,美国AGILENT公司。

1.3 测定内容与方法 1.3.1 千粒质量与出仁率

将收集到的各种源掌叶木果实手工剥去果皮和假种皮,对气干种子参照GB/T 5519—2008标准测量千粒质量(1 000-grain weight,GW),参照GB/T 5499—2008标准测定出仁率(kernel rate,KR),各性状指标均重复测定3次,结果取平均值。

1.3.2 种子、种仁和种皮含油率

参照GB 5009.6—2016标准,采用索氏抽提法,对各种源种子、种皮及种仁样品于烘箱中65 ℃烘干至恒质量,分别用粉碎机粉碎,过40目筛,称取5.000 g的样品粉末放入索氏提取器的脱脂滤纸筒中,连接已干燥且恒重的脂肪接收瓶及冷凝管,由于预实验发现相同样品质量和同等实验条件下沸程为60~90 ℃的石油醚提取得到的含油率比沸程为30~60 ℃的石油醚约高15.12%,因此加入150 mL沸程为60~90 ℃的石油醚于80 ℃水浴上加热回流8 h。抽提结束后,用0.45 μm的有机滤膜真空抽滤去除杂质,旋转蒸发回收溶剂,并置于45 ℃烘箱烘干至恒重,测出种子、种仁及种皮油质量,分别计算种子含油率(seed oil yield,SOY)、种仁含油率(seed kernel oil yield,SKOY)和种皮含油率(seed coat oil yield,SCOY),各性状指标测定均重复3次,结果取平均值。

1.3.3 掌叶木籽油脂肪酸的测定

参照GB 5009.168 —2016标准,采用三氟化硼甲酯化,分别取不同种源掌叶木种子油脂样品200 mg,加入2%氢氧化钠甲醇溶液8 mL,连接回流冷凝器,80 ℃水浴上回流,直至油滴消失,每1 min缓慢摇动烧瓶,以防止氢氧化钠形成固态附着于瓶壁。从回流冷凝器上端加入15%三氟化硼甲醇溶液7 mL,在80 ℃水浴中继续回流2 min,用少量水冲洗回流冷凝器。停止加热,从水浴上取下烧瓶,迅速冷却至室温。准确加入20 mL正庚烷,振摇2 min,再加入饱和氯化钠水溶液,静置分层。吸取上层正庚烷提取溶液至25 mL试管中,加入大约3 g左右无水硫酸钠,振摇1 min,静置5 min,吸取上层溶液用于气相色谱分析。气相色谱条件为:色谱柱名称ZB-FFAP(柱长30 m,内径0.25 mm,膜厚0.25 μm);FID检测器,温度250 ℃;进样口温度240 ℃;载气为氮气;初始温度170 ℃,2 ℃·min-1升温至230 ℃,保持5 min;分流进样,分流比为30:1;进样量为1 μL。各样品试验测定均重复3次,结果取平均值。

1.4 数据处理与分析

利用Excel2010进行基础数据的录入与统计;利用SPSS22.0对相关数据进行Pearson相关性分析,并采用Duncan法对相关数据进行多重比较。采用离差平方和法,根据平方欧氏距离对各种源进行聚类分析,参考脂肪酸不饱和度、饱和碳链长度因子、冷滤点计算公式(王利兵等,2012a)评估不同种源掌叶木籽油的燃料特性,具体如下:

$ \begin{aligned} \mathrm{DU}=& \sum\nolimits_{i=1}^{d} \mathrm{MFA}_{i}+2 \times \sum\nolimits_{i=1}^{e} \mathrm{BUFA}_{i}+3 \times \\ & \sum\nolimits_{i=1}^{h} \mathrm{TUFA}_{i}+4 \times \sum\nolimits_{i=1}^{k} \mathrm{QUFA}_{i};\end{aligned} $ (1)
$ \mathrm{LCSF}=\sum\nolimits_{i=1}^{n}\left(\mathrm{MP}_{i} \times \mathrm{SFA}_{i}\right) / 100;$ (2)
$ \mathrm{CFPP}=1.7556 \times \mathrm{LCSF}-14.772。$ (3)

式中:DU为脂肪酸不饱和度(degree of unsaturation,DU),MFAi为第i个单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MFA)质量分数,BUFAi为第i个二元不饱和脂肪酸(binary unsaturated fatty acid,BUFA)质量分数,TUFAi为第i个三元不饱和脂肪酸(ternary unsaturated fatty acid,TUFA)质量分数,QUFAi为第i个四元不饱和脂肪酸(quaternary unsaturated fatty acid,QUFA)质量分数;LCSF为饱和碳链长度因子(long chain saturated factor,LCSF),MPi为第i个饱和脂肪酸熔点(melting point,MP),SFAi为第i个饱和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)质量分数;dehkn为样品籽油所含对应类型脂肪酸个数;CFPP为冷滤点(cold filter plugging point,CFPP)。

2 结果与分析 2.1 掌叶木不同种源种子千粒质量、出仁率及含油率分析

掌叶木不同种源种子千粒质量、出仁率、种子含油率、种仁含油率和种皮含油率的比较和分析结果见表 2。结果表明:掌叶木种子油脂集中于种仁;凤山种源的千粒质量(210.02 g)、出仁率(68.89%)、种子含油率[43.23 g·(100 g)-1]和种仁含油率[56.56 g·(100 g)-1]均最高,且千粒质量大于茂兰种源的201.66 g(熊志斌等,2003),种子含油率大于荔波种源的42.92 g·(100 g)-1(陈波涛等,2007),种仁含油率大于凌云种源的52.6 g·(100 g)-1(吕清华等,1980),仅出仁率略低于茂兰种源的69.93%(曹丽敏等,2016),说明凤山种源的种子相关性状不仅在5个测试种源中最优,也在已有种源报道中较优;田林种源的千粒质量最低仅为128.76 g,其他指标非最差,说明种子各性状既受到种源品质影响,还受到外部环境条件影响;环江种源的出仁率、种子含油率和种仁含油率均为最低,说明环江种源的种子相关性状较差。

表 2 掌叶木不同种源种子千粒质量、出仁率及含油率的比较和分析 Tab.2 Comparison and analysis on 1 000-grain weight, kernel rate, oil content in H. bodinieri seeds from different provenances

多重比较结果显示:除种皮含油率外,千粒质量、出仁率、种子含油率和种仁含油率性状均在3个或3个以上种源间存在显著差异和极显著差异,说明这些性状在不同种源间多样性较高。方差分析结果表明:各种源间种皮含油率差异不显著,其他4个性状差异均极显著(P < 0.01),也说明这些性状在不同种源间多样性较高。从5个性状种源内变异系数均值比较来看,独山种源最大(7.01%),乐业种源最小(3.57%),说明这些性状在独山种源的稳定性最差,而在乐业种源的稳定性最好。从5个性状种源间变异系数来看,千粒质量和种子含油率变异系数分别为16.64%和14.85%,均高于种源间性状的变异系数均值(13.70%),说明这些性状在种源间存在较为丰富的变异,在掌叶木种子油脂生产中需重视种源的选择。

由于种皮含油率均值仅为0.99 g·(100 g)-1左右,且在种源间差异不显著,变异系数较大,不具有生产实践价值,因此,本次研究选择掌叶木不同种源种子为对象提取油脂并进行脂肪酸组分检测与分析。

2.2 掌叶木不同种源籽油脂肪酸组成分析

经气相色:谱分析检测(图 1图 1表 3中凤山种源籽油气相色谱图),掌叶木籽油共含有14种脂肪酸组分,分别为棕榈酸(C16:0)、十七烷酸(C17:0)、十七碳一烯酸(C17:1)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、花生酸(C20:0)、花生一烯酸(C20:1)、花生二烯酸(C20:2)、山嵛酸(C22:0)、芥酸(C22:1)、木焦油酸(C24:0)和神经酸(C24:1),保留时间依次为5.058、6.283、6.654、7.873、8.360、9.223、10.568、11.983、12.590、13.689、17.344、18.096、23.112、23.861 min,其中,籽油含有6种饱和脂肪酸,5种单不饱和脂肪酸,3种多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PFA)。5个种源的籽油脂肪酸类型基本相同,检测分析结果见表 3,籽油组成在类型上与凌云(程菊英等,1981)和荔波(陈波涛等,2007)种源差异较大,分别达到8种和7种;与茂兰(曹丽敏等,2016)种源的差异较小,仅有4种;与上述各地仅棕榈酸、油酸和亚油酸相同,其中山嵛酸和神经酸为本课题组首次发现并经5个种源多次检测证实的脂肪酸类型。不同研究者检测的脂肪酸组分相差较大,这与检测年代、技术方法和仪器设备不同有关。

图 1 掌叶木籽油脂肪酸组分气相色谱 Fig. 1 The chromatogram of H. bodinieri seed oil fatty acid compositions
表 3 掌叶木不同种源籽油脂肪酸组成的统计分析 Tab.3 Statistical analysis of fatty acids composition in H. bodinieri seed oil from different provenances

从掌叶木籽油脂肪酸种源间汇总均值上看:质量分数最高的是芥酸(33.96%),其次是油酸(26.38%),再次是花生一烯酸(14.82%);其他大于1%的组分从大到小依次为亚油酸、神经酸、棕榈酸、亚麻酸、硬脂酸。此8种脂肪酸构成掌叶木籽油主要脂肪酸,占籽油脂肪酸组成的98.19%,它们在种源间的变异系数均值为7.21%,其中棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生一烯酸的质量分数与荔波种源(陈波涛等,2007)检验结果相近,说明掌叶木籽油主要脂肪酸质量分数在种源间较稳定,离散程度较小,大都集中于均值附近。由于本次检测的芥酸质量分数高达33.96%,而食用高芥酸含量油脂会危害人体健康,说明掌叶木籽油并不适合作食用油,但适合作精细化工原料(吴关庭等,2007)。

从掌叶木不同种源籽油脂肪酸均值比较上看,环江种源的棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、花生一烯酸、花生二烯酸平均质量分数最高,占籽油脂肪酸组成的55.67%;凤山的芥酸、神经酸平均质量分数最高,占籽油脂肪酸组成的41.76%;田林种源的亚麻酸平均质量分数最高,占籽油脂肪酸组成的1.32%;独山种源的山嵛酸、木焦油酸平均质量分数最高,占籽油脂肪酸组成的0.97%;乐山种源的十七烷酸、十七碳一烯酸平均质量分数最高,占籽油脂肪酸组成的0.27%;说明脂肪酸组成质量分数较好的是环江和凤山种源,且环江种源以C20之前的长链脂肪酸质量分数占优,凤山种源以C22之后的长链脂肪酸质量分数占优。

从掌叶木不同种源籽油脂肪酸饱和度上看,掌叶木籽油以不饱和脂肪酸为主,且多为单不饱和脂肪酸,其中环江种源的饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸质量分数最高,分别为6.55%和12.32%;凤山种源的不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)和单不饱和脂肪酸质量分数均为最高,分别为94.38%和84.52%。上述4类脂肪酸种源间变异系数均在9%以内,其中占主要组分的不饱和脂肪酸种源间变异系数仅为0.53%,说明掌叶木籽油饱和与不饱和脂肪酸平均质量分数在种源间变异幅度较小。

2.3 掌叶木种子经济性状间的相关性分析

掌叶木种子经济性状间的相关性分析结果见表 4。结果表明:千粒质量仅与亚麻酸呈极显著负相关(P < 0.01,R=-0.983);出仁率、种子与种仁含油率间及其与其他经济性状呈较多的显著或极显著相关,其中种子含油率与种仁含油率呈极显著正相关(P < 0.01,R=0.997),二者与其他经济性状间的相关性特点相似,说明通过种子含油率可推测种仁含油率与其他经济性状的相关性;种皮含油率与所有经济性状间均无显著性相关。

表 4 掌叶木种子经济性状间的相关系数 Tab.4 Correlation coefficients among seed economic traits of H. bodinieri

质量分数在1%以下的6种脂肪酸间呈较少的显著性相关,它们与质量分数在1%以上的脂肪酸间仅花生二烯酸与硬脂酸呈显著正相关(P < 0.05,R=0.903);质量分数在1%以上的8种主要脂肪酸间除亚麻酸外均呈较多的显著或极显著相关,其中油酸与花生一烯酸相关系数为0.999,与十七碳一烯酸相关系数为0.001,说明油酸的质量分数约为花生一烯酸的1.78倍,而油酸与十七碳一烯酸的质量分数不相关。

8种主要脂肪酸与饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸间均呈较多的显著或极显著相关,其中硬脂酸与饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸间均呈极显著相关(P < 0.01),相关系数分别为0.983和-0.983;棕榈酸、亚油酸和芥酸分别与单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸间均呈极显著相关(P < 0.01),相关系数分别为-0.985和0.960、-0.997和0.989、0.975和-0.961;神经酸与多不饱和脂肪酸呈极显著负相关(P < 0.01,R= -0.971)。由于饱和与不饱和脂肪酸相关系数为-1.000,说明二者质量分数之比约为3:47。

主要脂肪酸可通过碳链长度划分为2个类群,碳链长度在C16—C20的棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生一烯酸两两间均呈正相关,它们与碳链长度在C22—C24的芥酸和神经酸间均呈负相关,而芥酸与神经酸间呈正相关。根据主要脂肪酸相关性分析结果和文献(卢善发,2000范妙华等,2007蔡曼等,2018)研究,掌叶木籽油主要脂肪酸的生物合成途径如图 2所示,由此可见脂肪酸脱饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)和脂肪酸延长酶(fatty acid elongase,FAE)是控制油酸向多不饱和脂肪酸和更长链单不饱和脂肪酸转化的关键因素。

图 2 掌叶木籽油主要脂肪酸的生物合成途径模型 Fig. 2 Model for the pathway of main fatty acids biosynthesis in H. bodinieri seed oil 乙酰-CoA:乙酰辅酶A;丙二酰-CoA:丙二酰辅酶A;ACC:乙烯辅酶A羧化酶;FAS:脂肪酸合酶;SAD:硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶;FAD:脂肪酸脱饱和酶;FAE:脂肪酸延长酶。 乙酰-CoA: Acetyl-coenzyme A; 丙二酰-CoA: Malonyl-coenzyme A; ACC: Acetyl-coenzyme A carboxylase; FAS: Fatty acid synthase; SAD: Stearoyl-acyl carrier protein desaturase; FAD: Fatty acid desaturase; FAE: Fatty acid elongase.

表 4中千粒质量、出仁率和种子含油率与籽油脂肪酸间呈极显著相关的因子进行线性回归分析(图 3),得到亚麻酸与千粒质量的回归方程为y=2.359 3-0.006 2x; 饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸与出仁率回归方程分别为y=10.623 4-0.074 0x, y=89.376 6 + 0.074 0x; 棕榈酸、亚油酸、芥酸和单不饱和脂肪酸与种子含油率的回归方程分别为y=5.128 5-0.045 7x, y=14.707 2-0.135 7x, y=22.553 5 + 0.296 4x, y=75.154 7 + 0.206 6x。这为千粒质量、出仁率和种子含油率数据直接估算上述脂肪酸的质量分数提供便利。

图 3 呈极显著相关因子的回归分析 Fig. 3 Regression analysis of extremely significant correlation factors
2.4 掌叶木种子经济性状与地理-气候因子的相关性分析

掌叶木种子经济性状与地理-气候因子的相关性分析结果见表 5。结果表明:种皮含油率与平均海拔呈极显著正相关(P < 0.01,R=0.979),花生酸与经度呈极显著正相关(P < 0.01,R=0.983),木焦油酸与年均日照时间呈显著正相关(P < 0.05,R=0.925),十七烷酸与无霜期呈显著负相关(P < 0.05,R=-0.889),其他经济性状与地理-气候因子间均无显著性相关。由于种皮含油率很小,且花生酸、木焦油酸、十七烷酸在籽油中质量分数很小,说明掌叶木种子经济性状受地理-气候因子影响不显著。

表 5 掌叶木种子经济性状和地理-气候因子的相关系数 Tab.5 Correlation coefficients of seed economic traits of H. bodinieri with geographic-climatic factors
2.5 掌叶木不同种源种子经济性状的聚类分析

对掌叶木不同种源籽油14种脂肪酸,加上饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、千粒质量、出仁率、种子含油率、种仁含油率和种皮含油率共23个经济性状进行聚类分析(图 4)。结果表明:在平方欧氏距离为5处,供试5个种源被分为3组,其中,乐业和独山2个种源聚为一组,田林和环江2个种源聚为一组,凤山种源单独聚为一组。从地理分布上看,乐业经度大于田林而小于凤山,纬度大于凤山而小于环江,但与独山聚为一组;田林海拔大于独山而小于乐业,但与环江聚为一组;乐业和独山地理距离相差较大但聚为一组。各种源的聚类分析结果既没有体现种源地的地理距离远近和经纬度梯度变化,又没有体现种源地的海拔梯度变化,说明掌叶木种子经济性状在种源间未形成连续变异,具有随机变异的特点。

图 4 掌叶木不同种源种子经济性状的聚类分析 Fig. 4 Cluster analysis of seed economic traits in H. bodinieri from different provenances
2.6 掌叶木不同种源籽油脂肪酸燃料特性因子评估

综合国内外学者关于生物柴油评估标准(罗艳等,2007Jesus Ramos et al., 2009林铎清等,2009王利兵等,2012a2012b),从脂肪酸组成角度评估掌叶木不同种源籽油燃料特性,涉及内容包括饱和、不饱和、三烯、四烯及以上脂肪酸的质量分数,以及种子含油率、十六烷值、碘值、氧化安定性、冷滤点、碳链长度等因子,其中十六烷值、碘值、氧化安定性由脂肪酸不饱和度衡量,冷滤点由饱和碳链长度因子衡量,因文献已证明掌叶木籽油作为生物柴油原料满足运动黏度1.9~6.0 mm2·s-1要求(林铎清等,2009),评估未纳入运动黏度因子,相关统计数据见表 6。结果表明:项目1-7各种源除环江种子含油率小于生物柴油标准外,其他均满足要求;项目8各种源籽油饱和碳链长度因子均小于8.41,能满足冷滤点0 ℃标准,通过公式(3)估算得出掌叶木籽油作为生物柴油原料的冷滤点在-8.05~-6.98 ℃之间,因此各种源籽油均不能满足冷滤点-10 ℃标准;项目9中各种源籽油均含有碳链长度大于22的脂肪酸,平均质量分数为8.10%左右,需要分离这些组分才能满足掌叶木籽油作为生物柴油原料的要求。

表 6 掌叶木不同种源籽油脂肪酸燃料特性因子评估 Tab.6 Evaluation of fatty acids fuel property factors in H. bodinieri seed oil from different provenances

从脂肪酸燃料特性因子评估生物柴油原料适用性最主要的是种子含油率和不饱和脂肪酸质量分数,通过二者乘积得到掌叶木各种源籽油适用生物柴油原料从高到低排序为凤山、乐业、独山、田林,其中环江种源因种子含油率低于30%未达到生物质柴油原料种源标准。由于脂肪酸燃料特性因子评估标准只规定了最大或最小值,凤山种源各项评估数值均为极大或极小,因此,凤山为掌叶木最优生物柴油原料种源。

3 讨论

本次研究测定掌叶木籽油脂肪酸的类型包括已有研究报道外,还含有山嵛酸和神经酸,其中神经酸质量分数均值达7.8%,排在31种已发现含有神经酸植物第6位,排在木本植物第4位,仅次于蒜头果(Malania oleifera)、盾叶木(Macaranga adenantha)和鸡爪槭(Acer palmatum)(马柏林等,2004)。由于神经酸是人类大脑发育必须物质(Farquharson et al., 1992),对推迟衰老有很大作用(王性炎等,2010),神经酸成分的检测结果显著提升了掌叶木籽油的经济利用价值。

8种主要脂肪酸(质量分数>1%)除亚麻酸外,两两间均呈现较多的显著或极显著相关,其中棕榈酸碳链最短,但与其他多个脂肪酸呈显著性相关,符合脂肪酸从头合成的规律(赵翠格等,2010);神经酸与芥酸呈显著正相关符合前者是后者碳链加长形成的特点(Sandhir et al., 1998),同时表明在自然界中选育低芥酸高神经酸掌叶木种质不可兼得。研究发现掌叶木籽油主要脂肪酸可通过碳链长度划分为2个类群,碳链长度在C16—C20的棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生一烯酸6种脂肪酸质量分数两两间均呈正相关,与C22—C24的芥酸和神经酸2种脂肪酸均呈负相关,而芥酸与神经酸的质量分数呈正相关,说明2类群此消彼长,群内相互促进,群间反促进。由于芥酸在精细化工和神经酸在营养保健中有着重要利用价值,为获得高芥酸和高神经酸含量的掌叶木种质,基于掌叶木籽油主要脂肪酸的生物合成途径模型,思路一是参考Mietkiewska等(2007)方法,通过提取高芥酸含量植物中的脂肪酸延长酶(FAE)基因导入到掌叶木中以提高籽油芥酸含量,进而增加神经酸含量;思路二是参考Jadhav等(2005)方法,通过抑制或下调脂肪酸脱饱和酶(FAD)相关基因,减少油酸向亚油酸和亚麻酸的转化,促进油酸向长链单不饱和脂肪酸转化从而提高掌叶木籽油芥酸和神经酸含量。针对自然状态下无法选育低芥酸高神经酸掌叶木种质的难题,可参考Taylor等(2009)从高神经酸含量植物碎米荠(Cardamine graeca)中克隆到3-酮脂酰-CoA合酶(3-ketoacyl-coenzyme A synthase,KCS)基因,将其导入拟南芥(Arabidopsis thaliana)和埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)中使得神经酸含量显著增高的方法,对掌叶木种质进行基因改良加以解决。由于脂肪酸合成是一个复杂的生理生化过程,既包括环境因子影响,也涉及到多种酶的协同表达和细胞结构的参与,因此还有待进一步研究掌叶木种子发育过程中脂肪酸延长酶和脱饱和酶的种类和数量,以及籽油脂肪酸种类与质量分数的动态变化,为掌叶木种子油脂合成调控和遗传改良提供基础数据。

根据掌叶木籽油主要脂肪酸质量分数在不同种源间相对稳定的特点,利用掌叶木种子千粒质量、出仁率和含油率经济性状指标,建立回归方程估算棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、芥酸以及饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸质量分数,这为掌叶木籽油相关脂肪酸的产量估算提供参考依据。研究发现掌叶木种子经济性状受地理-气候因子的影响不显著,聚类分析表明种子经济性状在种源间具有随机变异而无连续变异的特点,结合已有学者认为喀斯特地貌并未造成掌叶木基因流动障碍(He et al., 2012),说明在维护掌叶木种质资源的多样性上,就地保护和迁地保护显得同等重要,同时还说明掌叶木生存和分布空间广阔,例如,掌叶木异地引种向北推进1°成功(张著林等,2006),云南富宁县海拔1 500 m以上区域发现了掌叶木(陈星星等,2017)。因此,建议应用掌叶木在西南喀斯特地区进行造林绿化,但关于掌叶木能否适合广东、湖南、重庆、四川等喀斯特地区还有待进一步研究。

掌叶木籽油以不饱和脂肪酸为主,约占整个脂肪酸组分的94.08%。高不饱和脂肪酸增加了细胞膜的流动性,增强了植物抗逆境能力,还使油脂保持较好的低温流动性,从而被许多学者认为适合作为生物柴油原料使用(陈波涛等,2010曹丽敏等,2016),但也有学者认为掌叶木籽油不适合作为生物柴油原料使用(林铎清等,2009)。本研究基于脂肪酸燃料特性因子评估认为掌叶木籽油作生物柴油原料需满足一定要求和处理:一是评估推断出掌叶木籽油作为生物柴油的冷滤点在-8.05~-6.98 ℃之间,不能满足冷滤点-10 ℃要求,但可与石油柴油调和(陈秀等,2010)或添加降凝剂如聚α-烯烃(Xue et al., 2016)降低冷滤点改善其低温适用性;二是高不饱和脂肪酸造成氧化安定性差,需要添加抗氧化剂如丁基羟基茴香醚、酸丙酯等(Kumar,2017)加以解决;三是需要去除碳链长度大于22的脂肪酸组分,可采用添加催化剂,优化反应条件如减压蒸馏、调和、结晶分馏等措施进行处理(陈秀等,2009)。由于掌叶木籽油脂肪酸碳链长度大于22的绝大部分为神经酸,木焦油酸极少,而神经酸具有高经济价值,如能有效分离神经酸组分,则可实现掌叶木籽油的综合高效利用。现有学者探讨了元宝槭(Acer truncatum)油提取神经酸并制备生物柴油的技术(史宣明等,2013)和采用酯交换法富集神经酸于人造奶油中用于食品加工(Hu et al., 2017),可为掌叶木籽油神经酸利用提供参考。

4 结论

掌叶木各种源间的种皮含油率差异不显著,千粒质量、出仁率、种子和种仁含油率差异均极显著(P < 0.01),存在丰富变异。籽油以不饱和脂肪酸为主,油脂低温流动性较好。主要脂肪酸质量分数在种源间离散程度和变异幅度均较小,性状稳定,其中神经酸质量分数排在已知含有神经酸木本植物第4位的检测结果显著提升了掌叶木籽油的经济利用价值。掌叶木种子经济性状受地理-气候因子影响不显著,在种源间未形成连续变异,具有随机变异的特点,且凤山为最优生物柴油原料种源。

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