沉香为瑞香科沉香属(Aquilaria)树木在自然生长过程中形成的由木质部组织及其分泌物共同组成的混合物质，是一种高附加值林产品(傅立国，1992)。沉香的应用具有悠久的历史，除了作为传统的香料和中药使用外，沉香雕刻品及化妆品、保健用品等一系列沉香衍生品日益占据市场，受到了林业行业、香料行业、医药行业和文化收藏界的普遍重视(林芳华等，2009；Barden et al., 2000)。目前，市场上的沉香可分为野生沉香和人工沉香2类，且野生沉香根据产区不同分为菀香系、惠安系和星洲系三大沉香系，人工沉香根据促香诱导方式不同主要分为物理法、化学法和生物法(黄俊卿等，2013；梅文莉等，2013)。然而，野生沉香资源匮乏，人工沉香的品质与野生沉香有一定差距，较高品质的人工沉香需要较长的结香时间，沉香的市场需求和供应出现矛盾；且随着沉香被逐渐认可，其价值越来越高，在利益的驱使下，市场上出现了大量的沉香伪劣品(陈晓颖等，2012；陈媛等，2017a；2017b)。因此，建立一套可靠的沉香真伪鉴别和质量评价方法具有重要意义。

传统的沉香真伪鉴别和质量评价方法主要有性状鉴别、显微鉴别、显色反应、薄层色谱、浸出物含量和GC-MS方法，2015版《中国药典》增补了高效液相色谱法控制沉香质量(陈媛等，2017b；高晓霞等，2009；杨德兰等，2014；Mei et al., 2013)。高效液相色谱法作为一种高效、高灵敏度、分析速度快的全成分分析质量评价方法，现已应用于多种生物样品的质量控制(丁婕等，2012；蒋莉娟等，2016；何新荣等，2013；杨锦玲等，2014；张倩等，2015)。据报道，2-(2-苯乙基)色酮类化合物，除沉香外，只在禾本科白茅(Imperata cylindrica)、白羊草(Bothriochloa ischaemum)和葫芦科甜瓜(Cucumis melo)种子中发现，是沉香鉴别的重要成分，且高度氧化的5, 6, 7, 8-四羟基-2-(2-苯乙基)色酮是目前仅在沉香中发现的物质，具有专属性，可作为其真伪鉴别和质量控制的标志性化合物(Naef，2011；Ibrahim，2010；Wang et al., 2006；Yoon et al., 2011)。因此，利用高效液相色谱法分析沉香的色酮类成分对于沉香真伪鉴别和质量评价具有重要意义(杨锦玲等，2014；张倩等，2015；陈媛等，2017b)。但是，野生沉香和人工沉香的化学成分及其含量差异较大，且不同产区的野生沉香、不同结香方法的人工沉香品质也有所差别，而药典液相方法主要适用于人工沉香，对野生沉香并不完全适用，容易造成误判(陈晓颖等，2012；陈媛等，2017a；黄俊卿等，2013；梅文莉等，2013；Gao et al., 2014)。为了更好地兼顾野生沉香和人工沉香的特点，本研究以29批次的参考样品和验证样品为研究对象，对《中国药典》(2015)高效液相色谱法进行改进和完善，建立既适用于野生沉香也适用于人工沉香的高效液相特征图谱，以期为沉香的科学鉴别和质量评价提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料与仪器

29批次试验样品采自沉香主产地和市场收集，经中国林业科学研究院木材工业研究所根据《中国主要木材名称》(GB/T 16734—1997)和2015版《中国药典》(GB 5009)鉴定。其中，S1~S14为参考样品，用于建立沉香高效液相特征图谱，已知野生沉香的产地和人工沉香的结香方法，包括野生沉香样品(惠安系S1~S3：老挝、越南顺化、越南岘港；莞香系S4~S6：海南、香港、海南；星洲系S7~S9：东马来西亚，印度尼西亚，东加里曼丹)和人工沉香样品(物理法S10~S11：火钻、打钉；化学法S12~S13：通体结香、吊瓶；生物法S14：菌种)；S15~S29为验证样品，用于验证沉香高效液相特征图谱，包括5批次伪品沉香(S15~S19：棱柱木、油楠、榄仁、花梨木、鸡骨木)、6批次野生沉香(S20~S25：越南、柬埔寨、海南、海南、马来西亚、印尼)和4批次人工沉香(S26~S29：打洞，通体结香，打钉、火钻)。

岛津高效液相色谱仪，包括高压二元泵、紫外检测器、柱温箱、自动进样器和工作站(日本岛津公司)；三频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；植物粉碎机(德国IKA，A11型)；万分之一天平(德国Sartorius公司，R2000型)；药典筛(北京祥宇伟业仪器设备有限公司，3号筛)。乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；甲酸(色谱纯，美国Fisher公司)；无水乙醇(分析纯，北京化工厂)；超纯水(屈臣氏)。

沉香四醇、(5S, 6R, 7R, 8S)-四羟基-2-[2-(3-羟基-4-甲氧苯基)乙基]-5, 6, 7, 8-四氢色酮、(5S, 6R, 7S, 8R)-四羟基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]-5, 6, 7, 8-四氢色酮、(5S, 6R, 7R, 8S)-四羟基-2-[2-(4-甲氧苯基)乙基]-5, 6, 7, 8-四氢色酮、(5S, 6S, 7R, 8S)-四羟基-2-[2-(4-甲氧苯基)乙基]-5, 6, 7, 8-四氢色酮对照品均为中国热带农业科学院热带生物技术研究所自制，经MS、IR、NMR、UV进行结构鉴定，HPLC归一化法测定其纯度均在97%以上。

1.2 样品溶液和对照品溶液的制备

取沉香样品粉末(过3号筛，355 μm±13 μm)0.2 g，置于具塞离心管中，精密加入95%乙醇(体积分数)10 mL，密封，称重，超声(250 W，40 kHz)处理1 h，静置放冷，再称重，用95%乙醇补足减少的质量，摇匀，静置，取上清液，过0.45 μm滤膜。

精确称取各对照品适量，加入95%乙醇(体积分数)10 mL，制成对照品溶液，过0.45 μm滤膜。

1.3 高效液相色谱分析

色谱柱为Phenomenex luna C₁₈(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，按表 1所示优化方法进行梯度洗脱，流速0.7 mL·min^-1，柱温31 ℃，检测波长252 nm，进样量10 μL。

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012.130723版(以下简称相似度评价系统)进行数据处理，设定图谱中第1个色谱为参照图谱，选取“时间窗宽度”0.2 min，中位数法，多点校正自动匹配生成沉香对照特征图谱。

2 结果与讨论 2.1 沉香高效液相特征图谱方法的建立

采用中国药典《2015》高效液相色谱法，人工沉香高效液相色谱图(S10)中特征峰分离度好，容易识别；但在野生沉香高效液相色谱图(S4)中，保留时间28~48 min峰堆积、基线漂移严重，特征峰不易识别。针对药典高效液相色谱法存在的问题，本研究对药典中保留时间19~21 min的梯度洗脱条件进行考察，将流动相A的浓度从33%分别降低到28%、25%和23%，以降低流动相的洗脱能力，改善保留时间28~48 min的基线漂移和分离度。结果发现，将流动相A的浓度降低至23%或25%，峰堆积、基线漂移现象虽然明显改善，但却导致药典方法中保留时间44 min的色谱峰与人工沉香46~ 47 min双峰的保留时间非常接近，较难辨认。为了兼顾野生沉香和人工沉香的特点，采取在保持44~47 min色谱峰的分离优势前提下，适当改变峰的堆积性。通过进一步优化色谱条件，最终确定表 1所示色谱条件。改进后的方法兼顾了野生沉香和人工沉香色谱峰的特点，主要成分分离良好，峰形稳定，改进后效果见图 1。

2.2 沉香高效液相特征图谱方法的考察 2.2.1 精密度

采用上述方法制备沉香样品溶液，按色谱条件进样分析，将所得色谱图导入相似度评价系统，并以沉香四醇特征峰为参照，计算主要色谱峰相对保留时间的RSD。结果得出色谱峰相似度均大于0.98，RSD为0.7%。主要色谱峰相对保留时间的RSD在0.07%~0.15%之间，均小于2%，说明所建高效液相特征图谱的精密度符合分析方法要求。

2.2.2 重复性

采用上述方法制备沉香样品溶液，按色谱条件进样分析，将所得色谱图导入相似度评价系统，并以沉香四醇特征峰为参照，计算主要色谱峰相对保留时间的RSD。结果得出色谱峰相似度均大于0.99，RSD为0.5%。主要色谱峰相对保留时间的RSD在0~0.09%之间，均小于2%，说明所建高效液相特征图谱重复性良好。

2.2.3 稳定性

采用上述方法制备沉香样品溶液，按色谱条件进样分析，分别于0、2、4、8、12、36和60 h各进样10 μL，将所得色谱图导入相似度评价系统，并以沉香四醇特征峰为参照，计算主要色谱峰相对保留时间的RSD。结果得出色谱峰相似度均大于0.98，RSD为0.6%。主要色谱峰相对保留时间的RSD在0.10%~0.76%之间，均小于2%，说明所建高效液相特征图谱稳定性良好。

2.3 沉香的高效液相特征图谱与共有特征峰

由图 2可知，野生沉香(S1~S9)和人工沉香(S10~S14)的HPLC图谱差异主要体现在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ”3个区域。在“Ⅰ”区域(保留时间18~28 min)内，2类沉香的主要色谱峰数量相近，但与人工沉香相比，野生沉香色谱峰的峰响应值较低；在“Ⅱ”区域(保留时间32~44 min)内，与人工沉香相比，野生沉香色谱峰较多且峰响应值均较弱；在“Ⅲ”区域(保留时间49~50 min)内，人工沉香图谱中具有2个峰响应值较高的色谱峰，且野生沉香图谱中峰响应值较低或缺少该色谱峰。因此，这2个色谱峰是人工沉香鉴别重要的色谱峰。

通过相似度评价系统可知，S1~S14批次沉香相似度在0.626~0.899之间，相似度在0.800以上的仅占28.57%，野生沉香、人工沉香品质差异较大。同时，野生沉香和人工沉香高效液相图谱中自动匹配所选的共有峰较少，且人工沉香“Ⅲ”区域内2个重要的色谱峰因不是共有峰而无法用于沉香鉴定。因此，为兼顾野生沉香和人工沉香的特点，需分别建立野生沉香和人工沉香的高效液相特征图谱。

9批次野生沉香液相特征图谱和5批次人工沉香的液相特征图谱分别见图 3、4。其中，野生沉香的相似度在0.771~ 0.866之间，相似度在0.800以上的占野生沉香的77.78%；人工沉香的相似度在0.818~0.957之间，相似度在0.800以上的占人工沉香的100%。经相似度评价系统自动匹配，野生沉香液相特征图谱选出28个共有峰，人工沉香液相特征图谱选出52个共有峰。因此，将野生沉香和人工沉香样品分开，有利于野生沉香和人工沉香特征峰的选择。

2.4 沉香高效液相特征峰的选择

由图 2、3可知，野生沉香液相特征图谱的某些共有峰分离度差，如共有峰20、21、22，而人工沉香由于化学成分含量的差异，导致某些共有峰不明显，如共有峰11、12、21，因此，以所有共有峰作为特征峰鉴定沉香可能造成误判。基于此，本研究综合分析野生沉香共有峰、人工沉香共有峰的响应值和分离度，野生沉香选定共有峰4、9、10、13、14、15、16、27为野生沉香的特征峰，人工沉香选定共有峰13、14、17、18、19、20、48、49为人工沉香的特征峰，通过与对照品HPLC图谱比对保留时间及MS/MS特征碎片，确定了部分特征峰的归属(表 2)(Yang et al., 2016)。此外，在14批次沉香色谱图中，沉香四醇特征峰(野生沉香特征峰9、人工沉香特征峰13)受色谱条件影响较小，含量较高且稳定，将其定为参照峰。以沉香四醇特征峰为参照，野生沉香的8个特征峰和人工沉香的8个特征峰相对保留时间的RSD均小于2%，具有较好的保留重现性(表 3、4)。因此，可建立沉香高效液相特征图谱，且呈现图 5中类型Ⅰ或Ⅱ所示的8个特征峰即可判定为沉香。

2.5 沉香高效液相特征峰的验证

由图 6可知，5批次伪品沉香(S15~S19)HPLC图谱在19~25 min缺少特征图谱类型Ⅰ、Ⅱ共有的6个特征峰，与特征图谱类型Ⅰ、Ⅱ均不能匹配；相反，6批次野生沉香(S20~S25)、4批次人工沉香(S26~S29)HPLC图谱在19~25 min均有特征图谱类型Ⅰ、Ⅱ中较为显著的6个特征峰；此外，6批次野生沉香在保留时间10.780、47.980 min均有色谱峰，与类型Ⅰ相匹配；4批次人工沉香在保留时间49~50 min具有2个明显的特征峰，与类型Ⅱ相匹配。15批次沉香验证结果表明，本研究所建高效液相特征图谱可有效、准确地鉴别沉香，可用于沉香的质量控制。

3 结论

本研究以29批次的参考样品和验证样品为研究对象，优化沉香高效液相色谱分离条件，对《中国药典》(2015)高效液相色谱法进行改进和完善，建立了既适用于野生沉香也适用于人工沉香的高效液相特征图谱，其精密度、稳定性和重复性良好。因野生沉香和人工沉香高效液相图谱差异较大，分别建立了高效液相特征图谱，综合色谱峰的响应值、分离度等因素，分别选定了8个特征峰，且二者8个特征峰相对保留时间的RSD均小于2%，具有较好的保留重现性。验证结果表明，所建高效液相特征图谱对15批次验证样品可以有效、准确鉴别，其中，5批次伪品沉香无法与特征图谱匹配，6批次野生沉香、4批次人工沉香验证样品均符合沉香高效液相特征图谱。因此，以29批次野生沉香和人工沉香样品建立的高效液相特征图谱，兼顾了野生沉香和人工沉香的特点，能够更全面、准确地鉴别沉香真伪，对野生沉香和人工沉香具有普适性，且符合方法学验证要求，可用于沉香的质量控制。