白蚁在加速地表有机物质分解、促进物质循环等过程中起着重要的作用，但也有6.1%的白蚁物种对人类构成危害，全球每年因白蚁造成的经济损失估计约达220亿美元，并有进一步增大的趋势(Rust et al., 2012)。台湾乳白蚁(Coptotermes formosanus)在我国南方广泛分布，是典型的土木两栖性白蚁，对木质建筑构件、仓储物资、农林树木、通讯设备等造成了严重危害，其成功入侵美国后已经成为当地重要的有害生物之一(黄复生等，2000；Evans et al., 2013)。台湾乳白蚁营隐蔽性生活且有主巢、副巢之分，防治难度较大，利用饵剂诱杀技术是目前白蚁防治的主要方法(Evans et al., 2015)。

信息素对于白蚁维持正常的社会性群体稳定至关重要。尽管目前对于白蚁信息素的认识仍非常有限，但是白蚁踪迹信息素(trail pheromones)和诱食信息素(phagostimulant)的研究已取得了一定的进展(Bordereau et al., 2011)，其中诱食信息素由白蚁下唇腺产生，能够刺激白蚁聚集并且取食食物。研究发现来自6科14种白蚁的诱食信息素的化学组分极为相似，经鉴定为对苯二酚(hydroquinone)及其近似物(Reinhard et al., 2002a)。该诱食信息化合物溶于水，耐高温，持续时间长，待处理变干后失去作用，但加水后又能恢复作用(Reinhard et al., 2002b)。

台湾乳白蚁取食选择行为具有一定的偏好性(Su et al., 1984；Kubota et al., 2011；Wang et al., 2012)，利用植物材料(梁小松等，2007；Wang et al., 2012)、真菌侵染物(Cornelius et al.，2003)和其他具有诱食作用的添加物(Kubota et al., 2011；张世军等，2017)等，可增强白蚁对饵剂的选择性和喜食性。诱食信息素用于白蚁饵剂研发更具应用价值(Bordereau et al., 2011)。台湾乳白蚁下唇腺中的对苯二酚，在特定浓度下是诱食信息化合物之一，但是对苯二酚很容易发生氧化反应而失去诱食作用(Huang et al., 2007)，而且单一的对苯二酚并不能起到诱食作用，需要多组分共同发挥诱食作用(Reinhard et al., 2002a; 2002b；Raina et al., 2005；Sillam-Dusses et al., 2012)。

研究表明，抗氧化剂2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene，BHT)能够显著提高对苯二酚对达尔文澳白蚁(Mastotermes darwiniensis)的诱食活性(Reinhard et al., 2002a)。因此，笔者假设抗氧化剂能够对对苯二酚起到增效作用，从而促进台湾乳白蚁的诱食效果及代谢产物表达差异。为此，本研究利用2种抗氧化剂BHT和茶多酚(tea polyphenols)与对苯二酚混配，对台湾乳白蚁趋性反应和取食的影响效应，并分析混合物在白蚁体内的代谢特性，以期为开发台湾乳白蚁毒饵诱杀技术提供基础资料。

1 材料与方法 1.1 供试白蚁及材料

台湾乳白蚁采自广东省广州市国际生物岛，在实验室内以松木板饲养[(27±1) ℃，RH80%±5%，L:D=0 h:24 h)。试验时挑取个体大小一致、活跃的台湾乳白蚁在饥饿24 h后进行试验。蛭石、棉花经高压蒸汽灭菌。

对苯二酚、BHT、茶多酚和微晶纤维素购于广州市齐云生物技术有限公司。L-2-氯苯丙氨酸(≥98%)，购自上海恒柏生物科技有限公司，BSTFA (含1% TMCS, V/V)，购自REGIS Technologies. Inc. USA。参考Raina等(2005)的研究结果，选择对苯二酚10、2、1 ng·cm^-2 3种浓度供试，分别按照对苯二酚与每种抗氧化剂(BHT、茶多酚)5:1、1:1、1:5的浓度比配置，共9个处理。

1.2 行为选择测定

在玻璃培养皿中倒入200 mL浓度为2%的琼脂液，待琼脂冷却后，选择培养皿内2个对角，放置2个倒扣过来的烧杯(50 mL)，烧杯口相对；以超纯水处理的滤纸片(2 cm×2 cm)置于烧杯内作为空白对照，另一个烧杯内分别放置其他不同处理的滤纸片，在2个烧杯口相对的中间位置释放50头台湾乳白蚁工蚁，将所有培养皿全部放入恒温培养箱内[(27±1) ℃，RH80%±5%，L:D=0:24 h](RXZ-280 A-LED人工气候箱，新江南仪器有限公司)，30 min后观察记录每个烧杯内白蚁数量，每处理4个重复。根据已有研究报道(Raina et al., 2005)，使用唯一具有一定作用的浓度2 ng·cm^-2对苯二酚作为阳性对照。

1.3 取食量测定

在培养皿内均匀的平铺一层薄蛭石，均匀滴加400 μL超纯水；将处理好的滤纸片(2 cm×2 cm)放在培养皿内，每个培养皿内放入45头工蚁和5头兵蚁，将培养皿加盖全部放入恒温恒湿培养箱内[(27±1) ℃，RH80%±5%，L:D=0:24 h)，每天检查并在每块滤纸上加100 μL超纯水，观察5天后取出滤纸片，仔细清洗移入60 ℃烘箱[DHG-9240(A)电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司]，12 h后取出，在干燥器中隔夜后称质量，记录滤纸片的消耗量。茶多酚与BHT各设9个处理，以超纯水和2 ng·cm^-2对苯二酚分别为空白和阳性对照，每组试验4个重复。

1.4 代谢产物检测分析 1.4.1 试验处理

参考Rajarapu等(2015)的方法将微晶纤维素做成饼干状饲料，添加超纯水为对照组(CK组)，基于上述试验结果选择诱食效果较好的配比作为处理组(Treatment组)。

将做好的饵片放置在不同的烧杯(50 mL)中，每个重复的烧杯中放入经饥饿处理过的一个台湾乳白蚁群体工蚁150头，兵蚁15头，加盖转移到恒温恒湿培养箱内[(27±1) ℃，RH 80% ± 5%，L:D=0:24 h)，每天向烧杯内添加200 μL超纯水，喂食时间为10天后，将白蚁样本迅速放入液氮中淬灭，终止其代谢变化，转入超低温冰箱(-80 ℃)保存待测。每个处理6个重复。

1.4.2 检测与分析

样品的分离提纯和衍生化。各处理称量白蚁样本质量30 mg于EP管中，加入0.4 mL提取液(甲醇氯仿体积比3:1)，再加入20 μL L-2-氯苯丙氨酸，涡旋10 s，加入瓷珠，45 Hz研磨仪处理4 min，超声5 min(冰水浴)，4 ℃条件下，13 000 r·min^-1离心15 min，取0.36 mL上层透明滤液于2 mL进样瓶中，从每个进样瓶中移取30 μL上清液，涡旋10 s，在真空浓缩器中干燥提取物，加入30 μL甲氧胺盐试剂，混匀，于80 ℃烘箱中孵30 min，每个样品中迅速加入40 μL BSTFA，70 ℃条件下孵育1.5 h。

采用气相色谱GC-TOF-MS(gas chromatography time-of-flight mass spectrometry)(GC色谱仪Agilent 7890B, Agilent, USA，质谱仪LECO Chroma TOF PEGASUS HT, LECO, USA)检测，配有Agilent DB-5MS毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm, J&W Scientific, Folsom, CA, USA)，进行全组分非靶标代谢组学方法技术分析。上机检测分析条件，进样量：1 μL，不分流模式；载气：氦气；前进样口吹扫流速：3 mL·min^-1；柱流速：1 mL·min^-1；柱温：50 ℃保持1 min，以10 ℃·min^-1的速率上升至310 ℃，保持8 min；前进样口温度：280 ℃；传输线温度：270 ℃；离子源温度：220 ℃；电离电压：-70 eV；扫描方式：50～500 m·z^-1；扫描速率：20 spectra·s^-1；溶剂延迟：455 s。

1.5 数据分析

数据结果用Microsoft Excel 2013进行统计和计算，再采用SPSS 19.0单因素方差分析，LSD法进行多重比较。为了比较分析不同处理白蚁代谢产物的差异代谢，检测数据结果运用Chroma TOF4.3X软件和LECO Fiehn Rtx5数据库进行峰提取，基线矫正，峰对齐及定性定量。峰对齐时运用保留时间指数法，参数设置为5 000，过滤在质控中出峰量少于50%的峰。单变量统计分析使用t检验(Student’s t-test)，多元变量统计分析使用主成分分析(principal component analysis, PCA)、正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis, OPLS-DA)分析，经200次建立对应的OPLS-DA模型并获取随机模型的R²和Q²值，进行OPLS-DA置换检验。将筛选差异代谢物的结果以火山图(Volcano plot)的形式进行可视化处理。显著差异代谢产物筛选条件为与数据库比对Similarity分值大于300，检验P值小于0.01，同时OPLS-DA模型第1主成分的变量投影重要度(variable importance in the projection, VIP)大于1。

2 结果与分析 2.1 行为选择

与对照组对苯二酚相比，对苯二酚与BHT不同比例混配处理对台湾乳白蚁趋性并无显著的影响(F=0.987；df=1, 10；P=0.471)(表 1)，BHT对对苯二酚未表现出明显的增效作用。

与对照组相比，10 ng·cm^-2条件下，对苯二酚与茶多酚以质量比1:5混配物对台湾乳白蚁具有显著的吸引作用(P=0.034)(表 1)，茶多酚对苯二酚具有一定的增效作用。

2.2 诱食量比较

与对照组对苯二酚相比，对苯二酚与BHT不同比例混配处理对台湾乳白蚁取食率均无显著的影响(F=0.565；df=1, 10；P=0.830)(表 2)，BHT对对苯二酚为表现出明显的无增效作用。

与对照组相比，10 ng·cm^-2条件下，对苯二酚与茶多酚的质量比为1：1(P=0.013)和1:5(P=0.002)的混配处理对台湾乳白蚁具有显著的诱食作用(表 2)，茶多酚对对苯二酚具有取食增效作用，而且对苯二酚浓度及混配比例对于诱食效果影响明显。

2.3 代谢特性分析

基于GC-TOF-MS的代谢组学PCA分析(图 1)和OPLS-DA分析(图 2)表明，含有对苯二酚诱食剂处理与对照组纯水处理样本区分显著，组内也比较聚集，含有对苯二酚诱食剂处理对白蚁的代谢产物产生了显著的影响。OPLS-DA模型的置换检验结果(图 3)显示，Q²回归线与Y轴的截距为-0.47 < 0.05，反映出2组之间的OPLS-DA模型稳健良好。

火山图(图 4)散点颜色代表最终的筛选结果，表明含有对苯二酚的诱食物引起台湾乳白蚁一些代谢产物的显著上调、下调变化。根据多元变量统计分析结果的P值小于0.01、VIP大于1、Similarity分值大于300的原则，含有对苯二酚的混合诱食剂处理可导致白蚁代谢物中5种化合物的含量明显增大，16种化合物的含量显著降低(表 3)。

3 讨论

白蚁是社会性昆虫，踪迹信息素和诱食信息素等与白蚁觅食行为密切相关(Costa-Leonardo et al., 2009；文平等，2011)。诱食信息素是白蚁取食时分泌并引起白蚁聚集取食的信息化学物质，因此发展基于诱食信息化合物的白蚁诱食剂具有巨大的应用前景。研究表明，台湾乳白蚁下唇腺分泌物中含有诱食信息素对苯二酚(Reinhard et al., 2001a；2001b；2002a；2002b)，也许正是台湾乳白蚁更偏爱于被取食过的木材的原因(Delaplane et al., 1989)，但是单独使用对苯二酚对台湾乳白蚁的诱食作用有限(Raina et al., 2005)。本研究发现，抗氧化剂茶多酚对对苯二酚具有明显的增效作用，与对苯二酚混配能显著提高诱食作用；但另外一种抗氧化剂BHT的添加对于引诱台湾乳白蚁并没有明显的增效作用。有研究报道BHT与对苯二酚混配可以显著提高对达尔文澳白蚁的引诱效果(Reinhard et al., 2002a)，可见白蚁诱食信息素的作用具有明显的种间特异性。

通过昆虫代谢产物全局分析，可以获取昆虫适应外界环境变化生理过程中的大量信息。目前，已有将代谢组学应用于昆虫代谢生理研究的报道，如廖蓝齿胫叶甲(Gastrophysa atrocyanea)幼虫取食钝叶酸模(Rumex obtusifolius)后乳酸含量会上调(Miyagi et al., 2013)，甚至仅仅限制取食量也会引起豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)的代谢产物大量改变(Wang et al., 2010)。本研究关于台湾乳白蚁代谢轮廓分析的结果表明，取食对苯二酚与茶多酚混配处理的纤维素与对照组相比，台湾乳白蚁的代谢产物发生了显著的改变，其中包括环亮氨酸和谷氨酸等氨基酸、葡糖内酯和赤酮酸内酯等酯类以及麦角固醇等代谢物含量明显下调，而糖类、硬脂酸以及包括磷酸甲酯等4种酯类和一些氨基酸衍生物等代谢物的水平出现上调，关系到不饱和脂肪酸合成通路(biosynthesis of unsaturated fatty acids)、ABC转运体(ABC transporters)、戊糖磷酸通路(pentose phosphate)、嘧啶代谢通路(pyrimidine metabolism)、甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢通路(glycine, serine and threonine metabolism)、色氨酸代谢通路(tryptophan metabolism)、氨基酸生物合成通路(biosynthesis of amino acids)等。这些代谢物变化的机制还需要进一步研究。

4 结论

对苯二酚是一种重要的白蚁诱食信息素，抗氧化剂茶多酚的添加能明显提高其对台湾乳白蚁的诱食效果，而BHT的添加则未表现出明显的增效作用；台湾乳白蚁取食对苯二酚与茶多酚后，代谢产物发生显著改变，诱食剂能引起白蚁明显的代谢生理变化。