根系的主要功能是吸收水分养分，促进植株地下与地上部分进行营养交换，其功能的发挥与根系形态和生理特性密切相关(孙敏红等，2015)。根系的分布特征反映了土壤中物质和能量被植物利用的可能性以及生产力，而根系在土壤中的分布特征主要表现为根系构型(root system architecture，RSA)(Lynch，1995)。根系构型既受遗传控制又受许多环境因子的调控(陈伟立等，2016)。在各影响因素中根际微生物对根系构型的影响已成为目前研究的热点(Fang et al., 2012；Chatzistathis et al., 2013)。

外生菌根是菌根真菌通过菌丝体包围并侵染树木的吸收根而形成，其菌丝体不穿透细胞组织内部，而仅在细胞壁之间延伸生长，具有不同的颜色，用肉眼容易识别(蒋盛岩等，2002)。由于菌根菌的作用，植物根部形态和颜色都可发生变化，在菌根的菌套表面可见许多外延菌丝，外延菌丝增大了植物根系的吸收面积(朱伟兴等，1991；仲崇禄等，2001)。研究证明接种黄色须腹菌(Rhizopogen luteous)、彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)和美味牛肝菌(Boletus edulis)均能增加黑松(Pinus thunbergii)的根系直径、吸收根的分布范围等根系参数(吴小芹等，2009)。干旱胁迫下，外生菌根真菌接种欧洲山毛榉(Fagus sylvatica)(Pena et al., 2013)显著增加了根尖数量和细根形成。

木霉(Trichoderma spp.)是广泛存在的土壤习居菌，是土壤微生物的重要类群，也是重要的生防菌种类。研究表明，木霉能够定殖在植物根际，促进植物生长发育，诱导并激发植物自身免疫功能(Ruano-Rosa et al., 2009)。例如绿木霉(T. virens)接种处理樟子松苗木能促进苗木生长，提高苗木质量(尹大川等，2015)。从绿色木霉分离出的木聚糖酶对烟草根系构型有影响(Kawaguchi et al., 2012)。

樟子松(Pinus sylvestris var. mongolica)是欧洲赤松(P. sylvestris)在蒙古地区的一个变种(Bending et al., 1995)，具有较强的抗寒、抗旱、耐贫瘠、较速生等优点，自20世纪50年代在辽宁省章古台地区引种成功以来，成为我国北方地区主要造林绿化树种之一(曾德慧等，2005)。辽西北地区处于科尔沁沙地南缘，生态环境十分脆弱，多年来的森林经营模式均以环境治理为主。樟子松作为该地区主要造林树种，担负着防风固沙、水土保持的重要使命。而该地区脆弱的生态环境、恶劣的生长条件给当地樟子松人工林的自然生长造成很大的影响，加之该地区常年处于干旱-半干旱环境下，年降水量450~550 mm，年蒸发量1 200~1 450 mm，且养分缺乏，因此，该地的樟子松常年处于水分和养分胁迫之中。面对生长缺水干旱等不利因素，使植物拥有分布范围广泛的根系是十分必要的。引入植物根际有益微生物(如菌根菌)是改善植物根系分布状况的方法之一，它有利于改善土壤微环境，可以有效促进苗木地上和地下部分的生长，而引入单一菌种收到的效果往往有限；因此，可以采用“益生菌复配”的方法，形成改善苗木土壤环境的“合力”。

本研究以樟子松为研究对象，通过研究单独接种褐环乳牛肝菌(Suillus luteus)、绿木霉以及2种真菌复合接种对樟子松幼苗植株生长和根系构型的影响，探讨2种真菌单独及复合作用对植物根系生长的促进效应，为改善辽西北干旱-半干旱地区樟子松生长状况提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 前期准备

供试樟子松种子由辽宁省固沙造林研究所提供。供试菌种为褐环乳牛肝菌N94和绿木霉T43，由东北林业大学森林微生物实验室提供。试验用盆为营养钵(上口径15 cm、下内径12 cm、盆高13 cm)。钵内预先装入121 ℃高温高压灭菌2 h，草炭土、蛭石和河沙按体积比2:1:1配制的混合土。2015年5月20日选取大小一致的樟子松种子进行播种，播种前用质量分数为0.5%的高锰酸钾溶液消毒30 min，无菌水冲洗数次后，用灭菌湿纱布包裹保湿，置于25 ℃人工气候箱中催芽，每天早、晚用无菌水各冲洗1次，直至出芽。

1.2 菌剂制备

用直径5 mm的无菌打孔器，切取在平板培养基上培养好的褐环乳牛肝菌N94(培养30天)、木霉菌T43(培养5天)，分别接种于盛有250 mL PD液体培养基(配方：葡萄糖20 g，马铃薯200 g，KH₂PO₄ 3 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，H₂O 1 000 mL)(邓勋等，2014)的三角瓶中，每瓶接种3片菌饼。置于摇床上(25 ℃、160 r·min^-1)振荡培养，褐环乳牛肝菌N94菌株培养30天，木霉菌T43培养5天，得到液体菌剂。使用前按照菌剂和水体积比为1:3的比例浓度，用搅碎机将菌丝体搅碎做匀浆处理，备用。

1.3 试验设计

试验设置4种处理方式：1.接种无菌PD培养基(CK)；2.单接种绿木霉(T43)；3.单接种褐环乳牛肝菌(N94)；4.复合接种，先接种褐环乳牛肝菌，30天后再接种绿木霉(N94+T43)。

待播种1周左右幼苗成活定株后，采取打孔灌根接种的方式接种褐环乳牛肝菌(20盆，其中10盆为复合接种)，每盆接种50 mL菌剂。CK施以等量无菌PD培养基。接种1个月后，进行绿木霉单接种和复合接种，每盆接种50 mL菌剂，浇透水。每个处理10个重复，每盆10株苗，共40盆，400株苗。

1.4 测定方法 1.4.1 菌根侵染率和菌根依存度

2016年5月末，从每个处理生长状态一致的苗木中选取10株(每盆1株)，测定菌根侵染率。

外生菌根侵染率采用统计计算法。将根样剪成1 cm等长的根段，随机选取根样，每样100个根段，在体视镜下观察外生菌根侵染状况，计算侵染率：

$ {\rm{菌根侵染率(\%) = }}\frac{{侵染菌根根段数}}{{总根段数}} \times 100\% $

并计算植物的菌根依赖度(relationship mycorrhizal dependency, RMD)(Plenchette et al., 1983):

$ {\rm{RMD = }}\frac{接种处理干质量 - 未接种处理干质量}{{接种处理干质量}} \times 100{\rm{。}} $

1.4.2 生长指标测定

从每个处理生长状态一致的苗木中选取10株(每盆1株)，轻轻抖掉表土，流水冲掉根部附着土，用卷尺和游标卡尺测量苗高和地径；用吸水纸吸干植株表面水分后，用电子天平称取鲜质量，80 ℃烘干至恒质量后称取干质量。

1.4.3 根系构型的测定

每个处理挖出幼苗10株，用万深LA-S植物根系分析系统对苗木根系进行扫描、分级。分析根系长度、投影面积、表面积、体积、平均直径、根尖数、分枝数、交叉数等指标。

拓扑指数(toplogical index, TI)计算公式: TI=lgA/lgM。式中：M为根系所有外部连接的总数，A为最长根系通道内部连接的总数。

分形维数计算方法采用计盒维数法，计算公式：$D = - \mathop {\lim }\limits_{\varepsilon \to 0} [\lg N(\varepsilon)/lg\varepsilon ]$。式中：D为计盒维数，ε为覆盖格子的边长(即划分尺度)；N(ε)为对应划分尺度ε对应划的非空格子数(王义琴等，1999)。

1.5 数据统计

采用SPSS 19.0统计软件进行方差分析，采用EXCEL 2013软件进行数据处理并绘图。

2 结果与分析 2.1 樟子松幼苗的菌根侵染率和菌根依赖度

单接种褐环乳牛肝菌(N94)和复合接种(N94+T43)处理的樟子松幼苗生长健壮，叶色深绿，单接种绿木霉的处理(T43)针叶颜色嫩绿，CK较纤弱，针叶颜色发暗(图 1)。樟子松幼苗菌根侵染率见图 2。接种N94和N94+T43处理组的菌根侵染率分别为64.53%和59.52%，二者无显著差异(P＜0.05)。因在开放环境下种植樟子松幼苗，所以CK和T43也有菌根形成，但菌根侵染率极低，且与N94和N94+T43差异显著(P＜0.05)。形成的菌根为棒状和二叉状2种形态(图 3)。

菌根依赖度是表征菌根真菌对宿主植物促生作用强度的重要指标，接种N94的2种处理菌根依赖度均大于50%(图 4)，但复合接种(N94+T43)的菌根依赖度最大，达到84.91%，与其他处理存在显著差异(P＜0.05)，说明复合接种在促进樟子松生长方面的作用效果好于其他处理。

2.2 樟子松幼苗生长状况

不同处理的樟子松幼苗生长指标见表 1。复合接种(N94+T43)的苗高、地径、鲜质量、干质量均与其他处理差异显著(P＜0.05)。根冠比大小依次为T43＞CK＞N94＞N94+T43。单接种(T43)增加了根冠比；单接种(N94)和复合接种(N94+T43)减少了根冠比，分别减少9.30%和13.95%。

2.3 樟子松根系生长参数

接种褐环乳牛肝菌和绿木霉后的樟子松幼苗根系生长参数见图 5。单接种和复合接种根系参数均高于CK。接种处理显著提高了根系总长度、表面积、体积、平均直径、根尖数、分叉数等幼苗根系参数。

3种接菌处理(T43、N94、N94+T43)与CK相比，根系总长度分别增加52.93%、67.33%、77.51%, 表面积分别增加53.24%、70.83%、83.84%, 根系体积分别增加66.13%、79.61%、91.06%, 平均根系直径增加10.53%、19.05%、32.00%, 根尖数分别增加65.12%、72.93%、78.27%, 分叉数分别增加72.80%、83.46%、89.77%。3种接种处理只有平均根系直径增加幅度较小，其余指标均增加50.00%以上，复合接种(N94+T43)根系生长参数增加幅度最大。

根系长度、表面积和体积是衡量植物根系分布范围的重要参数，经方差分析，接种菌剂处理与CK处理均存在显著差异(P＜0.05)，单接种和复合接种均明显扩展了樟子松根系的分布范围，增加了植株营养物质的吸收面积；经方差分析各接种处理之间只有T43与N94的单接种根系平均直径差异不显著，其余接种处理间根系各指标均存在显著差异(P＜0.05)。平均根系直径、根尖数、分叉数是衡量根系吸收功效的重要参数，接种菌剂处理与CK处理也存在显著性差异，接种N94和T43可能通过改变樟子松幼苗根尖的发生模式和发育过程，来改善幼苗根系的吸收功能。

2.4 樟子松根系拓扑指数和分形维数

拓扑指数可以反映植物根系分枝模式的偏向(Tsakaldimi et al., 2009)，拓扑指数越接近1，根系越接近鱼尾形分枝；拓扑指数越接近0.5，根系越接近叉状分枝(Fitter，1986)。CK、T43、N94、N94+T43处理樟子松苗木根系拓扑指数均接近于1(表 2)，表明根系为典型的鱼尾形分枝(图 6)。说明无论是单接种还是复合接种褐环乳牛肝菌和绿木霉均未改变樟子松幼苗根系的分枝模式。

用盒维数法计算出不同处理的樟子松幼苗根系分形维数(表 2)。不同处理樟子松根系分形维数大小依次为N94+T43＞N94＞T43＞CK。经方差分析，接种菌剂处理的根系分形维数与CK具有显著性差异(P＜0.05)。该结果说明单接种(T43、N94)和复合接种(N94+T43)延展了樟子松幼苗根系分枝层次，与CK相比根系分枝多，其中复合接种分形维数最大，说明复合接种处理根系分枝层次最多。

3 讨论

单接种绿木霉、褐环乳牛肝菌和复合接种均能显著提高樟子松幼苗苗高、地径、鲜质量和干质量等生长指标，表明接种菌剂均具有培育壮苗的效果，其中复合接种效果最为显著。这与厚环乳牛肝菌(Suillus grevillei)与绿木霉复合接种樟子松(尹大川等，2014)及褐环乳牛肝菌与绿木霉复合接种红皮云杉(Picea koraiensis) (宋小双等，2015)的研究结果相同。樟子松是典型的外生菌根依赖树种，因此，菌根依赖度即是菌根真菌对宿主植物促生作用强度的重要指标。本研究中复合接种的菌根依赖度最大达到84.91%，显著高于单接种处理。复合接种的菌根侵染率虽然低于单接种褐环乳牛肝菌，但差异不显著，说明褐环乳牛肝菌与绿木霉在樟子松根际的养分和空间需求上存在一定的相互竞争，但先接种褐环乳牛肝菌占领生态位后，再接种绿木霉菌可以协同发挥2种益生菌的作用。

根冠比在植物的栽培中，意义重大。当根系的吸收能力大于地上部分的消耗能力时，植物就会加强地上部分的生长。在植物长势最好的时候，应当降低根冠比，以保证植物的地上部分快速生长，而不是浪费在根系的生长上。本研究中单接种褐环乳牛肝菌和复合接种在生长季降低了根冠比，表明此阶段植物根系吸收能力强，对植物地上部分生长的促进作用好于其他处理。

单接种绿木霉、褐环乳牛肝菌和复合接种均增加了樟子松根系总长度、表面积、体积、平均直径、根尖数、分叉数等根系构型参数。这与褐环乳牛肝菌对马尾松(Pinus massoniana)根系构型的促进作用(翟帅帅等，2016)和干旱胁迫下接种菌根真菌对滇柏(Cupressus duclouxiana)根系平均直径、根系总长度等的影响研究结果一致(王如岩等，2012)，但本研究中以复合接种处理的效果最明显，与单接种均具有显著差异(P＜0.05)。生长参数的提高与根外菌丝参与作用有关，同时与接种真菌后改善了樟子松根系构型相关，根系构型的改善能够帮助植物从土壤中吸收更多的矿质营养和水分(吴强盛等，2014)。根系长度、表面积、体积等这些常规根系参数只能反映根系的生长状况，难以反映根系的分枝延伸状态，难以表征根系空间分布的变化。因此，本研究同时利用拓扑指数和分形维数弥补了常规方法的不足。前人提出根系拓扑结构的2种极端类型即鱼尾形分枝和叉状分枝模式(Bouma et al., 2001；Fiter et al., 1991)，可以用拓扑指数表示。一般情况下根系鱼尾形分枝的次级分枝较少，重叠较少，内部竞争较小，在单位碳投入下，可以吸收更多的营养，因此，鱼尾形分枝更加适合于营养贫瘠的环境(单立山等，2013；Fitter et al., 1991)。本研究中4种处理的樟子松幼苗根系拓扑指数均接近于1，无论是单接种还是复合接种均未改变苗木根系分枝模式，根系分根模式接近鱼尾形分根。所以樟子松适宜在辽西北干旱贫瘠的土壤条件下生存。分形维数表征植物根系发育的差异(杨培岭等，1999；汪洪等，2008)，可以从整体上对根系结构的复杂程度和根系分枝习性进行定量描述(闫丽娟等，2014)。分形维数越小，根系空间结构以及根系分枝越简单，反之越复杂(陈吉虎等，2006)。复合接种分形维数最高，说明复合接种处理增加了根系分枝和细根数量，根系最发达。与其他处理相比较，复合接种处理的樟子松根系常规生长参数最大，为鱼尾形分枝，分形维数最高，所以该处理方式更有利于樟子松在辽西北地区环境条件下生长。

复合接种通过降低根冠比和增加根系总长度、表面积、拓扑指数、分形维数等根系指标，增强了根系的吸收能力、扩大了吸收面积，起到促进植株地上部分生长的作用，从而提高了樟子松幼苗苗高、地径、鲜质量、干质量等植株生长指标，达到地上部分和地下部分的协调生长，增大地下部分的吸收面积，进而促进整个植株对养分水分的吸收利用。由根冠比及其他研究指标可见复合接种中对根系构型调控中起主要作用的是褐环乳牛肝菌，通过单接种绿木霉可见绿木霉只是起到生物肥料促进植物生长的作用。

树木根系研究方法包括传统方法和原位无损观测方法(李子敬等，2015)，本研究中选用传统方法中的容器法，虽然存在诸多优点，但由于容器限制，会抑制或影响根系生长，从而致使观测数据与实际情况不符。本研究中单接种褐环乳牛肝菌和复合接种降低了樟子松的根冠比，可能是接种褐环乳牛肝菌2种处理的樟子松根系吸收能力大于地上部分的消耗能力，地上部分的生长增强，也有可能是容器限制了根系生长，这还需要今后利用苗圃等野外试验条件进一步验证。分形维数与董春胜等(2014)计算的2年生樟子松根系分形维数结果稍有出入，这可能就是因为本研究中选用的樟子松是盆栽苗，而董春胜选用的2年生樟子松为在自然状态条件下生长。但本研究中复合接种的樟子松根系分形维数与董春胜的3年生根系分形维数接近，还是证明复合接种处理对樟子松根系的分枝具有促进作用，可以使2年生幼苗根系分枝达到3年生状态。

尽管根系构型的研究已经较广泛，但由于研究条件等的限制，相比较地上部分功能形状的研究仍相对滞后(苗原等，2013)。植物、微生物和土壤相互作用、相互影响，微生物作用于植物根系，影响根系构型，根系构型的改变又影响土壤微生物群落的构成和分布，同时对土壤的理化性质等产生影响。土壤理化性质的改变对植物的生长发育也会产生重要的影响(陈伟立等，2016)。本研究发现单接种褐环乳牛肝菌、绿木霉和复合接种2种真菌均能调控樟子松根系构型。但微生物对植物调控的机制、对根际原有微生物群落的影响以及对土壤性质的改变作用尚不清楚，今后仍需进一步研究。

4 结论

褐环乳牛肝菌和绿木霉2种真菌分别单接种和复合接种樟子松幼苗均可促进幼苗生长，其中复合接种的菌根依存度最大，降低了根冠比，提高了幼苗的苗高、地径、干质量、鲜质量，促进樟子松幼苗生长的作用显著；3种接种处理方式均能调控樟子松根系构型，其中复合接种显著增加了樟子松根系总长度、表面积、体积、平均直径、根尖数、分叉数等根系参数，与其他处理差异显著(P＜0.05)。不同处理均未改变樟子松根系的鱼尾形分枝模式，但复合接种根系分形维数最大。表明复合接种对樟子松根系构型的改变作用大于单接种和不接种的CK处理方式，可为今后研究利用益生菌复配有效促进苗木地上和地下部分的生长提供理论基础。