森林土壤是微生物栖息的大本营，蕴含着大量能够提高树木营养吸收、林地生产力和环境适应性的有益微生物(Edwards et al., 2015; Hacquard et al., 2015)。林木根系与微生物群落之间存在复杂的相互作用。特定环境样品中所有微生物及其遗传信息的总和即构成了微生物组(microbiome)。真菌和细菌(多数情况下代表原核微生物中的真细菌，有别于古细菌)是微生物群落组成的主要成员(Bulgarelli, 2013; Schlaeppi et al., 2015)。随着宏基因组学和扩增子焦磷酸测序等技术的发展，使得人们对环境样品中微生物群落物种多样性、结构和功能的认识有了突破性进展(Guttman et al., 2014)。除了生物信息学分析和功能预测外，通过试验手段来阐明土壤微生物群落对植物表型和生理的调控能力及机制是后微生物组学时代的重要研究方向。有研究表明土壤菌群可以改变草本植物的耐旱性及激素水平(Lau et al., 2012; Yuan et al., 2015；Zolla et al., 2013)、生物量(Yergeau et al., 2015)、生殖物候(Wagner et al., 2014)、木质素合成代谢(Alison et al., 2015)等。在上述研究中都运用了土壤微生物细胞提取技术。

土壤微生物细胞提取技术主要包括土壤颗粒分散、微生物群落细胞提取、微生物代谢活力和群落结构评价等环节。土壤颗粒充分分散后，经过滤、离心等步骤，可提取到绝大部分细菌，但对真菌菌丝细胞的提取效率比较有限(向万胜等，2003)。多种化学溶剂可用于分散土壤颗粒，其中氯化钠、焦磷酸钠及Chelex-100树脂等是常见的土壤分散剂(Lindahl et al., 1996)。近年来也有研究使用植物Hoagland营养液提取菌体细胞(Badri et al., 2013; Zolla et al., 2013)；在研究土壤微生物群落对拟南芥(Arabidopsis thaliana)开花影响试验中，Wagner等(2014)用2.5 mmol·L^-1吗啉乙磺酸一水合物(MES)作为分散剂，将提取的菌体接种至植株根部。此外，超声波和搅拌器等物理方法处理对土壤颗粒、团聚体的分散也能起到较理想的效果(Lindahl et al., 1995; Priemé et al., 1996; UhlĺŘová et al., 2003)。不论使用哪一种土壤颗粒分散方法，对提取的菌体样品进行质量评估是十分必要的(Lindahl et al., 1996; Mayr et al., 1999; Barra Caracciolo et al., 2005; Maron et al., 2006)，质量优劣主要取决于能否保持土壤微生物群落的完整性和代谢活力。但是，目前还缺少对土壤菌体样品(尤其是真菌组分)的物种多样性特征、群落结构及生理功能等多项核心指标的全面分析。

本研究使用搅拌器和超声波2种物理分散方法以及焦磷酸钠和MES2种化学溶剂分散方法，对所得菌体样品进行细菌16S rRNA和真菌ITS扩增子焦磷酸测序、平板菌落计数以及微生物群落对含碳底物代谢功能多样性的群落水平生理特征(community level physiological profiling, CLPP)，综合评价4种土壤微生物细胞提取技术的优劣，提出一套高效、快捷的方法，为开展树木-根际微生物群落相互关系等相关领域研究提供重要技术依据。

土壤样品来源于河北省威县(36°98′N, 115°25′E)毛白杨(Populus tomentosa)良种基地，从根部周围收集面层土壤(深度约为10 cm)，放入采样箱中，周围放置冰袋。运回实验室后4 ℃保存备用。

1) 土样预处理  取适量土壤样品平铺于无菌锡箔纸上，在超净台吹风作用下风干，土样过20目筛，称重每份50 g土壤备用，约40份。

2) 土壤分散剂和培养基  配制0.05 mol·L^-1焦磷酸钠(Aladdin公司)、2.5 mmol·L^-1吗啉乙磺酸一水合物(MES)(Aladdin公司)溶液，在121 ℃条件下高压灭菌25 min。

培养细菌使用1/10 TSA平板(tryptic soy agar)(Difco公司)，培养真菌使用马丁氏培养基。高压灭菌后待培养基温度冷却至50 ℃左右，在培养基中加入终质量浓度为50 mg·L^-1抑霉唑硫酸盐(Sigma公司)，用于抑制霉菌生长；向马丁氏培养基中加入终质量浓度分别为50和20 mg·L^-1的硫酸链霉素和盐酸四环素(上海生工)，抑制革兰氏阴性和阳性细菌生长。需要指出的是，在预实验中笔者用高氏1号培养基分离培养土样的放线菌，结果表明放线菌的出菌率极低。因此本研究未考虑放线菌的平板计数。

3) 土壤样品处理  超声波处理法：在500 mL 0.85%生理盐水中加入50 g土样，颠倒混匀。用超声波细胞破碎仪(型号JY 92-Ⅱ，上海净信实业发展有限公司)分散土壤颗粒，设置功率60 W，工作和间隔时间为5 s/5 s，处理12次。搅拌器处理法：预处理方法同上，使用搅拌器(型号8011S，Waring公司)对土壤样品充分搅拌混匀，在20 000 r·min^-1速度下搅拌1.5 min。土壤分散剂处理法：将50 g土样加入无菌三角瓶中，分别加入250 mL 0.05 mol·L^-1焦磷酸钠和2.5 mol·L^-1 MES溶液，置于26 ℃水浴摇床150 r·min^-1振荡2 h左右。每种处理方式至少设3个重复。

4) 菌体样品制备  采用2步离心法获得菌体细胞。将上述土壤悬浮液样品转移至无菌离心瓶，569 g、4 ℃离心5 min(型号LYNX 4000，Thermo公司)，底部沉淀即为土壤颗粒。将离心瓶上面的悬浮液转移至新的无菌离心瓶，6 000×g、4 ℃离心20 min，弃上清后获得菌体沉淀样品(pellet)。用移液枪吸取无菌生理盐水将管壁上的菌体重悬浮并转移至无菌50 mL离心管中，6 000×g离心20 min，弃上清后将离心管倒扣在菌滤纸，吸掉残留液体。称质量并记录菌体沉淀质量。

子焦磷酸高通量测序方法，以细菌16S rRNA基因的V3-V4可变区和真菌核糖体转录间隔区ITS2基因为扩增片段。原始土样和菌体样品基因组DNA提取使用Power Soil DNA Isolation Kit(Mobio公司)试剂盒。文库构建步骤按照Illumina测序仪文库构建方法，在杭州联川生物技术有限公司完成测序和原始数据分析。根据相关文献，通过预试验选择适合的PCR引物及扩增条件(Fadrosh et al., 2014; Ihrmark et al., 2012; White et al., 1990)。下机序列进行双端合并、质量控制、去冗余等处理后，对最终获得的clean数据进行OTU聚类和物种分类注释。细菌16S rRNA、真菌ITS2原始序列提交至ENA数据库(https://www.ebi.ac.uk/ena，PRJEB20466-PRJEB20467、PRJEB20469-PRJEB 20470)。

用无菌生理盐水将定量的菌体样品稀释100倍，制备10^-2浓度的菌悬液。随后进行梯度稀释，得到10^-3和10^-42种浓度菌悬液。

取100 μL 10^-2的菌悬液，涂布于马丁氏平板，每组3个重复。25 ℃黑暗培养1周左右，观察真菌菌落形态并计数。分别取100 μL浓度为10^-3和10^-4的菌悬液，涂布于1/10 TSA平板，每个浓度3个重复，28 ℃培养3天后观察细菌菌落形态并计数。

该方法可以快速评价微生物群落碳源利用能力，间接反映微生物群落代谢活力(Preston-Mafham et al., 2002)。BIOLOG生态板(ECO板)用于分析土壤微生物群落(主要针对细菌)的代谢活力，而BIOLOG的真菌板(FF板)主要用于测定真菌群落的代谢活力(郑华等，2004)。将4种提取方法得到的菌体样品稀释成10^-3的菌悬液，分别接种至ECO板和FF板中(96孔板)，每孔100 μL，用封口膜密封，26 ℃黑暗培养1周。每隔24 h分别在590 nm(ECO板)和490 nm(FF板)波长下测定吸光度值。衡量微生物利用单一碳源能力和代谢活性以每孔颜色平均变化率(average well color development，AWCD)为主要指标。具体公式如下：

式中，C_i为除对照孔外各孔吸光度值，R为对照孔吸光度值。

用Excel 2016、GraphPad Prism V6.0和SPSS 20.0等软件处理原始数据并进行统计分析。

1) 菌体样品Alpha多样性比较分析  基于多个Alpha多样性指数比较了4种不同提取方法所得菌体样品中细菌和真菌可操作分类单元(OTU, operational taxonomy unit)数量、丰富度和均匀度(图 1)。实测OTU数(Observed species)和丰富度指数(Chao1)主要反映菌体样品中OTU数目和丰富度，数值越大代表物种数量越多。与原始土样相比，4种提取方法所得菌体样品上述2个指数呈一定下降趋势，其中超声波处理后细菌数量损失最大，而焦磷酸钠和搅拌器处理后真菌数量损失较大。香侬指数(Shannon)和辛普森指数(Simpson)则是代表样品丰富度和均匀度的综合指标。可以看出原始土样细菌丰富度和均匀度要略高于各处理组，其中MES和焦磷酸钠处理的样品中细菌香侬指数和辛普森指数高于超声波和搅拌器处理组(多数差异达到显著水平)。但对于真菌组分而言，处理组之间以及处理组与原始土样之间的香侬指数和辛普森指数均无显著差异。

图 1 原始土样与4种处理菌体样品中细菌(左)和真菌(右)Alpha多样性分析 Figure 1 Alpha diversity of bacterial (left) and fungal (right) communities in five sample types BS：原始土壤样品Bulk soils；PM：MES处理组Treated with MES；PP：焦磷酸钠处理组Treated with pyrophosphate；PU：超声波处理组Treated with sonication；PW：搅拌器处理组Treated with waring blender.下同。The same below.

2) 菌体样品Beta多样性和聚类分析  微生物群落Beta多样性能反映群落物种组成差异的大小。分别使用欧式距离(Euclidean)、非加权(unweighted)UniFrac和加权(weighted)UniFrac 3种矩阵算法计算了菌体样品中细菌和真菌群落结构的距离，获得距离矩阵后，使用UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic means)算法进行聚类(图 2)。加权UniFrac算法同时考虑了物种有无和物种丰度的变化，因此能全面比较各种样品之间群落结构的相似性。结果表明，焦磷酸钠处理组中的细菌群落结构与原始土壤最接近，其他处理组与原始土样距离较远(图 2C)；搅拌器处理组样品的真菌群落结构与原始土样最接近(图 2F)。欧氏距离算法同样支持了上述结论。基于非加权UniFrac算法的聚类树不能有效区分各处理组菌体样品之间群落结构的差异。

图 2 基于3种矩阵算法的原始土样与不同处理样品细菌(A—C)真菌(D—F)群落结构UPGMA聚类树 Figure 2 UPGMA cluster analysis of bacterial (A-C) and fungal (D-F) communities in five sample types based on euclidean, weighted and unweighted UniFrac distances

3) 菌体样品群落结构主坐标分析  主坐标分析(principal coordinates analysis, PCoA)结果显示不同提取方法所得菌体样品的微生物群落结构与原始土样有一定差异。细菌群落主坐标分析表明(图 3A)，原始土样与其余4种菌体样品距离较远，表明提取过程对土壤细菌群落结构影响较明显，2个主坐标的方差贡献率分别达到了51.34%和19.29%，说明降维效果较好。真菌群落主坐标分析结果(图 3B)显示原始土品相对与搅拌器处理组样品聚集在一起，距离较近，与其余3组样品有一定距离，两个主坐标的方差贡献率分别为62.10%和9.83%。表明只有搅拌物理分散法对土壤真菌群落结构的影响较小，这一结论与加权聚类分析结果保持一致(图 2F)。

图 3 不同处理组细菌(A)真菌(B)样品群落结构主坐标分析(基于Weighted UniFrac算法) Figure 3 The weighted UniFrac PCoA analysis of bacterial (A) and fungal (B) communities in four samples

结果表明，4种提取方法对可培养微生物数量影响较大(图 4)。其中搅拌器处理组的菌体样品中细菌数量(平均值为4.83×10⁴ cfu·g^-1干土)，显著高于其他3种菌体样品(P < 0.01)。MES处理组样品中的细菌数量最少(2.28×10⁴ cfu·g^-1干土)。焦磷酸钠处理组菌体样品中含有的真菌数量最多(平均值为3.60×10² cfu·g^-1干土)，显著高于其他3种处理方式(P < 0.05)，其他3种处理组间则差异不显著。

图 4 不同处理组的菌体样品中可培养微生物数量比较 Figure 4 Comparison of the number of culturable microbes in four samples A—D、E—H分别依次代表PM、PP、PU和PW等处理组样品中可培养细菌、真菌菌落形态。柱状图不同字母表示处理间生物数量差异显著(P < 0.05)。 A-D，E-H indicate the bacterial and fungal colonies recovered from the four samples. Different lowercase letters above columns indicate the significant differences between treatments (P < 0.05).

图 5展示了4种菌体样品在ECO板、FF板中培养7天内的AWCD值变化趋势。ECO板、FF板中所有样品的AWCD值均呈现上升趋势，终止培养(168 h)时AWCD值仍未达平缓期，表明菌群未消耗完供试碳源。在ECO板测试中，搅拌器处理组和焦磷酸钠处理组样品的AWCD值高于其他两种处理组，超声波处理组AWCD值最低，但各处理组之间差异不显著。相反，FF板测试结果表明4个处理组之间差异较明显，其中焦磷酸钠处理组样品的WCD值最高，与超声波、MES溶液处理组的差异达到了显著水平。此外，无论是ECO板还是FF板，超声波和MES溶液处理组的AWCD值均维持在较低水平。

图 5 利用ECO生态板(A)和FF真菌板(B)分析菌体样品的AWCD值变化 Figure 5 AWCD curves of microbial cells of four samples in ECO (A) and FF plates (B)

土壤微生物细胞的分离和提取是微生物群落生理代谢和环境响应机制等研究领域的一项重要技术(Smith et al., 1994; Ikeda et al., 2009; Williamson et al., 2013)。特别在近年来开展的根际微生物组对宿主表型与生理调控研究中，对该项技术提出了更高的要求(Mueller et al., 2015；Panke-Buisse et al., 2015)。该技术的关键在于既要提高土壤颗粒的分散程度促进细菌菌体、真菌孢子和菌丝的充分释放，还要保持菌体细胞的活力。从以往研究看，无论是使用物理方法还是化学分散剂，提取效率(保持微生物群落的完整性)的提高往往会对菌体造成伤害，从而导致整个菌群活力下降(Lindahl，1996；Lindahl et al., 1995)。因此，针对不同的研究内容和目的，需要对试验方案进行优化。如果研究菌群的生理代谢，可能需要降低超声波的强度和焦磷酸钠的浓度，以减少对菌体细胞的伤害。

从本研究结果可见，经超声波和MES溶液处理土壤样品后，提取效率和菌体细胞的质量均不够理想。共同特征表现为：与原始土样相比较，提取样品中的细菌、真菌群落碳源利用能力较弱，从而表明菌群整体生理代谢活力较低。其中超声波处理组样品中细菌和真菌群落物种多样性水平较低，同时发现该处理方式对可培养真菌数量影响较大。表明本研究使用的超声波处理强度偏低，导致对土壤团聚体的分散能力较差，也可能是强度过高导致对菌体细胞产生伤害。MES处理组所得样品虽然物种数量和多样性水平较高，但与原始土样群落结构相似度较低且可培养微生物数量显著低于其他处理组。综上，笔者推测MES溶剂也极有可能破坏了微生物细胞。因为微生物群落高通量测序技术只依赖于环境样品中DNA而非活体细胞。换言之，基于DNA的高通量测序结果不能准确反映样品中活体微生物的物种多样性。Wagner等(2014)用MES溶液提取土壤微生物细胞，研究其对拟南芥开花时间的影响。但从本研究结果看，并不推荐该方法。

相比较而言，搅拌器和焦磷酸钠处理能获得质量较好的菌体细胞，且各有优势。一方面主要表现在菌体样品群落结构特征与原始土样最接近，另一方面可培养真菌或细菌数量和碳源能力和代谢活性要高于其他处理组。说明这2种处理方法对细胞损伤较小，与前人研究结果基本一致。另外，虽然焦磷酸钠处理后提取的菌体总量偏少，但菌体样品的微生物群落结构及生理代谢功能并未受太大影响。因此，为了达到较理想的提取效率和质量，可以将机械搅拌和焦磷酸钠处理2种方法结合。

本研究采用4种方法提取了毛白杨根系周围土壤样品的微生物菌体细胞。总体而言，超声波和MES处理后土壤菌体细胞提取效率和质量较差；焦磷酸钠和搅拌器处理效果较好，菌体样品与原始土样的群落结构相似，且维持较高的代谢活力。根据这些特性，在实际应用中可以将这2种物理和化学提取方法相结合并适当优化。本研究为评价不同土壤微生物细胞技术的优劣提供了较完整的试验证据，为今后开展微生物群落功能及树木根系-菌群相互关系研究提供重要技术依据。