马尾松(Pinus massoniana)是我国松属中分布最广的乡土树种，第八次全国森林资源清查数据显示，马尾松面积为1 001万hm²，占全国乔木林面积的6.08%，广泛分布于秦岭、淮河以南的17个省、市、区，具有速生、丰产，适应性强，用途多，综合利用程度高等特性，在林业生产及森林生态系统中占有极其重要地位，是典型外生菌根树种(丁贵杰等, 2006)。外生菌根真菌与植物根系形成菌丝网络，扩大植物根系吸收面积，增强植物根系活力，提高植物吸收水分和营养代谢能力，这些变化直接导致根细胞结构和膜渗透性发生改变，进而影响根系分泌物的质量和数量(赵中秋等, 2003；Kim et al., 2010；Uddin et al., 2012)。

根系分泌物是植物生长过程中由根系的不同部位溢出或分泌出的一些无机离子、质子和有机化合物的统称，是植物根系长期适应环境的一种正常的、有利的生理现象，是根系固有的生理功能(吴林坤等, 2014)。根系分泌物在改善土壤理化性质、植物养分吸收和利用、化感作用、环境胁迫缓解等方面具有重要作用(涂书新等, 2010)，但根系分泌物的分泌受根际环境因素和微生物的影响和制约，尤其微生物对根系分泌物的影响很大(陈龙池等, 2002)。菌根化马尾松苗木是在育苗时接种外生菌根真菌，非菌根化苗木则为未接种。近年来，越来越多的学者关注菌根化马尾松苗木的研究，研究内容主要集中于接种外生菌根真菌后苗木生长、生理、根系构型、养分循环及耐胁迫性等方面(王艺等, 2013；2016；翟帅帅等, 2015)，但对接种外生菌根真菌后苗木根系分泌物变化的研究较少报道。本研究探索菌根化和非菌根化马尾松苗木根际土壤浸提物种类和数量的差异，进一步分析浸提物化学成分对种子萌发的影响，为研究菌根化育苗及马尾松天然更新提供科学依据和理论指导。

分别以接种褐环乳牛肝菌(Suillus luteus)Sl12和Sl13及不接菌的马尾松1年生苗木为试验材料。

分别将3种1年生苗木整株取出，将黏附在根系表面0~4 mm的土壤用灭菌刷刷下作为根际土壤。每个苗床采集150株苗木并收集根际土100 g，分处理进行土样混合，充分混匀后4 ℃冷藏。采用两种方法进行根际土壤浸提物的提取。方法一：乙醇浸提法(张汝民等, 2007)，并在其基础上进行改进。具体改进措施如下：分别取不接种、接种马尾松苗木根际土壤置于有盖锥形瓶中，按1:2的体积比加入85%的乙醇，置于28 ℃恒温摇床中震荡24 h；再置于4 ℃高速离心仪中，3 500 r·min^-1旋转20 min。离心后的上清液过滤，再置于旋转蒸发仪中脱去浸提剂，先用乙酸乙酯萃取1次，再分别用1 mol·L^-1的HCL和1 mol·L^-1 NaOH调节溶液pH为酸性和碱性，等量乙酸乙酯萃取，再将酸、中、碱性乙酸乙酯相合并，合并后的液体即为根系分泌物提取液。方法二：甲醇浸提法，分别取接种、不接种苗木根际土壤于有盖锥形瓶中，按1:2的体积比加入甲醇，震荡、离心、过滤即得到根际土壤浸提物。根际土壤浸提溶液各做3个重复。

将两种浸提方法得到的根际土壤浸提物于35 ℃旋转蒸发仪旋转浓缩，1 mL进行GC-MS分析，剩余用于种子化感作用。采用GC-MS Agilent-7 890 A/5975C气相色谱质谱联用仪进行分析，进样量为1.0 μL。色谱条件：色谱柱为AgilentDB-35 ms中性极性柱，以10 ℃·min^-1升温至230 ℃，以5 ℃·min^-1升温至260 ℃，保持2 min，再以10 ℃·min^-1升温至280 ℃保持20 min，运行时间48 min。质谱条件：离子源为EI源，温度为230 ℃；四级杆温度为150 ℃。采用峰面积归一化法计算各化学成分的相对百分含量。

化感作用采用培养皿滤纸法，由直径为9 cm的定量滤纸和培养皿构成。每个培养皿中放置100粒大小均匀的种子，加入5 mL不同处理的根际土壤乙醇浸提物。因根际浸提物较难溶于水，用1%乙醇溶解。为保持试验条件一致，对照也用1%乙醇蒸馏水进行处理，每个处理重复3次。置于25 ℃人工气候培养箱中，每天补充等量相应试验添加液，第5天开始统计发芽粒数，第15天时测其发芽率、芽苗生长和生物量等指标，并对数据进行化感效应指数计算(Brooks et al., 1981)，RI=T/C-1，负值为抑制，正值为促进，其中C为对照值，T为处理值，RI为化感效应指数。

数据统计基于每个处理3次重复的平均值，采用Excel2010和Origin8.0进行数据统计和图表制作，用SPSS18.0软件进行单因素方差分析和多重比较。

将2种浸提方法得到的土壤浸提物进行GC-MS分析，图 1为菌根化和非菌根化苗木根际土壤浸提物的总离子流图。

图 1 3种处理马尾松苗木根际土壤浸提物的总离子流 Figure 1 Total chromatogram of extractions from rhizospheric soil of Pinus massoniana seedlings under three treatments

根据图谱和MS谱库NIST08.L，对相似度85%以上的物质进行分析，接种褐环乳牛肝菌Sl12和Sl13苗木的根际土壤乙醇浸提物分别共有效命名了46和47种化合物，分属于9大类有机物质；接种褐环乳牛肝菌Sl12和Sl13苗木的根际土壤甲醇浸提物分别共有效命名了34和32种化合物，与乙醇浸提物化学成分相比，无烃类、醌类和酰胺类，其余物质种类相同(表 1)。乙醇浸提后接种褐环乳牛肝菌Sl12和Sl13苗木根际土壤浸提物中酸类相对含量较高，脂类次之；甲醇浸提后，接种Sl13菌株根际浸提物中则是脂类相对含量较高，酸类次之，接种Sl12菌株则相反。乙醇浸提物中，接种褐环乳牛肝菌Sl12和Sl13苗木有机酸类分别占总量的51.20%和48.80%；甲醇浸提物中，接种褐环乳牛肝菌Sl12和Sl13苗木的有机酸类分别占总量的39.06%和34.86%(表 1)。非接种苗木(CK)的根际土壤乙醇、甲醇浸提物分别共有效命名了24和23种化合物，其中以酯类相对含量较高，分别占总量的43.27%和39.59%。与接种苗木浸提物化学成分相比，未出现醛类、酚类、醌类和酰胺类物质(表 1)。

表 1 3种处理马尾松苗木根际土壤浸提物组分 Tab.1 Components of rhizospheric soil extractions of Pinus massoniana seedlings under three treatments

表 1 3种处理马尾松苗木根际土壤浸提物组分 Tab.1 Components of rhizospheric soil extractions of Pinus massoniana seedlings under three treatments 组分 Component 乙醇浸提物 Ethanol extraction 甲醇浸提物 Methanol extraction 种类数 Number of kind 占总类数百分比 Percentage of total(%) 种类数 Number of kind 占总类数百分比 Percentage of total(%) CK Sl12 Sl13 CK Sl12 Sl13 CK Sl12 Sl13 CK Sl12 Sl13 烃类Hydrocarbons 3 4 6 6.64 2.61 3.79 0 0 0 0.00 0.00 0.00 醇类Alcohol 1 3 3 11.61 14.12 9.16 1 2 1 17.87 17.75 17.11 醛类Aldehyde 0 2 4 0.00 0.56 0.79 1 2 2 0.44 0.67 0.73 酮类Ketones 1 1 1 1.06 0.43 0.54 0 2 1 0.00 1.07 0.27 酸类Acids 6 15 12 34.17 51.20 48.80 4 10 7 33.96 39.06 34.86 酯类Esters 10 12 18 43.27 23.61 33.63 13 13 14 39.59 32.01 38.91 酚类Phenols 0 1 0 0.00 0.52 0.00 1 2 1 0.35 0.54 0.22 醌类Quinones 0 3 0 0.00 1.66 0.00 0 0 0 0.00 0.00 0.00 酰胺类Amides 1 1 1 0.98 0.59 1.09 0 0 0 0.00 0.00 0.00 其他类Others 2 4 2 2.27 4.70 2.20 3 3 6 7.79 8.90 7.90 总计Total 24 46 47 100.00 100.00 100.00 23 34 32 100.00 100.00 100.00

根据图谱和MS图谱库NIST08.L，对相似度在85%以上的物质进行分析，得出接种褐环乳牛肝菌Sl12和Sl13苗木的乙醇根际土壤浸提物相对含量在1%以上的组分分别有18和16种，甲醇浸提物相对含量在1%以上的组分分别有12和9种，两种接种苗共同出现的物质有硬脂酸、棕榈酸、2, 4-二叔丁基苯酚和5-羟甲基糠醛，其中硬脂酸和邻苯二甲酸的相对含量最高(表 2)。非接种苗木(CK)的根际土壤乙醇、甲醇浸提物相对含量在1%以上的组分分别有16和7种，甲醇和乙醇两种浸提物均包括A-古云烯、丙酸、棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯。谷固醇，棕榈酸、棕榈酸甲酯、9-十六碳烯酸乙酯和脱氢枞酸甲酯等为菌根化和非菌根化苗木共同出现的物质成分，其中乙醇浸提物中谷固醇的相对含量较大，为11.61%，甲醇浸提物中γ-谷甾醇的相对含量较大，为17.87%(表 2)。

表 2 3种处理马尾松苗木根际土壤浸提物化学组分的相对含量(>1%) Tab.2 Relative contents of chemical constitute from rhizospheric soil extracts of Pinus massoniana seedlings under three treatments (>1%)

表 2 3种处理马尾松苗木根际土壤浸提物化学组分的相对含量(>1%) Tab.2 Relative contents of chemical constitute from rhizospheric soil extracts of Pinus massoniana seedlings under three treatments (>1%) 物质类别 Category of substances 化感物质Allelochemical 分子式 Molecular formula 相对含量Relative content(%) 乙醇(Ethanol) 甲醇(Methanol) CK Sl12 Sl13 CK Sl12 Sl13 烃类 Hydrocarbons 二酚基丙烷2, 2-Bis-4-hydroxyphenylpropane C15H16O2 1.69 — — — — — 西松烯Cembrene C20H32 1.08 — — — — — α-古芸烯α-gurjunene C15H24 3.87 — — — — — 醇类Alcohol β-谷固醇β-sitosterol C29H50O — — 7.44 — — 17.11 谷固醇Stigmasterol C29H48O 11.61 2.37 1.46 — 2.61 — γ-谷甾醇γ-sitosterol C29H50O — 11.45 — 17.87 15.14 — 酮类Ketones 2, 2-二乙氧基苯乙酮2, 2-Diethoxyacetophenone C12H16O3 1.06 — — — — — 酸类Acids 2-氨基-6-甲基苯甲酸2-Amino-6-methylbenzoic acid C8H8NO2 2.69 — — — — — 1, 2, 4-苯三甲酸1, 2, 4-Benzenetricarboxylic acid C9H6O6 1.53 — — — — — 丙酸Propionic acid C3H6O2 6.04 — — — — — 棕榈酸n-Hexadecanoic acid C16H32O2 21.97 14.34 13.69 21.09 11 11.14 11-烯酸E-11-Hexadecenoic acid C16H30O2 — 5.76 — — — — 硬脂酸Octadecanoic acid C18H36O2 — 14.19 13.25 — 10.17 10.15 十八碳二烯酸Linoleic acid C18H32O2 — 4.48 — — — — 邻苯二甲酸1, 2-Benzenedicarboxylic acid C16H22O4 — 5.34 5.79 — — — 乙酸Acetic acid C2H4O2 — 1.27 1.10 — — — 苯乙酸Phenylacetic acid C8H8O2 1.89 — — — — — 醌类Quinones 1-羟基-2-甲氧基蒽醌Alizarin 2-methyl ether C15H10O4 — 1.21 1.09 — — — 酰胺类Amides (Z)-9-十八烯酸酰胺9-Octadecenamide C18H35NO — 1.45 1.09 — — — 醛类Aldehyde 5-羟甲基糠醛2-Furancarboxaldehyde, 5- (hydroxymethyl) C6H6O3 — 1.41 1.13 1.44 1.48 1.51 酚类Phenols 2, 4-二叔丁基苯酚Phenol, 2, 4-bis(1, 1-dimethylethyl) C14H22O — 1.35 1.10 — 1.35 1.22 酯类Esters 棕榈酸乙酯Hexadecanoic acid, ethyl ester C18H36O2 5.44 11.63 8.03 —- — — 9-十六碳烯酸乙酯Ethyl 9-hexadecenoate C18H34O2 5.90 0.6 4.27 — — — 油酸乙酯Ethyl Oleate C20H38O2 1.68 3.52 3.19 — — — 反油酸乙酯(E)-9-Octadecenoic acid ethyl esteer C20H38O2 2.23 — — — — — 亚油酸乙酯9, 12-Octadecadienoic acid, ethyl ester C20H36O2 2.11 — — — — — 单棕榈酸酯Hexadecanoic acid, 2, 3-dihydroxypropyl ester C19H38O4 1.89 — — — — — 十四酸乙酯Ethyl myristate C16H32O2 — 1.09 1.29 — — — 棕榈酸甲酯Hexadecanoic acid, methyl ester C17H34O2 — — 2.63 9.78 7.46 9.35 十七酸乙酯Ethyl heptadecanoate C18H36O2 — 1.77 1.70 — — — 十六烯酸甲酯9-Hexadecenoic acid, methyl ester C18H38O4 — — — — 8.75 8.86 反-9-十八烯酸甲酯9-Octadecenoic acid, methyl ester C19H36O2 — — 1.40 4.47 5.85 7.55 亚油酸甲酯9, 12-Octadecadienoic acid (Z, Z)-, methyl ester C19H34O2 — — — 3.55 2.89 3.75 14-甲基十六烷酸甲酯Hexadecanoic acid, 14-methyl-, methylester C18H36O2 — — — 1.26 1.49 2.15 脱氢枞酸甲酯Methyl 8, 11, 13-abietatrien-18-oate C21H30O2 — — — — 1.50 2.46

图 2表明，接种Sl12和Sl13浸提物对马尾松种子萌发率、发芽指数、活力指数、胚轴长、胚根长均有抑制作用，化感效应指数分别为-0.27、-0.29，-0.68、-0.73，-0.32、-0.39，-037、-0.34，-0.72、-0.82。

图 2 种处理马尾松苗木根际乙醇土壤浸提物对种子的化感效应 Figure 2 Allelopathic effect of ethanol extractions from rhizospheric soil of Pinus massoniana seedlings under three treatment

研究发现，根际土壤乙醇浸提物物质成分中，非菌根化苗木中相对含量较高的酸类化合物有棕榈酸，菌根化苗木中相对含量较高的有棕榈酸、硬脂酸和邻苯二甲酸，皆为酚酸类有机物质，与曹光球等(2005)和段剑等(2015)的研究结果相似。Techer等(2011)研究表明，真菌侵染影响宿主植物根系分泌物的种类和数量。本研究结果表明，接种褐环乳牛肝菌苗木根际土壤浸提物物质种类较不接种苗木种类多，菌根化苗木中相对含量较高的酸类化合物有棕榈酸和硬脂酸，非菌根化苗木中相对含量较高的酸类化合物仅有棕榈酸，且各化学组成成分相对含量也不同。接种外生菌根真菌后苗木根际浸提物中有机酸含量增加，醇类含量减少，酯类含量发生变化，这与曾燕红(2015)研究接种摩西球囊霉后，黄花蒿(Artemisia annua)根系分泌物的物质种类增加，有机酸的含量发生变化的结果相似。接种外生菌根真菌后苗木根际和菌根真菌形成共生关系，根际土壤较非根际土壤含有较高的营养和能源物质，能增加根际土壤微生物的数量，而微生物产生的酶类物质可以改变土壤中的有效养分，固定土壤养分含量，提高植物吸收养分的能力，进而促进根系分泌物的增加。

土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶，是评价土壤P元素生物转化方向与强度的指标，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化，而马尾松缺P会导致植物发生紫化现象。Marschner等(2003)认为根际pH值的调节，主要是通过根分泌的有机酸或H⁺浓度的增加使根际酸化，其原理是植物生长过程中，根系正常呼吸产生的CO₂和根分泌的有机酸或H⁺产生相互作用。本研究中，接种外生菌根真菌后，有机酸的种类和含量增加，导致土壤中H⁺的数量增加，改变土壤酸性磷酸酶的活性。相关研究表明接种菌根真菌后，根际土壤pH值降低，显著增加根际土壤酸性磷酸酶的活性，改善植物对P的吸收和利用，从而提高根际土壤肥力，促进植物的生长(袁丽环等, 2010；宰学明等, 2014；罗晓蔓等, 2016)。菌根真菌能使植物根系分泌物中有机酸的含量发生变化从而影响植物的生长，但影响植物生长的有机酸酸类物质是哪些还需进一步研究。

植物种子萌发与多种因素有关，如种皮特点，种子内含物，环境因素(Rovira, 1969；Nerson, 2002；周艳等, 2015)。化感物质对种子萌发的促进作用可能是影响激素的合成与分配，提高酶的活性，其抑制作用可能是在萌发过程中降低了所需关键酶的活性，或破坏植物的细胞酶，改变细胞的伸长和分裂(Bogatek et al., 2006)。本研究结果显示：菌根化马尾松苗木根际土壤浸提物对马尾松种子萌发具有一定抑制作用。可能是种子萌发是自身储藏物质的消耗过程，种子内含物的不同影响种子萌发率等生理指标。其次是接种外生菌根真菌改变了马尾松苗木根际土壤中化学成分和含量，在种子萌发过程中，浇灌根际土壤浸提物，养分过高或者根系分泌物物质的酸碱性抑制种子内部酶、蛋白质、激素等的生理活性从而抑制种子的萌发。因此，还需把萌发环境和种子内含物的变化协同起来做更加深入、系统地研究菌根化马尾松苗木根际土壤浸提物溶液对马尾松种子萌发影响的原因。

1) 接种外生菌根真菌改变苗木根系分泌物(根际土壤浸提物)的物质组成成分，增加根系分泌物的种类和含量。菌根化和非菌根化马尾松苗木根际土壤的乙醇浸提物对种子的萌发有一定抑制作用。

2) 有机提取剂极性的不同影响根系分泌物的萃取成分。本研究中采用乙醇有机溶剂浸提，菌根化苗木根际土壤浸提物的物质种类高于甲醇浸提物，从物质种类和数量角度考虑，采用乙醇浸提更充分。