落叶松属(Larix)植物约18个种，且有许多变种、杂种，广布于北极圈两侧、温带和寒带山区，是我国东北部地区重要的速生用材树种，分为落叶松组(Sect. Larix)和红杉组(Sect. Multiseriales)(中国植物志编辑委员会，1978)。在落叶松组中，我国原产的有新疆落叶松(L. sibirica)、华北落叶松(L. principis-rupprechtii)、兴安落叶松(L. gmelinii)及长白落叶松(L. olgensis)，引进的主要有日本落叶松(L. kaempferi)。此外，由于落叶松的种间易交，几乎所有落叶松的种间、变种间及生态型之间都能杂交并产生饱满的种子(杨书文等，1994)，且这些种间杂种也常具有合乎人们需要的杂种优势(潘本立等，1981；Matyssek et al., 1987；Kurahashi et al., 1986)，因此落叶松的杂交育种倍受重视。在过去的几十年，我国的落叶松种间杂交育种已取得了一定成绩，选育出了日本×长白落叶松(L. kaempferi×olgensis)、日本×兴安落叶松(L. kaempferi×gmelinii)及兴安×日本落叶松(L. gmelinii×kaempferi)等一批适合东北地区生长的优良杂种(王伟达等，2009)。

相较于传统繁育手段，体细胞胚发生具有繁殖效率高、不受季节限制的优点，可以克服实际生产中落叶松种子产量不稳定、子代变异大、扦插繁殖生根率较低等问题。日本落叶松、长白落叶松、日本×长白落叶松及日本×欧洲落叶松(L. kaempferi×decidua)等落叶松属种及杂种均已相继建立了相应的体胚胎发生体系(Klimaszewska，1989；Thompson et al., 1992；Yong et al., 1998；齐力旺，2000；吕守芳等，2005；王伟达，2008；Lelu et al., 2011)。但受到组织增殖效率及体胚成熟率低等因素的影响，目前的技术体系仍不能满足落叶松体胚商业化生产的要求。悬浮细胞培养作为一种有效的生物工程技术，具有分散性好、生长迅速、重复性好等特点，被认为是可实现细胞快速增殖的有效手段，能够为体细胞胚的大量同步发生、遗传转化提供良好的材料(方文娟等，2005)。然而目前国内外有关落叶松属植物胚性愈伤组织悬浮培养方面的研究仍十分有限。

本研究以长白落叶松、日本×长白落叶松及兴安×日本落叶松的胚性细胞系为研究对象，建立并优化胚性愈伤组织的悬浮培养体系，研究接种量、震荡强度及培养周期对悬浮组织增殖的影响。并在此基础上进行体细胞胚的成熟培养，完成落叶松胚性悬浮组织的体细胞胚发生，旨在为实现落叶松胚性愈伤组织的快速增殖及体细胞胚的规模化繁育奠定基础。

落叶松胚性愈伤组织由未成熟胚(子叶前期)诱导而来(宋跃等，2016a)。本研究中供试胚性系的遗传背景及诱导条件见表 1，以新鲜增殖的胚性愈伤组织作为后续研究的材料。

表 1 供试胚性系的遗传背景及诱导条件 Tab.1 Induction conditions and mother tree of embryogenic lines of Larix for testing

表 1 供试胚性系的遗传背景及诱导条件 Tab.1 Induction conditions and mother tree of embryogenic lines of Larix for testing 胚性系 Lines 采种母树 Mother tree 诱导条件 Induction condition 采种日期 Seed collection date 生长调节剂 Growth regulators OO-A1 长白落叶松‘长73-50’ L. olgensis ‘Chang 73-50’ 2014-06-27 1.5 mg·L-12, 4-D; 0.5 mg·L-16-BA; 0.5 mg·L-1 KT CK-F1 兴安×日本落叶松‘兴10×日13’ L. gmelinii×kaempferi ‘Xing 10×Ri 13’ 2014-07-03 0.5 mg·L-12, 4-D; 0.5 mg·L-1 6-BA; 0.5 mg·L-1KT KO-H 日本×长白落叶松‘日5×长77-3’ L. kaempferi×olgensis ‘Ri 5×Chang 77-3’ 2014-06-27 1.5 mg·L-12, 4-D; 0.5 mg·L-16-BA; 0.5 mg·L-1KT

将约0.25 g的胚性愈伤组织按照质量体积比0.5%接种于含有2, 4-D 0.15 mg·L^-1、6-BA 0.05 mg·L^-1、KT 0.05 mg·L^-1、肌醇1.0 g·L^-1、谷氨酰胺(Glutamine，Gln) 1.0 g·L^-1、水解酪蛋白(hydrolyzed casein，CH)0.5 g·L^-1、蔗糖25 g·L^-1的BM液体培养基(悬浮培养基suspension culture medium，SCM)中，120 r·min^-1、25 ℃的条件下暗培养，直至获得相对浓稠的胚性悬浮组织。

采用L₉(3⁴)正交试验设计(表 2)，研究接种量、震荡强度及培养周期等因素对悬浮组织增殖的影响。无菌条件下，用60目(0.3 mm)细胞筛滤除培养液，称量0.10、0.25、0.40 g悬浮组织，分别接种于25 mL SCM培养基中(此时的接种量分别为4.0、10.0、16.0 g·L^-1)，震荡强度为60、120、180 r·min^-1，培养5、10、15天时称量胚性悬浮组织的鲜质量。

表 2 L₉(3⁴)正交试验设计的因素与水平 Tab.2 Experimental factor and level of orthogonal design L₉(3⁴)

表 2 L9(34)正交试验设计的因素与水平 Tab.2 Experimental factor and level of orthogonal design L9(34) 试验因素 Experimental factors 因素的水平 The level of the factors 1 2 3 接种量 Inoculum amount /(g·L-1) 4 10 16 震荡强度 Shaking intensity /(r·min-1) 60 120 180 培养周期 Culture period /d 5 10 15

根据试验结果，分别以胚性悬浮组织的增殖量及增殖率为响应值，使用Minitab 17软件对培养条件的组合进行优化，并对优化结果做进一步的试验验证。

体细胞胚的成熟培养方法参考作者前期研究(宋跃等，2016b；宋跃，2017)的方法并加以改进，主要有以下3种：第1种方法，将悬浮组织滤出后，直接接种到成熟培养基(mature culture medium，MCM，含有ABA 20 mg·L^-1、AgNO₃ 5 mg·L^-1、PEG₄₀₀₀ 80 g·L^-1、蔗糖60 g·L^-1的BM培养基)上进行体胚成熟培养；第2种方法，先将悬浮组织接入过渡培养基(transition culture medium，TCM，添加肌醇10 g·L^-1且无生长调节剂的1/4BM培养基)上预培养14天，再转入MCM培养基培养；第3种方法，悬浮组织先在固体增殖培养基(proliferation culture medium，PCM，含有琼脂6 g·L^-1，其他成分同SCM)上继代15天后，转到TCM培养14天，再转到MCM上进行体胚的成熟培养8周，统计体细胞胚的发生量。表 3为上述PCM、SCM、TCM、MCM培养基的主要成分一览表。

表 3 落叶松胚性愈伤组织增殖与体胚成熟培养培养基及主要成分 Tab.3 Culture medium and main components of embryogenic callus proliferation and somatic embryogenesis in Larix

表 3 落叶松胚性愈伤组织增殖与体胚成熟培养培养基及主要成分 Tab.3 Culture medium and main components of embryogenic callus proliferation and somatic embryogenesis in Larix 培养基 Medium 简称 Abbreviation 状态 States 基本培养基 Basic medium 生长调节物 Growth regulators /(g·L-1) 2, 4-D 6-BA KT ABA 增殖培养基 Proliferation culture medium PCM 固 Solid BM 0.15 0.05 0.05 — 悬浮培养基 Suspension culture medium SCM 液 Liquid BM 0.15 0.05 0.05 — 过渡培养基 Transition culture medium TCM 固 Solid 1/4BM — — — — 成熟培养基 Mature culture medium MCM 固 Solid BM — — — 20.0

胚性愈伤组织的增殖量(mg)=增殖后胚性愈伤组织的鲜质量－接种前愈伤组织的鲜质量；胚性愈伤组织的增殖率(%)=胚性愈伤组织的增殖量/接种组织的鲜质量×100%；胚性愈伤组织的增殖速率(mg·d^-1)=胚性愈伤组织的增殖量/培养周期；体胚发生量(个·g^-1)=体细胞胚的数量/胚性愈伤组织的鲜质量。本研究的数据均采用PASW Statistics 18及Minitab 17软件进行分析，多重比较采用LSD及Duncan法。

将新诱导出的胚性愈伤组织(图 1A)按质量体积比0.5%接种于BM液体培养基中，120 r·min^-1、避光培养15~45天(每15天添加1次新鲜培养基，使其总体积保持为50 mL)即可获得较浓稠的悬浮组织。此后，每14天进行1次“液体-液体”继代，不仅可以实现胚性组织的稳定增殖，而且还能够使其长期保持胚性，即形成胚性悬浮细胞系。显微观察发现：相较于固体培养(图 1B)，这些悬浮培养获得的胚性培养物(图 1C)(即原胚团)的细胞排列更加松散，且形成的细胞团体积也较小。

图 1 落叶松胚性愈伤组织及2种方式增殖的原胚团显微结构比较 Figure 1 Embryogenic callus and microstructure of embryogenic suspensor mass of Larix PE:胚性细胞; S:胚柄细胞。A：落叶松胚性愈伤组织；B：固体培养基上增殖获得的胚性培养物的显微结构，即胚性胚柄细胞团；C：悬浮培养获得的不同阶段的原胚团。 PE: The embryonic cells or pro-embryonal; S: The suspensor-like cell. A: The embryogenic callus(EC)of Larix; B: The microstructure of embryogenic suspensor mass(ESM)obtained from proliferation on solid medium(PCM); C: The ESM obtained by suspension culture, namely ESM that is pro-embryogenic mass(PEM)at different stages.

比较2种培养方式对落叶松胚性愈伤组织增殖的影响(表 4)可知，在相同条件下悬浮培养的胚性组织增殖更快，平均增殖速率达235.24 mg·d^-1，是固体培养的9.35倍。方差分析表明，增殖方式对落叶松胚性愈伤组织的增殖速率影响极显著(P=0.000)。

表 4 培养方式对落叶松胚性愈伤组织增殖的影响^① Tab.4 Effects of cultivation methods on the proliferation of embryogenic callus of Larix

表 4 培养方式对落叶松胚性愈伤组织增殖的影响① Tab.4 Effects of cultivation methods on the proliferation of embryogenic callus of Larix 培养方式 Cultivation methods 胚性愈伤组织的增殖速率 The proliferative rate of embryogenic tissue(±SE)/(mg·d -1) OO-A1 GK-F1 KO-H 固体培养 Solid culture 33.05±1.38 c 24.22±1.38 c 18.17±0.45 c 悬浮培养 Suspension culture 212.95±7.23 a 286.00±33.12 b 206.78±6.58 a   ①固体培养培养基为PCM，悬浮培养培养基为SCM。不同字母表示在0.05水平上差异显著。The medium of solid culture is PCM, and the medium of suspension culture is SCM. Different letters indicate significant differences at 0.05 level.

在一定范围内，落叶松胚性组织的增殖率随着接种量的增加而逐渐降低(表 5)。当胚性组织的接种量为4.0 g·L^-1时较适合悬浮组织的增殖，OO-A₁、GK-F₁及KO-H 3个胚性系组织的增殖量分别为(1.47±0.36)、(2.04±0.42)、(2.21±0.52) g，而增殖率为1 568.78%±359.64%、2 137.00%±422.57%及2 309.56%±519.16%。方差分析结果表明，接种量对胚性悬浮组织的增殖量(P=0.005)及增殖率(P=0.000)的影响均达到极显著水平。

表 5 初始接种量对落叶松胚性悬浮组织增殖的影响^① Tab.5 Effect of initial inoculum amount on the proliferation of embryogenic suspension tissue of Larix

表 5 初始接种量对落叶松胚性悬浮组织增殖的影响① Tab.5 Effect of initial inoculum amount on the proliferation of embryogenic suspension tissue of Larix 胚性系 Embryogenic lines 接种量 Inoculum amount /(g·L-1) 增殖量 Proliferation quantity(±SE)/ g 增殖率 Proliferation rate(±SE)(%) 4.0 1.469±0.360 c 1 568.778±359.645 d OO-A1 10.0 1.081±0.418 b 532.533±166.991 b 16.0 1.179±0.174 b 394.719±43.389 b 4.0 2.037±0.423 d 2 137.000±422.574 e GK-F1 10.0 1.823±0.782 d 829.350±312.673 c 16.0 0.381±0.089 a 195.188±22.364 a 4.0 2.210±0.519 e 2 309.556±519.156 e KO-H 10.0 1.905±0.648 d 862.150±259.101 c 16.0 1.790±0.303 d 547.531±75.642 b   ①同列不同字母表示在0.05水平上差异显著。下同。Different letters indicate significant differences at 0.05 level in the same column. The same below.

落叶松胚性系悬浮组织的增殖量及增殖率均随震荡强度的增加而呈现出先增加后降低的变化趋势(表 6)。当震荡强度为60 r·min^-1时培养10天，OO-A₁、GK-F₁及KO-H 3个胚性系间组织的增殖率与增殖量无显著差异；震荡强度达120 r·min^-1时，3个胚性系悬浮组织的增殖量及增殖率均达最大值。方差分析结果表明，震荡强度对落叶松胚性悬浮组织的增殖量(P=0.000)及增殖率(P=0.000)的影响均达到极显著水平。

表 6 震荡强度对落叶松胚性悬浮组织增殖的影响 Tab.6 Effect of shaking intensity on the proliferation of embryogenic suspension tissue of Larix

表 6 震荡强度对落叶松胚性悬浮组织增殖的影响 Tab.6 Effect of shaking intensity on the proliferation of embryogenic suspension tissue of Larix 胚性系 Embryogenic lines 震荡强度 Shaking intensity /(r·min-1) 增殖量 Proliferation quantity(±SE)/ g 增殖率 Proliferation rate(±SE)(%) 60 0.301±0.086 a 216.244±28.986 a OO-A1 120 2.091±0.175 d 1 259.672±234.838 c 180 1.240±0.335 c 1 000.283±366.977 b 60 0.422±0.140 a 295.142±52.727 a GK-F1 120 2.613±0.568 e 1 668.639±396.906 de 180 0.876±0.416 b 944.856±421.664 b 60 0.481±0.140 a 319.607±47.122 a KO-H 120 3.088±0.283 f 1 795.128±338.493 e 180 2.032±0.463 d 1 518.894±540.230 d

试验结果(表 7)表明，在一定范围内，落叶松胚性悬浮组织的增殖量及增殖率随培养周期的延长而增加，但不同胚性系间也略有差异。培养15天可获得相对较好的增殖效果，3个落叶松胚性系OO-A₁、GK-F₁及KO-H悬浮组织的增殖量分别为(2.01±0.36)g、(2.68±0.62)g及(2.97±0.57)g，而增殖率则分别达1 417.69%±337.32%、1 725.03%±368.92%及2 072.33%±519.80%。方差分析结果表明，培养周期对落叶松胚性悬浮组织的增殖量(P=0.000)及增殖率(P=0.000)的影响均达到极显著水平。

表 7 培养周期对落叶松胚性悬浮组织增殖的影响 Tab.7 Effect of culture cycle on the proliferation of embryogenic suspension tissue of Larix

表 7 培养周期对落叶松胚性悬浮组织增殖的影响 Tab.7 Effect of culture cycle on the proliferation of embryogenic suspension tissue of Larix 胚性系 Embryogenic lines 培养周期 Culture period /d 增殖量 Proliferation quantity(±SE)/ g 增殖率 Proliferation rate(±SE)(%) 5 0.549±0.250 b 253.117±59.410 ab OO-A1 10 1.261±0.226 d 938.883±292.478 c 15 2.012±0.355 e 1 417.694±337.324 e 5 0.268±0.117 a 201.994±38.262 a GK-F1 10 1.298±0.460 d 1 234.512±496.704 d 15 2.675±0.622 f 1 725.031±368.921 f 5 0.967±0.343 c 406.283±70.003 b KO-H 10 2.126±0.290 e 1 478.531±443.651 e 15 2.967±0.574 g 2 072.331±519.801 g

根据前期的试验结果，采用Minitab 17软件对3个胚性系悬浮培养的最适条件进行预测(表 8)：接种量为4 g·L^-1，120 r·min^-1培养15天后，胚性系OO-A₁、GK-F₁及KO-H悬浮组织的增殖率均可达到最大值，分别增殖30.85、43.52及43.86倍。3个落叶松胚性系悬浮组织增殖结果的比较见图 2。为验证预测结果的可靠性，在拟合的最适条件下进行验证试验，待培养至第5、10、15及20天时称量悬浮组织的鲜质量，并测定培养过程中培养基的pH值，各处理均进行3次平行试验，计算平均增殖率并绘制增殖曲线(图 3)。

表 8 落叶松胚性组织悬浮培养优化条件的预测 Tab.8 Prediction results of the optimization of suspension culture conditions of Larix embryogenic lines

表 8 落叶松胚性组织悬浮培养优化条件的预测 Tab.8 Prediction results of the optimization of suspension culture conditions of Larix embryogenic lines 胚性系 Embryogenic lines 拟合最佳条件 Optimal condition of fitting 拟合增殖结果 Fitted values 震荡强度 Shaking intensity / (r·min-1) 培养时间 Incubation period/d 接种量 Inoculum amount/g 增殖量 Proliferation quantity (±SE)/g 增殖率 Proliferation rate(%) OO-A1 120 15 0.10 2.985±0.172 3 085.01 GK-F1 120 15 0.10 4.252±0.236 4 351.75 KO-H 120 15 0.10 4.286±0.310 4 385.60

图 2 3个落叶松胚性系悬浮组织增殖结果的比较 Figure 2 Comparison of morphology after suspension culture of three embryogenic lines of Larix A、B、C分别为胚性系OO-A1、GK-F1、KO-H悬浮组织增殖5及15天的状态。 A, B and C show the state of proliferation for 5 or 15 days of embryogenic suspension tissue of embryogenic lines OO-A1, GK-F1 and KO-H.

图 3 胚性悬浮组织鲜质量及培养基pH值的变化曲线 Figure 3 Curves of fresh mass and medium pH in the suspension culture process of embryogenic callus of Larix FMp:预测鲜质量；FMa:实际鲜质量；pH:培养基pH。 FMp: An abbreviation for prediction of fresh mass of embryogenic callus; FMa: An abbreviation for actual of fresh mass of embryogenic callus; pH: The pH value of the suspension culture medium.

3个落叶松胚性系悬浮组织的增殖均呈“S”型曲线(图 3)。培养15天时，悬浮系GK-F₁的平均增殖率为4 189.90%，在拟合值的95%置信区间范围内；而胚性系OO-A₁及KO-H的平均增殖率分别为2 669.40%及3 001.60%，均低于95%置信区间的最小值，但其各次平行试验的测量值均在95%预测区间范围内。这些研究结果表明预测结果是相对可靠的。

胚性悬浮组织的体胚发生结果见表 9。方差分析结果显示，悬浮组织的遗传基础对体胚发生量的影响极显著(P=0.000)，多重比较结果表明，胚性系KO-H与GK-F₁、OO-A₁间的体胚发生量存在极显著差异(P＜0.001)；此外，体胚成熟的培养方法(见1.4)对悬浮组织的体胚发生量也具有极显著的影响(P=0.000)，其中第3种方法与前2种方法相比，其体胚发生量显著提高(P＜0.05)，3个胚性系OO-A₁、GK-F₁及KO-H的胚性悬浮组织体胚发生量分别为(101.69±11.19)、(93.09±9.34)及(5.78±1.47)个·g^-1。

表 9 落叶松胚性系悬浮组织的体细胞胚发生^① Tab.9 Somatic embryogenesis of suspension callus of embryogenic lines of Larix

表 9 落叶松胚性系悬浮组织的体细胞胚发生① Tab.9 Somatic embryogenesis of suspension callus of embryogenic lines of Larix 胚性系 Embryogenic lines 体细胞胚发生量 The amount of somatic embryogenesis(±SE)/(embryo·g-1) 方法 Method 1 方法 Method 2 方法 Method 3 OO-A1 55.62±9.88 b 72.80±8.87 bc 101.69±11.19 d GK-F1 19.92±0.68 a 85.21±6.02 cd 93.09±9.34 cd KO-H 2.85±0.82 a 2.76±0.47 a 5.78±1.47 a   ①不同字母表示在0.05水平上差异显著。Different letters indicate significant differences at 0.05 level.

在以往的落叶松体胚发生研究中，胚性愈伤组织的增殖培养几乎都是在固体培养基上进行的。有研究表明，日本落叶松的胚性愈伤组织在含有2, 4-D 0.1 mg·L^-1的固体培养基上培养20天可以获得较大的增殖量，增殖率可达95.7% ~ 165.2%(吕守芳等，2005)；日本×长白落叶松胚性愈伤组织在固体培养基上增殖，其鲜质量在2周内即可增加(3.5±0.34)倍(王伟达，2008)。而在悬浮培养过程中，悬浮组织能够均匀地分散于培养介质中，减少了细胞间的接触抑制，同时也更利于进行胞内外物质的交换。王跃华等(2011)曾用川贝母(Fritillaria cirrhosa)细胞团块进行悬浮培养，发现其生长速度明显快于固体培养，且延迟期短、增殖倍数高。本研究中对落叶松3个胚性系OO-A₁、GK-F₁及KO-H的悬浮培养也得到了相似的研究结果。

接种量对悬浮细胞培养而言是重要的生物影响因子，对细胞的增殖过程和生长参数有非常显著的影响(杨金玲等，2000)。植物细胞在悬浮培养时较固体培养更为分散，只有当接种细胞的相对浓度达到某一临界水平时才能开始分裂。但接种量过高，则会使细胞在有限的生存空间内争夺营养物，引起接触抑制发生，限制组织的增殖(方文娟等，2005)。史昆等(2014)发现马尾松(Pinus massoniana)悬浮组织的增殖受接种量的影响，每30 mL培养基内接种1 g组织时是较理想的，升高或降低接种量都会降低组织的增殖系数。而对于欧洲黑松(Pinus nigra)而言，按4 g·L^-1接种更利于其胚性细胞的生长(Salaj et al., 2007)。本研究的结果表明，落叶松胚性悬浮组织增殖所需的临界浓度极低，以4 g·L^-1接种即可实现胚性组织的快速增殖。

悬浮培养过程中适宜的震荡强度可以改善组织的通气及分散状态，使植物细胞能够快速有效地生长。震荡强度过高时悬浮细胞受到的机械损伤更大，引起组织增殖率下降；而震荡不充分时会导致代谢产物的局部积累，也不利于愈伤组织的增殖(刘春朝等，1998)。袁金玲等(2009)认为，当震荡强度≤100 r·min^-1时，悬浮体系通气不足，易引起孝顺竹(Bambusa multiplex)种胚愈伤组织结块、褐化；而达到120 r·min^-1时，培养物的分散性好，较适合组织的培养。麻疯树(Jatropha curcas)悬浮细胞在110 r·min^-1时能够良好生长，但高于120 r·min^-1会增加破碎细胞数量(王琼等，2012)。本研究结果表明：落叶松胚性悬浮系组织的增殖量随震荡强度的增加，呈先增加后降低的变化趋势，震荡强度为120 r·min^-1时，胚性悬浮组织的增殖量及增殖率相对较高。

适宜的继代周期是实现组织连续稳定增殖的前提。悬浮细胞的增殖生长基本遵循“S”型曲线的规律(史昆等，2014)，可以明显地划分为迟缓期、对数期及稳定期，但不同植物组织的继代周期存在很大差异(方文娟等，2005)。继代周期过短，组织的净增殖量低，不能达到快速增殖的目的；而继代不及时，组织增殖进入衰亡期，不利于组织胚性的保持。本研究发现，接种5天内，落叶松悬浮组织的增殖相对较缓慢，组织的生长处于迟缓期；此后的10天，组织的增殖进入对数期，在此期间内悬浮组织每天的增殖率高达151.30%；培养约18天时，组织可能发生轻微的褐化；而25天后，褐化的程度加深，表现出明显的衰亡期特征。综上所述，继代周期为15天时，既能获得较高的增殖量，又可较好地保持胚性状态。

针叶树的体细胞胚发生过程比较复杂，不同树种间体胚发生能力及所需条件也存在明显的差异。在含ABA 30 mg·L^-1、Gln 0.45 g·L^-1、CH 0.5 g·L^-1及蔗糖60 g·L^-1的BM培养基上，日本×长白落叶松胚性愈伤组织的体胚发生量约为3.8~9.5个·g^-1(王伟达等，2009)；长白落叶松胚性愈伤组织在含ABA 20 mg·L^-1、AgNO₃ 5 mg·L^-1、PEG₄₀₀₀ 80 g·L^-1及蔗糖60 g·L^-1的培养基上培养7周，体胚的发生量可达(179.89±20.16)个·g^-1(宋跃等，2016b)；日本落叶松胚性愈伤组织在添加ABA 15 mg·L^-1及PEG₄₀₀₀ 0.10 kg·L^-1的S培养基上，其体胚发生量为2.40~10.57个·g^-1(吕守芳等，2005)。本研究中在相同培养条件下，3个供试落叶松胚性系的体胚发生量也存在较大差异。

本研究还发现，悬浮培养获得的落叶松胚性组织经固体培养基继代和预培养后再进行成熟培养可明显地增加体胚发生量，分析其原因可能与原胚团的发育状态有关。有研究表明，在针叶树胚性培养物中，仅有处于Ⅲ期的原胚团(ESM Ⅲ)才能进一步发育形成成熟的体胚(Filonova et al., 2000)。悬浮培养时，震荡产生的机械剪切力会促进处于ESM Ⅲ阶段的细胞团分解为更小的ESM Ⅰ及ESM Ⅱ。因此，悬浮组织如果直接进行体胚成熟培养获得的体胚数量普遍较少，但经固体培养基培养一段时间后，原胚团内细胞间的结合变得更加紧密，ESM Ⅰ、Ⅱ也会陆续发育形成新的ESM Ⅲ，进而使体胚发生的情况得以改善。

悬浮培养能在短期内获得大量分散均匀、质量较高的落叶松胚性愈伤组织，且不会影响其体细胞胚的发生和成熟。在适宜的培养条件下，即以4 g·L^-1向SCM(即含有2, 4-D 0.15 mg·L^-1、6-BA 0.05 mg·L^-1、KT 0.05 mg·L^-1、蔗糖25 g·L^-1的BM培养基)中接入胚性悬浮组织，在120 r·min^-1、避光条件下培养15天后，其鲜质量可增加26.99~42.90倍。这些悬浮组织先经固体-增殖培养基(PCM，含有琼脂6 g·L^-1的SCM)继代15天后，再转入过渡培养基(TCM，含肌醇10 g·L^-1的1/4BM培养基)培养14天，最后转接到体胚成熟培养基(MCM，含有ABA 20 mg·L^-1、AgNO₃ 5 mg·L^-1、PEG₄₀₀₀ 80 g·L^-1、蔗糖60 g·L^-1的BM培养基)上培养8周，其体胚发生量显著提高，3个胚性系OO-A₁、GK-F₁及KO-H的胚性悬浮组织的体胚发生量分别为(101.69±11.19)、(93.09±9.34)及(5.78±1.47)个·g^-1。