针叶小爪螨(Oligonychus ununguis)俗称板栗红蜘蛛、杉木红蜘蛛，属叶螨科(Tetranychidae)小爪螨属(Oligonychus)，广泛分布于亚洲、欧洲、澳洲、美洲的众多国家。该螨食性广，寄主植物包括松科(Pinaceae)、柏科(Cupressaceae)、杉科(Taxodiaceae)等针叶树和壳斗科(Fagaceae)、黄杨科(Buxaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、蔷薇科(Rosaceae)等阔叶树(Bolland et al., 1998; Migeon et al., 2017)。我国重要树种杉木(Cunninghamia lanceolata)和板栗(Castanea mollissima)上的重要害螨一直被认为是针叶小爪螨(王慧芙，1981；张时敏，1982；孙绪艮等，1990)，但研究发现，该螨的浙江杉木种群不能在板栗、麻栎(Quencus acutissima)等阔叶树上存活，山东板栗种群也不能在杉木、黑松(Pinus thunbergii)、赤松(P.densiflora)等针叶树上存活(孙绪艮等，2000)，2种群在形态上也有一定差异(尹淑艳等，2010a)，在线粒体COⅠ基因和核糖体ITS2基因核苷酸组成上也存在较明显差异，并且2种群间存在双向的生殖不亲和(尹淑艳等，2010b)，而且这种不亲和可以排除地理隔离的影响，因为浙江板栗种群与山东板栗种群间的杂交是完全亲和的(孙绪艮等，2000)。

根据生物学物种的概念，生殖上完全隔离的2个群体应该是2个不同的种，但对内共生菌Wolbachia和Cardinium等的研究使得生物学物种的概念受到挑战。内共生菌Wolbachia和Cardinium对其宿主的生殖具有调控作用，能引起胞质不亲和等生殖异常现象(Groot et al., 2006; Xie et al., 2006; Gotoh et al., 2007; Werren et al., 2008; 刘颖等，2010；Xie et al., 2010; 陆明红等，2011；Zhu et al., 2012; 张艳凯等，2014)。为了解内共生菌在针叶小爪螨山东板栗种群(TSBL)和浙江杉木种群(ZJSM)间生殖不亲和中的可能作用，笔者检测了这2个种群内共生菌的感染情况，结果表明，2个种群均未感染Wolbachia和Cardinium，排除了Wolbachia和Cardinium引起2种群生殖不亲和的可能性(孙菲等，2017)，说明板栗和杉木上的叶螨为2个不同的种。

许多有关昆虫与植物间关系的研究发现，植食性昆虫具有缩小或扩大其寄主范围或转移到新寄主上的进化潜力，这种现象可使种群间产生完全的生殖隔离进而导致与寄主有关的物种形成(Via, 1990)。对取食不同寄主植物的柑橘全爪螨(Panonychus citri)的研究，发现了一个新的姊妹种P. osmanthi(Ehara et al., 2011)。

大多数螨类体型微小(< 0.5 mm)，可用于鉴定的特征有限，加之同一物种的个体差异、雌雄差异以及形态的可塑性等，使得螨类的形态鉴定比较困难，以致于单靠外部形态鉴定的物种有时不准确，如世界范围分布的二斑叶螨(Tetranychus urticae)有44个异名(Bolland et al., 1998)。分子生物型学技术在螨类中的应用，解决了不少传统分类难以鉴定或同物异名与异物同名的问题，如Vargas等(2005)将形态特征与分子数据结合分析，认为3种不同寄主上的Geomylichus texanus应该为3个不同的物种；Kanouh等(2010)证明Neoseiulella tiliarum和N. formosa、N. squamiger和N. aceri是同物异名等。28S rDNA是编码细胞质核糖体大亚基中28S rRNA的基因，由于其重要的生物学功能，在进化过程中比较保守，同时在保守序列中也含有12个高变区，适合于从种级到科级水平上的系统发育关系研究，在昆虫许多类群的分类研究中已得到验证(江世宏等，2009)，在螨类中也有应用(李国庆等，2010；Skoracka et al., 2010; Matsuda et al., 2012；2014; Lehmitz et al., 2017)。

已有研究表明，山东板栗和浙江杉木上的“针叶小爪螨”为2个不同的种，且已排除地理隔离、内共生菌的影响。那么，这2个种是由于长期适应不同寄主植物分化而成还是由于错误鉴定造成？为了明确这个问题，本研究测定比较了其28S rDNA的部分片段，并基于28S rDNA序列构建了小爪螨属多个物种的系统发育树。

供试针叶小爪螨与尹淑艳等(2010b)所用的针叶小爪螨为同一批次采集的，为叙述方便，杉木和板栗上的叶螨仍分别称为杉木种群(ZJSM)和板栗种群(TSBL)，其雌成螨分别采自浙江省富阳市(119°97′E，30°05′N)和山东省泰安市(117°09′E，36°20′N)，置于无水乙醇中，在-20 ℃保存备用。

DNA提取方法参照O’Neill等(1992)：将用酒精保存的单头雌成螨浸入蒸馏水中除去酒精，移入TE缓冲液(10 mmol·L^-1 Tris-HCl，1 mmol·L^-1 EDTA，pH 8.0)中浸泡1 h，然后将虫体转移至25 μL STE buffer(100 mmol·L^-1 NaCl，10 mmol·L^-1 Tris-HCl，1 mmol·L^-1 EDTA，pH 8.0)中充分研磨，研磨后将离心管置于冰上并向离心管内加2 μL蛋白酶K(10 mg·mL^-1)。简单离心后，37 ℃下孵育30 min。95 ℃初始变性5 min。简单离心后，-20 ℃保存或立即取上清(2 μL)作为模板进行PCR。

DNA质量检测  使用线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COⅠ)片段进行检测，所用引物为5′-TGGGTTTGGAATAGTTTCTCA-3′和5′-CTGTAAATC CTCCAATGGAAA-3′，PCR反应体系和反应条件参照尹淑艳等(2010b)。只有得到阳性PCR产物的模板继续用于下一步28S rDNA扩增。

所用引物为5′-GGTGTAGCATAAGTGGGAGY-3′与5′-TCGCAATGAAGGAAGAGCC-3′(根据小爪螨属其他叶螨的28S rDNA两端的保守序列设计)。PCR反应总体系为25 μL，其中含有2 μL DNA溶液，2×Es Taq MasterMix(康为世纪)12.5 μL，上下游引物(10 μmol·L^-1)各1 μL，超纯水8.5 μL。反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min，30个循环后72 ℃保温10 min。扩增产物用含有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳检测。

电泳检测为阳性的PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司纯化、双向测序。将所测得序列在NCBI网站上进行BLAST，以确定所得到的是否为目的序列。所得序列用BioEdit(Version 7.0)软件中的ClustalW进行比对，辅以人工校正，计算序列一致性。

从NCBI网站上下载小爪螨属其他种的28S rDNA序列，用MEGA5.2软件中的ClustalW进行序列比对，并基于Tamura-Nei模型，计算遗传距离，采用邻接法(neighbor-joining，NJ)、最大似然法(maximum likelihood，ML)、最小进化法(minimum-evolution，ME)构建系统发育树，系统树各分支的置信度(Bootstrap)均进行1 000次的重复检验，发育树各分支上只显示高于50%的Bootstrap值。

从板栗和杉木种群中各随机取了3个个体扩增了28S rDNA的部分片段，扩增产物送上海桑尼生物科技有限公司纯化、双向测序。所得序列经BLAST比对确定为目的序列，且每个种群的3个样本的序列完全一致，无种群内变异。2种群的28S rDNA在Genbank中的登录号分别是KU886557(板栗种群)和KU886556(杉木种群)，序列比对见图 1，比对长度为606个碱基。606个位点中没有插入/缺失，共有10个变异位点，2种群间序列一致性为98.3%，遗传距离为1.7%(表 1)。

图 1 板栗和杉木种群的28S rDNA序列比对 Fig. 1 Alignment of 28S rDNA sequences of the chestnut population and the Chinese fir population

表 1 种间或种群间28S rDNA序列一致性(下三角)及遗传距离(上三角)^① Tab.1 Interspecific or interpopulation identity (lower triangle) and genetic distance (upper triangle) of 28S rDNA sequences

表 1 种间或种群间28S rDNA序列一致性(下三角)及遗传距离(上三角)① Tab.1 Interspecific or interpopulation identity (lower triangle) and genetic distance (upper triangle) of 28S rDNA sequences 1 2 3 4 5 1 0.022 0.027 0.013 0.017 2 0.978 0.029 0.025 0.015 3 0.970 0.968 0.024 0.020 4 0.986 0.975 0.973 0.017 5 0.983 0.985 0.976 0.983 ① 1.栗小爪螨(AB683730)O. castaneae (AB683730)；2.本岛小爪螨(AB683721)O. hondoensis (AB683721)；3.采自日本的日本柳杉上的针叶小爪螨(AB683728)O. ununguis on C. japonica from Japan (AB683728)；4.采自山东板栗上的针叶小爪螨(KU886557)O. ununguis on C. mollissima from Shandong Province, China (KU886557)；5.采自浙江杉木上的针叶小爪螨(KU886556)O. ununguis on C. lanceolata from Zhejiang Province, China (KU886556).

从NCBI网站上下载小爪螨属其他种(表 2)及外群微小牛蜱(Rhipicephalus microplus)的28S rDNA序列(KC769636)，运用MEGA5.2软件，基于Tamura-Nei模型，构建了NJ树、ML树和UPGMA树，3种系统树的拓扑结构相似，NJ树和ML树几乎完全一致，在此只展示NJ树(图 2)。NJ树显示，杉木种群(KU886556)与采自日本的日本柳杉(Cryptomeria japonica)上的本岛小爪螨(O. hondoensis)(AB683722)亲缘关系最近，板栗种群(KU886557)与采自日本的日本栗(Castanea crenata)上的栗小爪螨(O. castaneae)(AB683731)的亲缘关系最近。杉木种群(KU886556)首先与本岛小爪螨(AB683722)聚在一起，再与采自日本的日本柳杉上的针叶小爪螨(AB683728)相聚，然后与板栗种群(KU886557)和栗小爪螨(AB683731)聚在一起。

表 2 构建系统发育树时所引用的GenBank中小爪螨属物种的28S rDNA序列 Tab.2 28 S rDNA sequences of Oligonychus in GenBank quoted for constructing phylogenetic tree

表 2 构建系统发育树时所引用的GenBank中小爪螨属物种的28S rDNA序列 Tab.2 28 S rDNA sequences of Oligonychus in GenBank quoted for constructing phylogenetic tree 物种 Species Genbank登录号 Genbank accession number 寄主植物 Host plant 地理分布 Geographical location 阿见小爪螨O. amiensis AB683737 日本石栎Lithocarpus edulis 日本广岛Hiroshima, Japan 比哈小爪螨O. biharensis AB683743 龙眼Dimocarpus longan 中国台北Taibei, China 山茶小爪螨O. camelliae AB683727 山茶Camellia japonica 日本东京Tokyo, Japan 栗小爪螨O. castaneae AB683731 日本栗Castanea crenata 日本茨城Ibaraki, Japan 棒毛小爪螨O. clavatus AB683718 黑松Pinus thunbergii 日本神奈川Kanagawa, Japan 咖啡小爪螨O. coffeae AB683735 荔枝Litchi chinensis 日本冲绳Okinawa, Japan 后藤小爪螨O. gotohi AB683733 日本石栎Lithocarpus edulis 日本冲绳Okinawa, Japan 本岛小爪螨O. hondoensis AB683722 日本柳杉Cryptomeria japonica 日本青森Aomori, Japan 冬青小爪螨O. ilicis AB683725 杜鹃Rhododendron sp. 日本茨城Ibaraki, Japan 落叶松小爪螨O. karamatus AB683720 日本落叶松Larix kaempferi 日本北海道Hokkaido, Japan 静小爪螨O. modestus AB683741 升马唐Digitaria ciliaris 日本冲绳Okinawa, Japan 直小爪螨O. orthius AB683739 甘蔗Saccharum officinarum 日本冲绳Okinawa, Japan 柏小爪螨O. perditus AB683729 刺柏Juniperus sp. 日本神奈川Kanagawa, Japan 瘤小爪螨O. pustulosus AB683719 日本柳杉Cryptomeria japonica 日本青森Aomori, Japan 胭红小爪螨O. rubicundus AB683745 细叶芒Miscanthus sinensis 日本高知Kochi, Japan 津留小爪螨O. tsudomei AB683723 松Pinus sp. 日本冲绳Okinawa, Japan 针叶小爪螨O. ununguis AB683728 日本柳杉Cryptomeria japonica 日本北海道Hokkaido, Japan

图 2 基于28S rDNA序列构建的小爪螨属NJ树 Fig. 2 NJ tree of the genus Oligonychus based on 28S rDNA sequences

已有研究表明，针叶小爪螨的山东板栗种群与浙江杉木种群很可能由于长期适应不同寄主植物分化成了2个种，但也不能排除误定，将原本就是不同的2个种误认为是同一个种。由于大多数螨类体型微小，可用于鉴定的特征有限，因此，容易出现误定，如世界范围分布的二斑叶螨就有40多个异名。为了明确板栗和杉木上叶螨出现分化的原因，笔者测定比较了这2种寄主上叶螨的28S rDNA，并基于28S rDNA构建了小爪螨属的系统发育树。如果板栗和杉木上的叶螨是由同一种叶螨因长期适应不同寄主植物分化而成，那么二者间的亲缘关系应该较与其他物种间的亲缘关系近。但由系统发育树的拓扑结构看，我国板栗上的叶螨与日本的栗小爪螨亲缘关系最近，而杉木上的叶螨与日本的本岛小爪螨亲缘关系最近，虽然Bootstrap值较低，但在所构建的NJ树和ML树中，这几个物种的关系完全一致，这一结果应该是可靠的。鉴于板栗和杉木上的小爪螨两者亲缘关系并非最近，笔者认为我国板栗和杉木上的叶螨并非由同一种叶螨分化而成，很可能是错误鉴定造成。

Matsuda等(2012)基于COⅠ、ITS和28S rDNA对日本17种小爪螨属叶螨的研究表明，这些基因序列的种内差异与种间差异不重叠，可有效鉴别小爪螨属叶螨，其中，28S rDNA的种内遗传距离是0~0.1%，种间遗传距离是0.4%~10.7%。从系统发育树来看，虽然我国板栗上的叶螨与日本的栗小爪螨亲缘关系最近，杉木上的叶螨与日本的本岛小爪螨亲缘关系最近，但基于28S rDNA序列计算的我国板栗上小爪螨与日本栗小爪螨的遗传距离为1.3%，杉木上叶螨与日本本岛小爪螨的遗传距离为1.5%，板栗和杉木上的叶螨与采自日本的日本柳杉上的针叶小爪螨的遗传距离分别是2.4%和2.0%(表 1)，远超过Matsuda等(2012)测定的种内遗传距离(0~0.1%)，由此推断，我国板栗和杉木上的叶螨不同于日本的栗小爪螨、本岛小爪螨和针叶小爪螨，其分类地位还需进一步确定。

Ehara(2011)指出，针叶小爪螨不同种群和同一种群的不同个体之间在足的毛序上存在变异，Pritchard和Baker也指出，针叶小爪螨可能是一个复合种，但在形态上还不能清楚地区分开(王慧芙，1981)。基于COⅠ基因序列计算的采自我国板栗和杉木上的针叶小爪螨与采自法国意大利柏(Cupressus sempervirens)上的针叶小爪螨的遗传距离分别是11.6%和9.8%，采自法国意大利柏上的针叶小爪螨与采自日本的日本柳杉上的针叶小爪螨的遗传距离为7.9%(表 3)，都远超过Matsuda等(2012)测定的小爪螨属COⅠ基因序列的种内遗传距离(0~2.9%)。目前有关针叶小爪螨的分子数据只有中国、法国和日本的，从有限的分子数据比较来看，这3个国家的针叶小爪螨差异较大，很可能分属于不同的种。因此，世界范围的针叶小爪螨的分类鉴定尚需进一步研究。

表 3 基于COⅠ基因序列的针叶小爪螨种群间遗传距离^① Tab.3 Interpopulation genetic distance of O. ununguis based COⅠ gene sequences

表 3 基于COⅠ基因序列的针叶小爪螨种群间遗传距离① Tab.3 Interpopulation genetic distance of O. ununguis based COⅠ gene sequences 1 2 3 1 2 0.129 3 0.149 0.116 4 0.116 0.098 0.079 1.采自山东板栗上的针叶小爪螨(GU166395)O. ununguis on C. mollissima from Shandong Province, China；2.采自浙江杉木上的针叶小爪螨(GU166399)O. ununguis on Cunninghamia lanceolata from Zhejiang Province, China；3.采自日本的日本柳杉上的针叶小爪螨(AB683664)O. ununguis on Cryptomeria japonica from Japan；4.采自法国意大利柏上的针叶小爪螨(X80865) O. ununguis on Cupressus sempervirens from France.

传统上螨类分类应用的是形态特征，但大多数螨类体型微小，可用于鉴定的特征有限，相对于其他体型较大的动物，螨类的形态鉴定比较难。分子方法能够解决一些传统分类学难于解决的问题，可以验证物种鉴定的准确性，应用序列差异阈值能够提高发现新种的机会(Hebert et al., 2003; Moritz et al., 2004)，同时，普遍认为分子分类代替不了传统的形态分类。DNA barcoding必须依赖传统的形态分类学，在条形码数据库建立之前，取样必须建立在形态分类学研究的基础上；建库后验证要以形态分类学结果作为参照标准。DNA条形码鉴定只有在形态学分类研究的基础上，在取样准确、涵盖分布区包括所有变异的情况下才能保证结果的可靠性。因此DNA条形码鉴定和传统的形态分类学研究是相辅相成的，需要将两者紧密地结合在一起(任保青等，2010)。目前，只有为数不多的分类学家专门从事螨类的形态鉴定，而且人员的数量正在减少，这给叶螨的准确鉴定增加了困难(Ros et al., 2007)。另外，螨类中，DNA条形码的选择及其评价还没有统一标准。存放DNA序列的数据库中，可用于螨类鉴定的物种、序列不多，且序列位置不同或只有部分重叠。因此，螨类鉴定中，目前急需形态分类专家与分子生物学技术人员合作，将螨类种名与标准的一个或多个基因序列准确对应起来，这样，非分类专业的螨类研究者通过形态无法识别某一种螨类时，可以通过基因序列比对来确认其身份。

基于28S rDNA分析表明，我国板栗和杉木上的叶螨并非由同一种叶螨因长期适应不同寄主植物分化而成，很可能是2个独立的物种，这还需进一步研究其形态特征上的差异，以明确其分类地位。