五倍子提取液对蓝莓采后病害和品质的影响
孙莎,
郜海燕,
熊涛,
陈杭君,
刘瑞玲,
吴伟杰
林业科学 2018, Vol. 54 Issue (6): 53-62 |
蓝莓(Vaccinicum spp.)属杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium),果实风味独特,且含有丰富的花青素、类黄酮、维生素C、叶酸、鞣花酸等多种生理活性物质(郜海燕等, 2013),具有抗衰老、降血压、抗氧化、抗癌等保健功效(Patel,2014; Alejandrodavidrodarte et al., 2008),备受消费者亲睐,具有十分广阔的市场前景。然而,蓝莓采收期高温多雨,采后极易腐烂,损失率高达20% ~50%(郜海燕, 2016)。蓝莓在储藏过程中易受到病原真菌的侵染,致使其结构、营养和生理生化反应发生急剧变化,果实品质下降,货架期缩短,严重制约了蓝莓产业的发展(Yang et al., 2014; Perkins-Veazie et al., 2008),因此做好蓝莓采后防害对减少蓝莓损失意义重大。
为了缓解蓝莓果实采后腐烂变质,在其贮运保鲜过程中常采前喷施抗菌剂、采后用二氧化氯水溶液浸泡(Moreno et al., 2007)、高压静电场处理(Chun et al., 2013)、CO2气调辐照保鲜(郜海燕等, 2013)等技术。灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)是蓝莓采后最主要的致病菌之一,果实带该菌概率高达81.85%(戴启东等, 2016),尤其是在雨天过后,湿度大的条件下,灰霉病病菌易迅速繁殖、流行(戴启东, 2011)。二氧化硫熏蒸法能有效杀死灰葡萄孢霉、青霉(Penicillium)等致腐菌,降低蓝莓采后贮运过程中灰霉病发病率(Rivera et al., 2013);Wu等(2007)研究发现二氧化氯水溶液能够有效控制蓝莓附带的酵母菌(Saccharomye)和霉菌(Moulds)。蓝莓无明显外果皮,采后果实多直接食用,使用化学保鲜剂存在着安全隐患,植物源抑菌物质以其安全、低毒、高效等特点作为化学保鲜剂的良好替代品,已成为当下研究的热点和发展趋势(Mehra et al., 2013)。
五倍子(Galla chinensis)又名文蛤、白虫仓、木附子等,是绵蚜科(Pemphigidae)昆虫角倍蚜(Malaphis chinensis)或者蛋倍蚜(Elahissinensisp)在其寄主漆树科(Anacardiaceae)植物盐肤木(Rush Chinensis)、青麸杨(Rhus potaninii)或红麸杨(Rhus punjabensis var.sinica)等树上不同部位形成的虫瘿统称。五倍子除作为中药使用外,还可作为食品添加剂,已用于面粉粉质特性的改良和啤酒稳定性的控制等(江凯, 2011)。五倍子的化学组分主要包括单宁、黄酮、有机酸、树脂、蛋白质、脂肪、淀粉、蜡质等,其中单宁类物质被认为是起抗细菌作用的主要成分(李秀萍等, 2002)。Tian等(2009a)研究表明, 五倍子单宁能有效抑制金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等致病细菌;但对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、米根霉(Rhizopus oryzae)、木霉菌(Trichoderma atroviride)等真菌却无抑制效果。研究还发现五倍子单宁除了对李斯特杆菌(Listeria monocytogenes)等细菌有抑制作用外(Tian et al., 2009b),对苹果青霉(Penicillium)等真菌也有一定抑菌效果(江凯, 2011)。但目前关于五倍子的抑菌的作用机制尚不明确,关于五倍子抑制蓝莓采后病害,尤其针对五倍子对蓝莓病原菌灰葡萄孢霉的抑制和对蓝莓自身防御系统的影响的研究还未见相关报道。本文研究五倍子提取物对灰葡萄孢霉侵染后蓝莓品质及其抗氧化系统的影响,以期揭示五倍子对蓝莓灰葡萄孢霉的抑菌机制,为蓝莓果实采后贮藏保鲜和品质提升提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料蓝莓:蓝莓品种为“莱格西”,于2016年7月3日采自浙江省杭州市安吉县“森之蓝”种植基地,蓝莓为九成熟。采摘后的蓝莓采用泡沫箱加冰袋运回实验室。挑选表面蜡质保持完好,无机械损伤,无腐烂,大小一致、九成熟的蓝莓果实,在(4±0.5)℃贮藏。
菌株:本实验室已经分离鉴定的蓝莓主要致病菌灰葡萄孢霉菌。
五倍子:购于杭州市场中优质干燥的五倍子(湖南张家界)。
试剂:无水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇均购于浙江常青化工厂,分析纯;马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)购于上海盛思生物科技有限公司。
仪器:RE-52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器);MLS-3781L-PC型高压蒸汽灭菌器(松下健康医疗器械株式会社);台式高速低温冷冻离心机(美国Thermo公司);UV-2802型紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司);LABCONCO真空冷冻干燥机(上海智诚分析仪器制造有限公司);MJX-160B-Z型霉菌培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);MIR-253型恒温培养摇床(SANYO Electric Co.Ltd.);KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超生仪器有限公司);手持自动色差计(柯盛行(杭州)仪器有限公司);Metrohm 877 Titrino plus型酸碱自动滴定仪(Metrohm Herisau Switzerland)。
1.2 试验方法 1.2.1 五倍子提取物的制备将市场购买的优质干燥五倍子经高速打粉机粉碎完全后,用75%(V/V,下同)乙醇,料液比1:15(g·mL-1)室温超声提取(功率300 W)1 h后,10 000 r·min-1,离心10 min,取上清液,备用。
1.2.2 灰葡萄孢霉活化于4 ℃下保藏的斜面试管中,挑取在葡萄孢霉菌菌丝,划线到PDA平板上,28 ℃培养5天。刮取适量菌丝于装有适量无菌水及玻璃珠的10 mL离心管中,涡旋震荡10 s,经2层无菌纱布过滤,用血球计数板将孢子悬浮液浓度稀释至1·106 CFU·mL-1(许晴晴, 2014)。
1.2.3 材料的预处理蓝莓预冷3 h后,挑选无机械损伤,果实大小和成熟度相对一致,表皮蜡质完好的蓝莓果实,分拣放在用经75%乙醇消毒的塑料盒装,然后用75%乙醇均匀地喷洒于蓝莓,紫外灯照射杀菌30 min后,取出即为对照组(CK);五倍子处理组:将紫外杀菌处理后蓝莓均匀喷洒已制备好五倍子提取液;接菌组:将紫外杀菌处理后蓝莓均匀地喷洒已制备好的孢子悬浮液(1·106 CFU·mL-1);五倍子处理接菌组:待菌液风干后将将五倍子提取液均匀地喷洒于蓝莓表面(4 mL·g-1)。每处理3个重复置于(25±0.5) ℃,相对湿度85%~90%条件下贮藏,每天(共7天)取样用于品质指标测定。每个处理随机选取50个果实取样,置于液氮中,冻样后混合分装至样品袋中,保存于-80 ℃冰箱,备用。
1.3 指标测定方法 1.3.1 失重率和腐烂率失重率采用称重法(陈杭君等,2013),用样品的初始质量与贮藏过程中每次称得质量差与样品初始质量比值;果实腐烂率(%)=病果数/总果数×100%。病果是指果实表面至少有一处发生汁液外漏、严重软化或腐烂现象。
1.3.2 可滴定酸含量(TA)和可溶性固形物(TSS)随机选取若干个蓝莓果实,用2层纱布挤汁,采用手持糖度计(ATAGO PAL-1)测定,重复5次。取蓝莓汁1 mL,稀释至100 mL,采用碱滴定法测定可滴定酸含量,重复3次。
1.3.3 花色苷含量测定蓝莓果实花色苷的提取参照Sellappan等(2002)和陈健初(2005)的方法,略有改动。花色苷总量的测定采用pH示差法,1 mL的上清液分别与4 mL的0.025 mol·L-1氯化钾缓冲液(KCl-HCl,pH1.0)和0.4 mol·L-1醋酸钠缓冲液(pH4.5)混合均匀,蒸馏水作对照,用分光光度计分别测定510 nm和700 nm(校正浑浊度)处的吸光度。
1.3.4 相对电导率测定参照曹建康等(2007)方法。
1.3.5 MDA测定参照曹建康等(2007)的方法,略作改进。取上清液0.5 mL于试管中,加入2 mL0.67%的硫代巴比妥酸溶液,(对照管加入2 mL 100 g·L-1TCA代替)混合后在沸水中煮沸20 min,取出后迅速用冷水冷却,4 ℃、10 000 r·min-1下离心20 min,分别测定上清液在450、532、600 nm下的吸光值。
1.3.6 Vc含量参考曹建康等(2007)测定方法,并稍作修改。取0.5 mL上清液于试管中,加入1.5 mL三氯乙酸,1 mL无水乙醇,0.5 mL磷酸-乙醇,1.0 mL邻菲罗啉,0.5 mL三氯化铁乙醇溶液,将其置于30 ℃下反应60 min;以蒸馏水代替蓝莓上清液为对照。根据吸光度值,在标准曲线上查出相应的混合液中Vc含量,单位为mg·100 g-1。
1.3.7采用南京建成SOD试剂盒进行测定超氧化物歧化酶的酶活性,测定方法及步骤按照试剂盒的说明书进行测定。
1.3.9 过氧化物酶(POD)活性测定参照曹建康等(2007)的方法,采用愈创木酚法测定,略有改动。反应体系包括3.0 mL 25 mmol·L-1愈创木酚溶液、0.5 mL酶提取液和200 μL 0.5 mol·L-1的H2O2溶液。以蒸馏水为空白参照,以H2O2加入时间为启动时间,每10 s记录1次反应体系在470 nm处的吸光值,连续记录1 min,重复3次。每分钟变化0.01表示1个酶活单位(U)。
1.3.10 多酚氧化酶(PPO)活性测定参照曹建康等(2007)的方法,略作改进。反应体系:2.9 mL 0.1 mol·L-1邻苯二酚、0.1 mL上清酶液,混匀。15 s内放入紫外分光光度计中测3 min内420 nm吸光度的变化,以不加底物邻苯二酚的反应液为对照,每分钟变化0.01表示1个酶活单位(U)。
1.3.11 过氧化氢酶(CAT)活性测定参照萧浪涛等(2005)的方法,略有改动。反应液体系:3 mL 0.1 mol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH7.8)、0.2 mL上清酶液、0.4 mLH2O2(0.75%)。加入反应液后迅速摇匀,立即测定其在240 nm处3 min内光吸收度值的变化。以水代替上清酶液为对照,其余不变。以240 nm处光吸收度值每分钟变化0.01表示1个酶活单位(U)。
1.3.12 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定参考于刚等(2013)的方法略作改动。反应体系:1.5 mmol·L-1抗坏血酸1 mL,0.187 5 mmol·L-1EDTA-Na 1.6 mL,1 mmol·L-1H2O2 0.3 mL和0.1 mL的酶液。以加入H2O2开始, 记录1 min内290 nm处光吸收值的变化。每分钟变化0.01表示1个酶活单位(U)。
1.4 数据分析采用SPSS19.0软件对试验数据进行统计分析,采用Duncan’s多重比较进行显著性分析(P<0.05),运用OriginPro8.5.1软件制图。
2 结果与分析 2.1 五倍子提取液对蓝莓果实品质指标的影响 2.1.1 五倍子提取液对蓝莓果实失重率、腐烂率的影响蓝莓果实水分的流失会直接引起果实质量损失和品质下降。由图 1A可知,蓝莓果实在贮藏期间均出现失水现象,并随着贮藏时间的延长,失重率逐渐升高。其中,灰葡萄孢霉接菌组的蓝莓果实失重率上升幅度最大,在贮藏7天时,灰葡萄孢霉接菌组蓝莓果实由于灰霉菌孢霉的侵染致使其失重率显著大于其他组(P<0.05),其失重率高达9.85%,这是由于蓝莓被灰葡萄孢霉侵染出现腐烂失水现象而使其失重率上升;而经五倍子提取物处理过的接菌蓝莓组果实失重率降为3.84%,说明五倍子提取物能够有效抑制灰葡萄孢霉的活性,降低蓝莓的病害,从而减少因病害带来的水分散失。
腐烂率是反映果实贮藏期间病害程度的一个重要指标。由图 1B可知,随着贮藏时间的延长,蓝莓果实腐烂率呈逐渐上升的趋势。灰葡萄孢霉接菌组蓝莓果实出现腐烂时间最早,而五倍子处理的接菌组蓝莓果实在第3天时才出现腐烂;至储藏第7天,接种灰葡萄孢霉的蓝莓组腐烂率已高达48%,而经五倍子提取物处理组腐烂率仅为13.2%。随着贮藏时间的延长,灰葡萄孢霉对果实的侵染逐渐加深,加速了果实的腐烂;而五倍子提取物对灰葡萄孢霉起到很好地抑制作用,从而延长果实的储藏期,提高了蓝莓果实的品质。
2.1.2 五倍子提取液对蓝莓果实可滴定酸(TA)和可溶性固形物(TSS)含量的影响整个贮藏过程中,果实中的有机酸作为呼吸基质会被逐渐消耗(Singh et al., 2012)。由图 2A可知,蓝莓果实可滴定酸(TA)初始含量约为0.85%,随着贮藏时间的延长,各处理组蓝莓果实的TA均呈下降趋势,而经五倍子提取物处理后,蓝莓中TA含量均高于相应对照组。
由图 2B可知,在贮藏过程中,可溶性固形物(TSS)均呈先上升后下降的趋势,说明蓝莓成熟衰老的过程中,果胶及粗纤维等的水解产物增加,一部分多糖降解变为单糖,TSS有所上升,但随着果实的衰老和病害的发生,一部分TSS被消耗,而使其含量下降。在第2天的时候由于果实后熟作用导致蓝莓的可溶性固形物上升,而在贮藏后期,由于呼吸作用和果实的病害又被消耗,导致TSS含量的下降(王翠红, 2010),且整个过程五倍子处理的蓝莓TSS含量均高于相应对照处理组,后期更为明显。五倍子处理能够使蓝莓在采后有效抵抗病菌的侵染,保持较高的果实品质。
2.1.3 五倍子提取液对蓝莓果实Vc含量的影响Vc含量是反应蓝莓果实品质的重要指标之一,由图 3可知Vc含量整体呈现先上升后下降的趋势。接菌组在贮藏时期的含量低于其他组;五倍子处理组整体变化比较平缓,后期由于果实的衰老而含量降低,五倍子处理接菌组前期含量较高于其他组,后期虽有降低但仍然高于接菌组。五倍子提取物的存在有效地抑制了灰霉菌的生长以及对蓝莓果实的侵害,减缓了蓝莓果实中Vc含量的流失。
花色苷是蓝莓重要的功能性成分,具有防止脑神经老化、强心、抗癌等药理活性(於虹等, 2006)。由图 4可知,花色苷含量在贮藏过程中呈先上升后下降的趋势,花色苷在处理后的初始值为80 mg·g-1,接菌组蓝莓的花色苷含量显著高于其他组,而经五倍子提取物处理后花色苷含量峰值的出现时间推迟。蓝莓发生病害越严重花色苷含量越高,蓝莓病变会先激发自身的防御系统而导致花色苷含量变高(李知敏, 2006)。贮藏在后期,随着果实的衰老进程,花色苷合成代谢减弱,分解代谢加快,花色苷含量逐渐降低。五倍子提取物能够有效阻止灰霉对蓝莓果实的侵染,减轻蓝莓病害。
电导率是判断植物抗逆性强弱的指标,在正常情况下,细胞膜对物质具有选择透性,当植物受到逆环境影响时,细胞膜遭到破坏,其通透性增加,从而使细胞内的电解质外渗,抑制电导率增加(陈杭君等, 2013)。由图 5A可知,4个处理组的电导率均呈逐渐上升趋势,且灰霉菌接菌组的电导率显著高于五倍子处理组,说明接菌组和对照组中蓝莓果实被病害侵染致其细胞膜破坏严重,电解质外渗导致电导率高,而经五倍子处理,这一现象会显著缓解,这表明接菌处理后再喷洒五倍子提取物可抑制灰霉生长,降低其对蓝莓果实的侵染。
MDA是膜脂过氧化的最终产物之一,通常被认为是衡量膜脂损伤严重性的一个指标(Singh et al., 2012; Li, 2014)。由图 5B可知,蓝莓贮藏过程中MDA含量变化呈不断上升的趋势。在贮藏过程中接菌组蓝莓果实的MDA变化程度相对较大,试验初期五倍子处理接菌组与五倍子处理对照组变化十分缓慢;而接菌组蓝莓MDA含量显著高于同时期的五倍子处理接菌组,即五倍子处理组蓝莓的病害较轻,蓝莓的抗逆性酶产量也相对低。由此可见,经五倍子提取物处理的蓝莓品质更佳,能较有效抑制灰霉菌对蓝莓的侵染。
2.2.3 五倍子提取液对蓝莓果实超氧阴离子(细胞病变过程中膜的破坏是由细胞中产生的自由基
POD、PPO、CAT和PAL都是果蔬重要的抗氧化相关酶,通过对
过氧化物酶(POD)能催化形成木质素,提高果实硬度,并清除过多积累的H2O2,减少腐烂现象(贺燕, 2017)。由图 7A可知,蓝莓果实在整个贮藏过程中POD的活性呈先上升后下降的趋势,这可能由于果实采后贮藏期间,活性氧代谢失衡导致H2O2的大量积累,从而诱导酶活性升高,随后过量的自由基又抑制了POD活性。蓝莓果实损伤后POD活性迅速上升,贮藏4天时,五倍子处理对照组蓝莓的POD的活性先达到最大值,是采收时的2.4倍,而喷菌组蓝莓在5天时达到酶活高峰,为采收时的1.3倍,相比初始样均差异显著。贮藏后期,POD活性均呈下降趋势,五倍子处理接菌组的下降幅度大于相应的五倍子处理组。因此,五倍子提取物的存在对蓝莓病害具有一定的抑制作用,有利于维持较高POD活性。
多酚氧化酶(PPO)能催化多种简单酚类物质氧化后进一步缩合呈褐色或黑色的聚合物,使果实发生衰老现象。由图 7B可知,蓝莓果实PPO酶活性变化基本一致,呈先上升后下降的趋势。贮藏2天后,蒸馏水处理空白组达到了酶活峰值,五倍子处理接菌组PPO酶活性迅速上升,在第3天显著高于同时期的其他组,可以看出五倍子提取液有明显的抑制灰葡萄孢霉的活性。而在未接种灰葡萄孢霉的情况下,用五倍子提取物处理蓝莓,对其PPO酶活无显著影响(P>0.05)。
蓝莓果实过氧化氢酶(CAT)活性变化如图 7C所示。蓝莓果实CAT在贮藏过程中CAT酶活性总体上呈先上升后下降的趋势。五倍子处理接菌组酶活性在贮藏第4天达到最大值,而其他试验组在第2天酶活就达到最大之后就开始下降,这可能由于五倍子提取液对灰葡萄孢霉活性起到抑制作用,而对照组蓝莓在第2天因为灰葡萄孢霉的侵染引起蓝莓自身防御系统导致CAT酶活上升。
由图 7D可知,蓝莓果实在贮藏过程中苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性呈先上升后下降的趋势,接菌组PAL酶活最先达到峰值,五倍子提取物处理接菌组蓝莓PAL活性在第3天达到酶活高峰,即蓝莓在发生病害后PAL活性先出现酶活高峰,而五倍子提取物处理使PAL酶活出峰时间推迟。
SOD是蓝莓果实后熟衰老、病变过程中的保护性酶类,它可以特异地清除超氧阴离子自由基,从而减少自由基对膜的损伤,以达到延缓细胞衰老的目的(陈杭君等, 2013)。图 7(E)看出,五倍子处理组蓝莓SOD活性与对照组存在显著差异。接菌组和对照组蓝莓SOD活性变化呈现先升高后下降趋势,在贮藏第1天时先达到SOD活性最大值,随后下降,在整个储藏过程中均高于五倍子处理组。接菌组和CK组蓝莓在贮藏过程中由于受到灰葡萄孢霉的侵染,导致活性氧代谢系统失衡,引起SOD酶活性上升。而五倍子提取物处理,显著减轻了灰葡萄孢霉对蓝莓的侵染,使蓝莓SOD活性显著降低。
3 讨论水果的采后病害按有无病原菌侵染可分为生理性病害和由病原菌侵染引起的侵染性病害(王亚萍等, 2005),蓝莓采后的病害主要为病原菌引起的侵染性病害,可通过控制病原菌生长的环境间接减少病菌的侵入和发病(刘艳等, 2000)。本试验选取了五倍子提取物喷洒蓝莓果实来减少采后蓝莓病害。蓝莓果实的腐烂率、失重率、TSS、TA以及Vc反映了蓝莓果实的贮藏品质指标,蓝莓受病原菌侵害后会导致腐烂率和失重率升高;TSS和TA的降低,使蓝莓贮藏品质降低。五倍子处理组的蓝莓品质明显高于接菌组,降低了采后病害的发生,并有利于TSS和TA的保持,提高了蓝莓采后贮藏品质。Vc含量作为蓝莓果实营养品质的评价指标之一,在贮藏过程中呈下降趋势(于继男等, 2014),接菌处理加快了蓝莓果实中Vc的分解速率,贮藏时间越长Vc含量下降越快;而五倍子提取物处理可有效保持蓝莓较高的Vc含量,但后期由于果实自身衰老出现缓慢的下降。五倍子具有抑菌效果,能够提高蓝莓采后贮藏品质,可能由于五倍子中所含有单宁(又名鞣质)低聚体能结合蛋白质形成氢键并可以进入灰葡萄孢霉菌的敏感部位从而起到抑制作用(江凯, 2011),此结果与Surawicz等(2013)和Cornely等(2012)研究结果一致,表明五倍子对真菌具有很强的抑制作用。五倍子中鞣质的含量比较高(70%左右),五倍子鞣质属于多元酚类化合物,结构比较复杂,是倍酰葡萄糖的混合物,即葡萄糖上的羟基与没食子酸所形成的脂类化合物的混合物,鞣质特殊的化学结构使五倍子特有的抗菌作用(江凯, 2013)。
蓝莓果实富含多种营养成分,尤其是有抗氧化活性的酚类物质(郜海燕等, 2013)及其氧化产物醌类可以钝化病原菌产生毒素,也是参与植物对病原菌产生生化和物理防御的植保素的合成前体(祝美云等, 2008)。本研究发现,蓝莓果实被灰葡萄孢霉菌侵染损伤后会导致MDA含量和相对电导率升高,这与陈艺辉(2012)研究的拟茎点霉(Phomopsis sp.)侵染能引起龙眼(Dimocarpus longan)果实MDA含量增加的研究结果相一致。MDA作为膜脂过氧化的终产物,能反映细胞内膜脂过氧化的程度(Li, 2014)。蓝莓果实发生病害后会导致果实内部活性氧及自由基的大量积累,膜脂发生过氧化现象,膜透性增大,从而诱导酚类物质升高,参与抗氧化减少自由基对果实的伤害。正常情况下,蓝莓果实体内抗氧化酶会清理体内产生的自由基,使自由基的代谢处于平衡状态,如果蓝莓受到外界环境或者微生物的侵染胁迫,会导致其活性氧代谢失衡,而影响蓝莓果实品质。自由基
蓝莓被灰葡萄孢霉侵染损伤会降低果实的贮藏品质并加剧果实在贮藏过程中病害的发生,导致腐烂率和失水率上升,引起电导率和MDA的升高,POD、PPO、PAL、SOD和CAT酶活性上升,而五倍子提取物能够有效的降低其腐烂率和失重率,有利于TSS、TA花色苷的保持,提高果实抗病性。五倍子提取物对蓝莓采后灰葡萄孢霉侵染具有较好的抑制作用,可用于蓝莓采后病害控制,但具体的抑菌机制仍需进一步研究。
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