滇山茶(Camellia reticulata)分布于云南、四川西南部和贵州西部，生长在海拔1 000~3 200 m之间。滇山茶是中国特有种、国家二级重点保护植物、云南省八大名花之首，昆明市的市花。至今，滇山茶已有1 500多年的栽培历史，先后被引种到世界各国，以树体高大(最高18 m)、花大繁茂(花径最大22 cm，单株花量最多2万朵)、寿命长而驰名中外(昆明市科协, 2010)，素有“云南山茶甲天下”的美誉。

近年来，滇山茶的六倍体(Kondo et al., 1986)、二倍体(夏丽芳等, 1994)和四倍体(顾志建, 1997)被相继报道。荧光原位杂交研究表明，二倍体滇山茶首先与二倍体西南红山茶(C. pitardii)杂交形成异源四倍体，然后四倍体再与二倍体怒江红山茶(C. saluenensis)杂交和多倍化形成异源六倍体(Liu et al., 2011)。由此可以推测，滇山茶栽培品种可能会涉及多种细胞倍性。经2010年统计，滇山茶的栽培品种已经达到123个(昆明市科协, 2010)，而且近年来还在不断增加。但在这些品种中，目前只有‘玛瑙’(8x)、‘红花油茶’(8x) (Huang et al., 2013)的细胞倍性有过报道，而大部分品种的细胞倍性尚不明确。

研究滇山茶栽培品种的细胞倍性十分重要。首先，阐明滇山茶栽培品种的细胞倍性有利于滇山茶种内杂交乃至山茶属种间远缘杂交亲本的选配，因为杂交育种一直是山茶属育种的主要途径(昆明市科协, 2010)。滇山茶在-5 ℃以下和32 ℃以上均不能正常生长(昆明市科协, 2010)，因此如果要扩大其栽培范围进而拓展市场，最有效的途径将是通过杂交育种对其适应性进行改良。此外，我国近年来发现的山茶属特异资源，例如黄花的金花茶组(Sect. Archecamellia) (Ming et al., 2007)、夏季开花的杜鹃红山茶(C. azalea) (Xu et al., 2017)等，它们都是单瓣花或者花较小，观赏价值亟待提高。通过这些特异资源与滇山茶的种间杂交，可能将会获得大花、重瓣、黄花、夏季开花等优异性状的杂交品种。由于滇山茶品种的倍性多样，因此在杂交亲本选配的时候，除了需要考虑性状互补、亲和性和可育性之外，选择合适的倍性对于杂交育种也至关重要。

其次，弄清滇山茶栽培品种的细胞倍性，有利于开展多倍体植物的形成机制和遗传变异研究。杂交和多倍化被认为是植物进化的主要渠道(Triplett et al., 2014)。虽然多倍体现象在木本植物中并不少见，例如月季(Rosa)(黄平等, 2013)、广东桑(Morus atropurpurea)(王振江等, 2015)等，但多次杂交且同时多倍化的现象在木本植物中还不多见。因此，滇山茶将是研究木本植物杂交-多倍化的理想材料。那么，滇山茶栽培品种的细胞倍性则是开展多倍体遗传变异研究的前提。

实践表明，滇山茶栽培品种长期以来依靠嫁接繁殖，扦插繁殖极难生根(昆明市科协, 2010)，很难利用根尖制作压片进行染色体计数。因此，本研究将采用流式细胞术结合茎尖和花药压片的染色体计数对滇山茶主要栽培品种的细胞倍性展开研究，以期为滇山茶的杂交亲本选配、遗传变异和进化机制等研究奠定基础。

本试验所采用的植物材料为鲜嫩叶片，均来自于中国科学院昆明植物园的茶花园，共涉及63个常见的滇山茶栽培品种，以及怒江红山茶，采后即用，详见表 1。

表 1 滇山茶栽培品种的DNA含量及倍性估计 Tab.1 The DNA content and ploidy estimation of Camellia reticulata cultivars

表 1 滇山茶栽培品种的DNA含量及倍性估计 Tab.1 The DNA content and ploidy estimation of Camellia reticulata cultivars 样本Sample 峰值 Peak 2C/pg 倍性估计 Ploidy estimation 怒江红山茶C. saluenensis (CK) 107.11 6.45 2x ‘睡美人’ ‘Shuimeiren’ 192.85 11.61 6x ‘佛座莲’ ‘Fozuolian’ 217.72 13.10 6x ‘彩玉’ ‘Caiyu’ 214.27 12.90 6x ‘鹤顶红’ ‘Hedinghong’ 226.22 13.62 6x ‘早桃红’ ‘Zaotaohong’ 231.68 13.95 6x ‘梅红桂叶’ ‘Meihong Guiye’ 222.27 13.38 6x ‘粉红莲’ ‘Fenhonglian’ 196.99 11.86 6x ‘大玉兰’ ‘Dayulan’ 203.88 12.27 6x ‘红霞迎春’ ‘Hongxia Yingchun’ 175.03 10.53 6x ‘桂叶洋红’ ‘Guiye Yanghong’ 183.14 11.02 6x ‘鹿城春’ ‘Luchengchun’ 225.32 13.56 6x ‘大桂叶’ ‘Daguiye’ 215.78 12.99 6x ‘小桂叶’ ‘Xiaoguiye’ 217.73 13.10 6x ‘锦袍红’ ‘Jinpaohong’ 218.14 13.13 6x ‘楚蝶’ ‘Chudie’ 204.68 12.32 6x ‘二乔’ ‘Erqiao’ 214.58 12.92 6x ‘松子壳’ ‘Songzike’ 221.16 13.31 6x ‘国楣’ ‘Guomei’ 223.38 13.45 6x ‘玛瑙’ ‘Manao’ 209.67 12.62 6x ‘桃红袍’ ‘Taohongpao’ 178.96 10.77 6x ‘小叶牡丹’ ‘Xiaoye Mudan’ 234.07 14.09 6x ‘蒲门茶’ ‘Pumencha’ 238.53 14.36 6x ‘粉通草’ ‘Fentongcao’ 243.43 14.65 6x ‘团叶蝶翅’ ‘Tuanye Diechi’ 226.80 13.65 6x ‘节节高’ ‘Jiejiegao’ 238.85 14.38 6x ‘张家茶’ ‘Zhangjiacha’ 235.91 14.20 6x ‘泽河’ ‘Zehe’ 240.58 14.48 6x ‘宝珠茶’ ‘Baozhucha’ 236.92 14.26 6x ‘五角锈球’ ‘Wujiao Xiuqiu’ 239.40 14.41 6x ‘紫袍’ ‘Zipao’ 257.91 15.52 8x ‘朱砂紫袍’ ‘Zhusha Zipao’ 258.24 15.54 8x ‘满邑’ ‘Manyi’ 258.63 15.57 8x ‘雪娇’ ‘Xuejiao’ 260.45 15.68 8x ‘丹顶鹤’ ‘Dandinghe’ 260.96 15.63 8x ‘如意’ ‘Ruyi’ 275.09 16.56 8x ‘咪依噜’ ‘Miyilu’ 282.32 16.99 8x ‘丹晶’ ‘Danjing’ 294.55 17.73 8x ‘白邑早桃红’ ‘Baiyi Zaotaohong’ 298.08 17.94 8x ‘云峰’ ‘Yunfeng’ 288.38 17.36 8x ‘麻叶桃红’ ‘Maye Taohong’ 282.96 17.03 8x ‘狮子头’ ‘Shizitou’ 263.29 16.33 8x ‘紫宝’ ‘Zibao’ 262.62 15.81 8x ‘菊瓣’ ‘Juban’ 268.39 16.15 8x ‘松子鳞’ ‘Songzilin’ 258.18 15.54 8x ‘大银红’ ‘Dayinhong’ 259.27 15.61 8x ‘牡丹茶’ ‘Mudancha’ 258.52 15.56 8x ‘小银红’ ‘Xiaoyinhong’ 283.89 17.09 8x ‘滇池明珠’ ‘Dianchi Mingzhu’ 261.39 15.73 8x ‘赛桃红’ ‘Saitaohong’ 261.66 15.75 8x ‘早牡丹’ ‘Zaomudan’ 260.56 15.68 8x ‘平瓣大理茶’ ‘Pingban Dalicha’ 269.23 16.20 8x ‘红花油茶’ ‘Honghua Youcha’ 288.11 17.34 8x ‘晚春红’ ‘Wanchunhong’ 276.87 16.66 8x ‘荷花仙子’ ‘Hehua Xianzi’ 268.38 16.15 8x ‘靖安茶’ ‘Jin’ancha’ 268.38 16.15 8x ‘银粉牡丹’ ‘Yinfen Mudan’ 263.87 15.88 8x ‘云溪’ ‘Yunxi’ 281.36 16.93 8x ‘童子面’ ‘Tongzimian’ 270.57 16.29 8x ‘百泽’ ‘Baize’ 265.78 16.00 8x ‘花叶宝珠’ ‘Huaye Baozhu’ 270.73 16.30 8x ‘楚雄大理茶’ ‘Chuxiong Dalicha’ 303.38 18.26 10x ‘东林’ ‘Donglin’ 301.39 18.14 10x ‘恨天高’ ‘Hentiangao’ 304.43 18.32 10x

将每个品种40~50 mg的叶片用于样品制备。依据Galbraith等(1983)的方法制备核悬浮液。WPB分离缓冲液为: 0.2 mmol·L^-1 Tris-HCl, 4 mmol·L^-1 MgCl₂·6H₂O, 2 mmol·L^-1 EDTA-Na₂·2H₂O, 86 mmol·L^-1 NaCl, 2.0 mmol·L^-1二硫苏糖醇(Sigma-Aldrich CHIEMIE Gmbh, Steinheim, Germany), 1%(W/V) PVP-10, 1%(V/V) Triton X-100, pH7.5。用锋利的刀片切碎样品，将1 mL冰冷的核悬浮液加入到含有植物组织的培养皿中。然后将得到的匀浆通过50 μm尼龙过滤器过滤以除去细胞碎片。之后用50 μg·mL^-1的RNase (Fluka, Buchs, Switzerland)以及50 μg·mL^-1的碘化丙啶(PI) (Sigma, St. Louis, MO, USA)对细胞核做染色处理，处理后的样品置于冰上待用。试验以玉米(Zea may)作为内参(1C=2.35 pg)，并以怒江红山茶作为二倍体对照物种(2n=30)。使用BD FACSCalibur (USA)的流式细胞仪(15 mW, 488 nm)分析核样品。参照Huang等(2013)的方法计算样本核DNA的含量，即2C值。

采集通过流式细胞术估计的每个倍性3个代表品种的茎尖或花药，每个品种采集3个不同发育阶段的样品，利用常规技术制作压片，利用Nikon 80i正置显微镜进行观察拍照。每个品种拍摄50个视野，对染色体进行计数，以验证流式细胞术倍性估计的准确性。

滇山茶DNA含量的峰值以及2C值如表 1所示。其中，对照物种怒江红山茶(2n=30)的DNA峰值为107.11 (图 1, CK)。在63个滇山茶品种中，峰值范围175.03~304.43，2C值范围10.53~18.32 pg。DNA含量最高的是‘恨天高’，最低的是‘红霞迎春’。

图 1 滇山茶代表品种的DNA峰值(CK, A, B, C)及染色体计数(花药: A′, B′; 茎尖: C′) Figure 1 The DNA content (CK, A, B, C) and chromosomes (pollen: A′, B′; stem tip: C′) of representative cultivars of Camellia reticulata

峰值范围小于250、2C值低于15.00 pg的品种倍性被估计为六倍体，涉及的品种共29个，占被检品种总数的46.03%。代表品种‘玛瑙’、‘粉通草’和‘五角绣球’的染色体计数试验中，‘五角绣球’获得较好的结果，其花药染色体计数为n=45 (图 1A′), 2n=90，六倍体，与流式细胞术(图 1A)的倍性估计结果一致。

峰值范围在250~300、2C值为15.00~18.00 pg的品种倍性被估计为八倍体，涉及的品种共31个，占被检品种总数的49.21%。代表品种‘狮子头’、‘菊瓣’和‘花叶宝珠’的染色体计数试验中，‘菊瓣’获得了较好的结果，其花药染色体计数为n=60 (图 1B′), 2n=120，八倍体，与流式细胞术(图 1 B)的倍性估计结果一致。

峰值范围大于300、2C值高于18.00 pg的品种倍性被估计为十倍体，涉及的品种共3个，分别是‘楚雄大理茶’、‘东林’和‘恨天高’，占被检品种总数的4.76%。3个品种中，仅有‘恨天高’的茎尖染色体计数获得了相对较好的结果，为2n=150 (图 1C′), 十倍体，与流式细胞术(图 1C)的倍性估计结果一致。

在茎尖或花药染色体的计数试验中，滇山茶代表品种‘五角绣球’、‘菊瓣’和‘恨天高’的染色体倍性结果与流式细胞术检测的结果一致，较好地验证了流式细胞术的倍性估计结果。

滇山茶栽培品种1 500多年一直依靠嫁接繁殖，扦插繁殖极难生根(昆明市科协, 2010)，基本无法利用根尖细胞的染色体计数进行验证。而对于茎尖和花药，可能因为抽芽期、花药发育程度难以把握，这可能是本次试验中多次压片而成功率不高的原因。由于滇山茶高倍性品种的染色体较多，因此与茎尖相比，花药的染色体数目减半，更容易观测清楚，这可能是目前滇山茶染色体计数的最佳方法。但是，滇山茶的一些品种高度重瓣，没有雄蕊发育，无法利用花药开展染色体计数工作。

此外，本研究中基于流式细胞术的DNA含量从最低值到最高值呈现连续性的变化，并没有分出特别明显的倍性界限，这可能暗示滇山茶栽培品种存在五倍体、七倍体等，而这种现象在茶梅(Camellia sasanqua)中已有过报道，如五倍体(Ackerman et al., 1980)、七倍体(Ito et al., 1957)。可见，滇山茶栽培品种的染色体倍性检测，不论是流式细胞术，还是压片计数，都有待进一步探索。

滇山茶的品种因为在-5 ℃以下和32 ℃以上不能正常生长(昆明市科协, 2010)，因而滇山茶的栽培范围较为狭窄，至今仍主要集中在滇中及其周边地区。因此，如果要扩大其栽培范围，拓展滇山茶产业的海内外市场，必须对其温度适应性进行改良。由于山茶属种间的杂交比较容易，因此耐寒抗热的山茶(Camellia japonica)和茶梅均可能是其良好的杂交亲本。但是，山茶的细胞倍性涉及2x、4x (Gu et al., 1990)，茶梅的细胞倍性涉及3x、4x、5x、7x和8x (Ito et al., 1957; Ackerman et al., 1980)，只有选择合适倍性的亲本品种，杂交才容易获得成功。

近年来，我国还发现了一些特异的山茶属种质资源，例如黄花的金花茶组(Ming et al., 2007)，但是它们的花径均只有5 cm左右。而滇山茶的花径可高达22 cm，如果选择滇山茶六倍体品种与这些二倍体金花茶杂交，有可能获得观赏价值显著提高的大花、黄花后代。夏季开花的杜鹃红山茶(Xu et al., 2017)也是非常特异的种质资源，但花为单瓣，而滇山茶的很多品种高度重瓣，如果选择倍性适宜的滇山茶品种与之杂交，也有可能获得花期延长的大花、重瓣品种。

山茶属植物存在广泛的自然杂交，从而形成异源多倍体和多倍体复合群(Huang et al., 2013)，植株的形态变异多样、复杂。滇山茶的二倍体、异源四倍体和异源六倍体，这些都是研究多倍体物种形成的优良材料。多倍化之后的DNA重组、转录和翻译水平的遗传变异以及与之关联的形态变异，都是有待深入研究的课题，为揭示山茶属乃至木本植物的多倍体进化提供新的参考资料。

此外，本研究发现，滇山茶主栽品种中，除六倍体之外，还有比例高达49.21%的八倍体，以及4.76%十倍体。那么，这些多倍体品种是如何演化而来的，也是需要解决的问题，因为栽培群体的遗传多样性及演化是其遗传育种的重要基础资料。然而，常规分子技术例如ITS序列、SSR分子标记等，并不适宜用来研究多倍性群体的遗传多样性及演化，筛选合适的单拷贝基因进行测序(Rothfels et al., 2017)，将有助于滇山茶多倍性栽培群体的遗传多样性及品种演化研究。

本研究采用流式细胞术对滇山茶主栽品种的细胞倍性进行了研究，被检测的63个滇山茶品种中，涉及六倍体29个、八倍体31个和十倍体3个，分别占被检品种总数的46.03%、49.21%和4.76%。滇山茶丰富的细胞倍性将为后期的杂交亲本选配、多倍体的遗传和进化等研究奠定基础。