林业科学  2018, Vol. 54 Issue (5): 36-47   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20180505
0

文章信息

于姣妲, 夏丽丹, 殷丹阳, 周垂帆
Yu Jiaoda, Xia Lidan, Yin Danyang, Zhou Chuifan
磷素对杉木幼苗耐铝性的影响机制
Effects of Phosphorus on Aluminum Tolerance of Chinese Fir Seedlings
林业科学, 2018, 54(5): 36-47.
Scientia Silvae Sinicae, 2018, 54(5): 36-47.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20180505

文章历史

收稿日期:2017-06-09
修回日期:2017-08-31

作者相关文章

于姣妲
夏丽丹
殷丹阳
周垂帆

磷素对杉木幼苗耐铝性的影响机制
于姣妲, 夏丽丹, 殷丹阳, 周垂帆     
福建农林大学林学院 南方红壤区水土保持国家林业局重点实验室 福州 350002
摘要:【目的】在南方酸性红壤中,低磷和铝毒是制约杉木人工林产量的重要因子。通过研究不同磷水平处理下,铝胁迫对杉木幼苗生理生化指标的影响规律,从而为阐明杉木适应自然环境中低磷富铝土壤机制提供基础数据,为我国酸性土壤杉木人工林的可持续经营和生产管理提供科学依据。【方法】设置0,0.16,0.32 mmol·L-1 3个浓度梯度的预培养,并在Al3+(0.1 mmol·L-1)和无Al3+(0 mmol·L-1)的环境中进行模拟胁迫试验,分析不同供磷处理下铝胁迫对杉木幼苗的抗氧化酶活性等生理指标、元素吸收、根系各元素亚细胞分布规律以及透射电镜-X-射线能谱(TEM-EDS)下Al在各细胞器的分布的影响机制。【结果】Al3+导致杉木幼苗体内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)等生理指标异常,随着供磷程度的增加,上述生理异常现象均得到有效的缓解。此外,随着供磷水平的增加,杉木幼苗根系中Al含量显著降低,而K、Mg、Zn和P的含量明显增加,叶片中Al、Mg、Ca和K的含量显著上升。TEM-EDS分析发现杉木幼苗根系细胞壁是铝聚集的主要场所,磷素能够促使铝向液泡转运,并在液泡当中沉积为黑色不溶颗粒。对根系亚细胞进一步分析发现,Al和P主要分布在杉木幼苗根系的细胞壁组分中,随着供磷水平的增加,根系细胞壁组分中的Al和P比例显著下降,而在可溶组分中显著增加,这说明P与Al同时向液泡转运,此外,K和Mg也出现类似的规律。【结论】铝胁迫对杉木幼苗根系的毒害作用较大,磷素的增加主要通过改变杉木幼苗细胞内抗氧化酶活性以及Ca、K、Mg和Zn的吸收和转运,并增加Al向液泡转运,降低Al在杉木根系细胞壁组分中的富集,以维持根系细胞壁的正常结构和功能,从而缓解Al对杉木幼苗造成的膜脂过氧化作用,降低Al对杉木幼苗的损伤。
关键词:杉木    低磷    铝毒    抗氧化酶    养分吸收    透射电镜-X-射线能谱    亚细胞分布    
Effects of Phosphorus on Aluminum Tolerance of Chinese Fir Seedlings
Yu Jiaoda, Xia Lidan, Yin Danyang, Zhou Chuifan    
Key Laboratory of Soil and Water Conservation in South China Red Soil Region of State Forestry Administration College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University Fuzhou 350002
Abstract: 【Objective】Low phosphorus and aluminum toxicity is an important limiting factor in the productivity of Chinese fir (Cunninghamia lanceolata) plantation in southern China. Effects of phosphorus on physiological and biochemical indicators of Chinese fir seedlings under aluminum stress were studied in order to provide a scientific basis for sustainable management of Chinese fir plantation in acid soil, and to improve the productivity of plantation.【Method】We studied the effects of low phosphorus and aluminum stress on the physiological indicators of Chinese fir seedlings, the mechanism of low phosphorus aluminum stress on nutrient absorption, the subcellular distribution of elements, and the distribution of Al in the organelle of Chinese fir seedling roots was assessed through Transmission Electron Microscope and Energy Dispersive X-ray Spectroscopy (TEM-EDS) by setting different concentrations of phosphorus and aluminum in Hoagland nutrient solution.【Result】Al3+ resulted in abnormalities of the physiological indicators, such as superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT) and malondialdehyde (MDA) in Chinese fir seedlings. With the increase of phosphorus concentration, the above physiological abnormalities have been effectively alleviated. In addition, with the increase of phosphorus concentration, the content of Al decreased significantly in the roots, while the contents of K, Mg, Zn and P increased significantly. The contents of Al, Mg, Ca and K in leaves were also increased. It was found that the cell wall of the roots were the main sites of aluminum accumulation by TEM-EDS, and phosphorus could promote aluminum to transport to the vacuoles and deposit it as black insoluble particles in the vacuoles. Further analysis of subcellular fractions revealed that Al and P were mainly distributed in cell wall component of the roots of Chinese fir seedlings. With the increase of phosphorus concentration, the ratio of Al and P in the root cell wall fraction decreased significantly, but increased significantly in the soluble fraction, indicating that phosphorus and aluminum were transported to the vacuole at the same time. The content of K and Mg have a similar pattern to Al and P.【Conclusion】These result demonstrate that, under the aluminum stress, the roots of Chinese fir seedlings were seriously poisoned. The increase of phosphorus changed the activity of antioxidant enzymes, changed the absorption and transport of Ca, K, Mg and Zn, increased the transport of Al to vacuole, and reduced the enrichment of Al in the cell wall of root of Chinese fir. They were the reason for that Chinese fir seedlings maintained the normal structure and function of the root cell wall, alleviated the lipid peroxidation, and reduced the damage of aluminum to Chinese fir seedlings under the aluminum stress.
Key words: Cunninghamia lanceolata    low phosphorus    aluminum toxicity    antioxidase    nutrient absorption    Transmission Electron Microscope and Energy Dispersive X-ray Spectroscopy (TEM-EDS)    subcellular distribution    

杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国重要的速生造林树种,主要分布在南方红壤区。南方高温多雨,土壤风化强烈,严重的淋溶作用导致红壤富铝和缺磷,成为制约杉木人工林生长的主要限制性因子,阻碍了我国南方林业的可持续发展。铝是土壤中含量最多的金属元素,多以有机络合态、无机离子态、无机化合物、难溶态、聚合态等多种形式存在,其中以无机离子态对植物根系的毒害作用最大,而其他形态的铝毒性较小(Delhaize et al., 1993)。在非酸性土壤中铝以对植物无害的难溶态存在,随着土壤pH的降低,铝以对大部分植物有毒害的可溶性A13+形式存在。研究表明,在植物的生长过程中,A13+首先是对植物根尖部分的损害(许小丽, 2016),引起一系列抗氧化酶应答,如黑麦(Secale cereale)在有铝环境中其根尖的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性升高,丙二醛(MDA)含量增加(向万胜等, 2004);桉树(Eucalyptus)幼苗生长在有铝环境中时,植株体内的POD和CAT 2种抗氧化酶的活性先升高后下降(杨振德等, 1996),即抗氧化酶活性等生理指标的响应可作为评估铝毒的重要生物标记物。其次,A13+还能够通过阻碍植物根尖细胞上的K+、Mg2+和Ca2+通道,降低植物茎叶中铁浓度,与Cu2+竞争植物根系表面同一结合位点,最终影响植物对Ca、Mg、P、N等营养物质的吸收,对植物正常代谢的维持以及根系的生长产生阻碍,进而在一定程度上影响植物根尖细胞结构和功能的稳定性,最终导致植物生产力衰退(仝雅娜等, 2008; 沈宏等, 2001; Kinraide et al., 2004; Samac et al., 2003; Liu et al., 2001; Kiegle et al., 2000; Pan et al., 1989; Pineros et al., 2001)。

磷是植物生长发育过程中所必需的矿质营养元素之一,以多种途径参与植物的各种生命活动,对植物的生长发育具有重要意义。除此之外,不同水平的磷还能诱导激活植物自身多种抗铝机制,但是这些机制目前还不够明确。有研究认为低磷能够增加植物对铝的抗性,如Maejima等(2014)的研究发现,缺磷处理能增强水稻(Oryza sativa)对铝的耐受性;相反的是,有些研究指出,低磷和铝毒对植物的生长抑制呈正协同效应,低磷影响植物抗铝性的发挥,高磷能够缓解铝对植物的毒害(郭天荣等, 2013; 黄文方等, 2013; 孙红英, 2010)。造成这种差异可能跟植物种类不同有密切关系。以上这些研究,多聚焦在农作物为主的草本植物(Maejima et al., 2014; 俞慧娜等, 2007),而对于南方有重要生态和经济价值的树种杉木则研究较少,不同供磷水平影响下铝对杉木有何种影响,研究尚不够全面和深入,缺乏更深层次的探讨,其理论体系还不够完善,而明确铝对杉木的毒害和磷对其的影响机制,对酸性土壤杉木人工林生产力的维护具有重要意义。

鉴于此,本试验选用杉木幼苗,通过水培试验,研究不同磷水平处理下,铝胁迫对杉木幼苗各种抗氧化酶等生理指标变化的影响,分析磷对铝胁迫下杉木幼苗的铝累积特性和养分吸收的影响,揭示杉木幼苗根系亚细胞组分元素分布情况,采用透射电子显微镜和能谱分析(TEM-EDS)观察Al在各细胞器的分布和对细胞的损伤情况,从而探讨杉木幼苗适应低磷和铝胁迫的机制,在一定程度上能为阐明杉木适应自然环境中低磷、富铝土壤的机制提供基础数据,为我国酸性土壤杉木人工林的可持续经营和生产管理提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验设计

将福建省漳平五一国有林场的1.5代杉木种子园精选的种子经过浸泡消毒后移至培养皿中,待胚芽露出后播种到营养土中并放置在培养箱(型号:MGC-450HP-2;光照强度:20 000 lx)内培养6个月后,于2017年3月选择生长均一的杉木苗(高度约为10.5 cm、根长约为18 cm)用清水洗干净,再用纯水清洗后,移植到装有550 mL纯水的盆钵中并放到培养箱中培养2天,再用完全Hoagland培养液在盆钵中培养3天。培养期间昼/夜温度为25 ℃/22 ℃,光照时间14 h。预培养5天后,参照邹显花等(2016)的研究方法,设0 P(0 mmol·L-1),1/2 P(0.16 mmol·L-1),P(0.32 mmol·L-1)3个浓度梯度,其中磷浓度主要是依据满足杉木人工林正常生长的土壤有效磷较高水平设置。磷由KH2PO4提供,用KCl平衡不同供磷处理间K+ 的差异。每个盆钵分别添加不同磷处理浓度的营养液550 mL进行培养,每盆5株幼苗,每2天更换1次营养液,每个处理5盆,共75株苗,处理期间营养液pH维持在4.5左右,培养21天。在磷预处理之后,参照Maejima等(2014)的研究方法将幼苗浸入纯水(pH 4.9)中过夜以去除根系之间的P,然后再取每个磷浓度处理的幼苗3盆转移到含Al3+(0.1 mmol·L-1)的0.5 mmol·L-1 CaCl2溶液中,将另外2盆转移到不含Al3+的0.5 mmol·L-1 CaCl2溶液中,处理期间溶液pH维持在4.5左右,培养1周。

1.2 抗氧化酶以及MDA含量测定

将处理后的杉木幼苗洗净吸干,分别称取其叶片和根系各0.2 g,加0.05 mol·L-1 pH7.8的磷酸缓冲液4 mL于冰浴中的研钵内研磨成匀浆,于4 ℃下10 000 r·min-1冷冻离心20 min,上清液即为待测酶液。

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑法(孙红英, 2010; 杨梅, 2007);过氧化氢酶(CAT)活性测定采用紫外吸收法(孙红英, 2010);过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法(孙红英, 2010);丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法(孙红英, 2010)。

1.3 质膜完整性测定

质膜完整性检验采用Evans blue染色的方法(Wang et al., 2005),将处理后的植物根系(2 cm)在0.5 mmol·L-1冷冻的CaCl2(pH4.5)溶液中浸泡5 min后,洗净吸干,将根浸泡在4 mL 0.025%的伊文斯蓝溶液(伊文斯蓝溶于0.1 mmol·L-1 pH5.6的CaCl2溶液)中30 min,取出后反复用纯水冲洗,然后在纯水中浸泡15 min,再在光学显微镜下观察拍照,以测定原生质膜的完整性。

1.4 苏木精染色

参照Maejima等(2014)的研究方法,配制0.2%的苏木精并加0.02%NaIO3在溶液中,然后加入1滴0.1 mol·L-1 NaOH。杉木幼苗经Al处理后,用纯水冲洗,室温下将杉木根系放入装有上述苏木精溶液的培养皿中浸泡40 min,中间间断摇动溶液,以便染色均匀。然后放入纯水中以去掉过量的苏木精,每次浸泡10 min,冲洗2~3次后,在体视显微镜(Olympus-SZX7)下观察并拍照。

1.5 杉木幼苗Al和养分含量测定

将杉木幼苗分根和叶用105 ℃杀青后用80 ℃烘干至恒重,参照罗洁文等(2016)的方法采用HNO3-HClO4消煮,然后用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定植物Al、Ca、Fe、Mg、Mn、K、P、Zn含量。波长范围为160~800 nm波长连续覆盖。

1.6 TEM-EDS样品的制备和观察

将经Al处理后的杉木幼苗根系用纯水将其表面冲洗干净,用锋利刀片取完整根系中段2~3 cm,将切好的材料参照黄玫英等(2016)的方法制备透射电镜-X-射线能谱(TEM-EDS)样品进行观察。

1.7 亚细胞组分各元素分布的测定

参考罗洁文等(2016)的方法,采用差速离心法分离不同的细胞组分:准确称取鲜样0.2 g,加入20 mL提取液[0.25 mol·L-1蔗糖+ 50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH7.5)+ 1 mmol·L-1二硫赤鲜糖醇],液氮研磨匀浆。匀浆液在冷冻离心机300 r·min-1下离心1 min,沉淀为细胞壁组分(F1);上清液在2 000 r·min-1下离心15 min,沉淀为细胞核组分(F2);上清液在10 000 r·min-1下离心20 min,沉淀为线粒体组分(F3);上清液为以液泡为主的含核糖体的可溶组分(F4)。全部操作在4 ℃下进行。各组分参照1.5节中的方法进行消解,定容至10 mL后测定Al、Ca、Fe、K、Mg、Mn、P、Zn含量。

1.8 数据处理

采用多元统计分析软件SPSS 19.0进行单因素方差分析、双因素方差分析和多重比较,采用Duncan法对处理间数据进行差异显著性分析。采用Pearson相关系数分析各指标间的相关性。图表中数据均为平均值±标准差,采用Origin 9.0对试验数据进行绘图。

2 结果与分析 2.1 磷对Al3+胁迫下杉木幼苗抗氧化酶活性及MDA含量的影响

图 1可以看出,在Al3+胁迫条件下,随着供磷程度的增加,杉木幼苗根系的CAT、POD活性增加,SOD活性总体呈现出降低的趋势;在无Al3+环境中,CAT、POD和SOD的活性均呈先升高后降低的趋势,说明一定程度的供磷能缓解Al3+对杉木根系的毒害作用。

图 1 磷对Al3+胁迫下杉木幼苗抗氧化酶活性及MDA含量的影响 Figure 1 Effect of phosphorus on antioxidase activity and MDA content in Chinese fir seedlings under aluminum stress a、b、c表示杉木幼苗根系中各处理间差异显著,a′、b′、c′表示叶片中各处理间差异显著(P < 0.05)。0P+Al、1/2P+Al、P+Al表示磷浓度分别为0, 0.16, 0.32 mmol·L-1, Al3+浓度均为0.1 mmol·L-1;0P-Al、1/2P-Al、P-Al表示磷浓度分别为0,0.16,0.32 mmol·L-1,Al3+浓度均为0 mmol·L-1。下同。 a, b, and c indicate significant differences in roots, a′, b′, and c′ indicate significant differences in leaves at P < 0.05 level. 0P + Al, 1/2P+Al and P+Al indicate that the concentration of phosphorus is 0, 0.16, 0.32 mmol·L-1 and the concentration of Al3+ is 0.1 mmol·L-1; 0P-Al, 1/2P-Al and P-Al indicate that the concentration of phosphorus is 0, 0.16, 0.32 mmol·L-1 and the concentration of Al3+ is 0 mmol·L-1. The same below.

杉木幼苗在有Al3+环境(图 1)中,随着供磷浓度的增加,其叶片内的POD和SOD活性呈下降趋势,1/2 P(0.16 mmol·L-1)处理比无磷处理的SOD活性明显降低了18.18%(P < 0.05),而CAT活性先降低后升高,P(0.32 mmol·L-1)处理比1/2 P(0.16 mmol·L-1)处理显著增加了326.78%(P < 0.05);在无Al3+环境中,随着供磷程度的增加,CAT活性先升高后降低,SOD活性则相反,而POD活性呈现出降低的趋势,说明磷素能缓解铝对杉木幼苗叶片的损伤,随着磷浓度的增加,杉木幼苗受到的胁迫减轻,引起的过氧化酶系统的反应变小。

Al3+胁迫下(图 1d),随着供磷程度的增加,杉木苗根系和叶片内的MDA含量均下降,说明磷能够降低铝引起的杉木苗植株细胞脂质过氧化,即磷能够保护植株细胞生物膜的结构与功能。

2.2 磷对Al3+胁迫下杉木幼苗根系质膜完整性以及根系损伤情况的影响

伊文斯蓝染色主要是用于评价细胞膜系统的完整性或通透性。如图 2a所示,在Al3+胁迫,当供磷浓度为0.32 mmol·L-1时,根尖染色不明显,但是随着供磷程度降低,根尖明显染色,说明根尖质膜受到明显损伤,同时也表明磷素能缓解Al3+对杉木苗根尖的毒害作用,有效阻止其破坏杉木苗根系的质膜完整性。

图 2 磷对Al3+胁迫下杉木幼苗根系质膜完整性(a)以及根系损伤(b)情况的影响 Figure 2 Effect of phosphorus on membrane integrity (a) and damage (b) in the roots of Chinese fir seedlings under aluminum stress

苏木精染色法是一种用于鉴定植物根系受Al3+的毒害而被损伤的简易方法。由图 2b可知,在全磷处理下,杉木幼苗的根尖染色较低磷处理和无磷处理浅,其中在无磷处理下其根尖颜色最深,表明在无磷处理下Al3+对杉木幼苗造成的毒害作用最大,同时说明磷素在一定程度上能缓解Al3+对杉木幼苗根尖的毒害。

2.3 磷对Al3+胁迫下杉木幼苗Al和养分吸收的影响

图 3所示,在添加0.1 mmol·L-1 Al3+的处理下,随着供磷程度的增加,杉木幼苗根系中Al含量呈现出降低的趋势,说明磷素增加能够降低杉木根系对铝的富集。在0.1 mmol·L-1 Al3+处理下,随着供磷程度的增加,杉木幼苗根系中K、Mg、Zn和P的含量增加,P(0.32 mmol·L-1)处理与无磷处理相比,P含量明显增加了31.07%(P < 0.05),Zn显著增加了67.80%(P < 0.05)。Al3+胁迫下,叶片中的Al、Mg、Ca和K含量随着供磷程度的增加而增加。

图 3 磷对Al3+胁迫下杉木幼苗Al和养分吸收的影响 Figure 3 Effects of phosphorus on contents of aluminum and nutrient in Chinese fir seedlings under aluminum stress

在无Al3+处理的情况下(图 3),随着供磷程度的增加,根系中K、Zn和P的含量与有Al3+处理呈现出相反的趋势;且根系中Al含量随之升高,叶片中Al反而降低,说明磷促使了叶片中的铝转移到根系当中。此外,无磷处理的Fe要显著高于有磷处理,而Ca、K、P含量则呈现相反的趋势。

2.4 铝和磷浓度与杉木幼苗根系、叶片各养分含量之间的相关性分析

对铝浓度、磷浓度及杉木幼苗根系各养分含量之间的相关性进行Pearson相关分析(表 1),得出:K和Al、Ca含量之间存在显著的负相关关系(r=-0.867,P < 0.05;r=-0.839,P < 0.05),Mg和Ca含量之间存在显著的负相关关系(r=-0.880,P < 0.05)。

表 1 铝和磷浓度与杉木幼苗根系各元素含量之间的相关性分析 Tab.1 Correlation coefficients between aluminum/phosphorus concentration and Chinese fir seedlings root element contents

对铝浓度、磷浓度及杉木幼苗叶片各养分含量之间的相关性进行Pearson相关分析(表 2),得出:Ca、K、Mn和铝浓度之间存在极显著的负相关关系(r=-0.953,P < 0.01;r=-0.962,P < 0.01;r=-0.920,P < 0.01),Fe和磷浓度之间存在显著的负相关关系(r=-0.872,P < 0.05),K和Ca之间存在极显著的正相关关系(r=0.978,P < 0.01),Mn和Ca、K之间存在显著的正相关关系(r=0.873,P < 0.05;r=0.861,P < 0.05)。

表 2 铝和磷浓度与杉木幼苗叶片各元素含量之间的相关性分析 Tab.2 Correlation coefficients between aluminum/phosphorus concentration and Chinese fir seedlings leaf element contents
2.5 铝在杉木幼苗根系亚细胞中累积部位的TEM-EDS分析

在供磷情况下,Al3+胁迫使得杉木幼苗根系细胞中细胞壁和液泡当中存在许多沉积的深色颗粒,而在没有供磷的情况下,细胞中则没有深色颗粒沉积(图 4),结合EDS分析(图 5),可能是由于大量铝在此沉积。无磷处理下,液泡内并没有观察到铝的存在,而有磷处理条件下,铝在液泡当中聚集为黑色颗粒,这说明磷促进了铝向液泡转运。

图 4 0P+Al和P+Al处理下杉木幼苗根系细胞的超微结构 Figure 4 Ultrastructure of Chinese fir seedlings root cells treated with 0P+Al and P+Al CW:细胞壁 Cell wall;NU:细胞核 Nucleus;V:液泡 Vacuole;IS:细胞间隙 Intercellular space;M:线粒体 Mitochondria;ER:内质网 Endoplasmic reticulum; SG:淀粉粒 Starch granules;Al:铝 Aluminum.
a和b是0P+Al处理下的根尖细胞,c和d是P+Al处理下的根尖细胞。a and b are cells in root of Chinese fir seedlings under 0P+Al treatment,c and d are cells in root of Chinese fir seedlings under P+Al treatment.
图 5 0P+Al和P+Al处理下杉木幼苗根系细胞能谱分析 Figure 5 Energy Dispersive X-ray Spectroscopy (EDS) of Chinese fir seedlings root cells treated with 0P+Al and P+Al 图 5a图 4a中圈内液泡的能谱分析,图 5b图 4b中圈内细胞壁的能谱分析,图 5c图 4c中圈内液泡的能谱分析,图 5d图 4d中圈内细胞壁的能谱分析。 Results of EDS in the Fig. 5a indicate the vacuole in the white circle in the Fig. 4a, results of EDS in the Fig. 5b indicate the cell wall in the white circle in the Fig. 4b, results of EDS in the Fig. 5c indicate the vacuole in the white circle in the Fig. 4c, and results of EDS in the Fig. 5d indicate the cell wall in the white circle in the Fig. 4d.
2.6 磷对Al3+胁迫下杉木幼苗根系铝及养分元素亚细胞组分分布的影响

表 3可以看出,在不同浓度的磷处理下,Al和P在杉木幼苗根系的细胞壁组分(F1)中含量最高,其中Al占53.09%~62.43%,P占44.51%~58.55%,在线粒体组分(F3)中分布最少,说明Al和P在杉木幼苗根系内的主要分布位点是细胞壁,可能是由于细胞壁对Al和P的滞留作用强,而使得其在线粒体内分布较少。随着供磷程度的增加,Al和P在细胞壁组分(F1)中富集呈下降的趋势,Al在细胞核组分(F2)中的富集减少,在线粒体组分(F3)和可溶组分(F4)中的富集均增加;P在细胞核组分(F2)中呈上升的趋势,在线粒体组分(F3)中先增加后降低,在以液泡为主的可溶性组分(F4)中则相反。随着供磷程度的增加,Ca在细胞壁组分(F1)中的富集由43.10%下降至35.64%,在线粒体组分(F3)中由10.42%增加至17.02%。K和Mg在细胞壁组分(F1)和细胞核组分(F2)中随着供磷水平的增加而下降,在可溶组分(F4)中呈现出增加的趋势。上述研究结果表明,铝胁迫使得杉木幼苗根系能将大部分养分元素和Al吸附在细胞壁上,随着供磷水平的增加,杉木幼苗根系对养分元素和Al的吸收具有一定的动态变化。

表 3 磷对Al3+胁迫下杉木幼苗根系各元素亚细胞组分分布的影响 Tab.3 Effects of phosphorus on the distribution of elements in subcellular components in the roots of Chinese fir seedlings under aluminum stress
3 讨论

植物在受到逆境胁迫时,其植株内会产生多余的活性氧(ROS),如超氧阴离子自由基(${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$)、羟基自由基(${\rm{O}}{{\rm{H}}^{\bar \cdot }}$)、过氧化氢(H2O2)等,使自身细胞膜被氧化损伤,与此同时,植物细胞内的重要抗氧化酶系统能清除植株体内多余的ROS,维持ROS在植物体内的动态平衡,避免植株受到损伤。因此,植物在应答逆境胁迫时,其体内的抗氧化酶系统起着非常重要的作用。众多研究者发现,当植物受到逆境胁迫时,其体内的SOD活性升高,将多余的${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$转化为H2O2,是植物抵抗逆境胁迫的第一道屏障。本研究中,铝胁迫下,不同供磷水平对杉木抗氧化酶活性产生了影响,SOD活性整体呈现出下降的趋势,表明逆境胁迫下杉木幼苗启动了自身的抗氧化酶系统来规避低磷和铝毒对其损伤,通过植株体内的生理机制来响应所受到的逆境胁迫,一定程度的供磷可以促进SOD清除杉木体内的${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$,在一定程度上能缓解Al3+对杉木根系的毒害作用,避免多余的${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$对杉木幼苗的损伤,与孙红英(2010)的研究结果相似。CAT和POD主要是协同清除经SOD歧化反应产生的H2O2孙红英(2010)的研究表明,低磷和铝毒胁迫对植株体内SOD、CAT和POD活性影响较大。本研究中,无铝胁迫下,1/2 P处理与P处理相比,杉木幼苗的POD和CAT活性大幅度升高,说明低磷胁迫诱导POD和CAT清除SOD歧化以及其他途径产生的多余的H2O2;无磷处理时,其POD和CAT活性降低,可能是由于杉木幼苗体内积累的H2O2超出了POD和CAT的清理能力,抑制了其体内的POD和CAT活性。而在铝胁迫下,随着供磷水平的增加杉木幼苗的CAT活性增加,其根系中POD活性增加,这表明磷素的增加能在一定程度上促进杉木幼苗体内的POD和CAT活性,降低Al3+对杉木幼苗的损伤,与孙红英(2010)的结果相似。

生物膜脂质过氧化是植物遭受逆境胁迫时最重要的特征之一,其原因是由于植物遭受逆境胁迫时会产生MDA,破坏植物细胞的生物膜结构和功能,造成细胞损伤(Li et al., 2012)。本研究发现,低磷胁迫使得杉木幼苗根系和叶片中的MDA含量增加,在有铝无磷的情况下,杉木幼苗中的MDA含量比添加磷时高,随着供磷水平的增加,MDA呈降低的趋势,说明低磷和铝毒均能使杉木幼苗产生脂质过氧化,破坏其细胞的生物膜结构和功能。图 2a中伊文斯蓝染色也证明了这一点,随着供磷水平的增加,杉木根系的染色情况由深到浅,同样证明磷素能缓解铝对杉木苗根尖的毒害作用,有效阻止其破坏杉木幼苗根系的质膜完整性。磷在一定程度上能缓解铝毒造成的膜脂过氧化作用,降低了杉木体内活性氧的积累,减轻了铝对杉木根系和叶片造成的损伤。从图 2b可以看出,随着供磷水平的增加,杉木根系的染色情况由深到浅,同样说明外源磷素的添加在一定程度上能缓解铝对杉木苗根尖的毒害作用,有效阻止其破坏杉木苗根系的质膜完整性。许小丽(2016)的研究同样发现,磷处理使得杉木细胞中的MDA含量降低,有效缓解铝对细胞造成的脂质过氧化损伤。而与此相反的是,Maejima等(2014)对低磷和铝毒胁迫下的水稻根系进行苏木精染色发现,无磷有铝处理的水稻根系颜色比磷铝复合处理的颜色浅,表明无磷处理增强水稻对铝的耐受性,是由于磷缺乏显著降低根系细胞壁中的果胶,导致根细胞壁上吸附的铝减少,减轻了铝对水稻根系的毒害作用。

逆境胁迫会影响植物正常吸收和传导营养元素,造成其体内养分不足或失衡、新陈代谢紊乱,从而影响植物的正常生长(Cakmak et al., 2009)。K在植物体内的生理代谢过程中发挥重要作用,由图 3d可知,有铝环境中的杉木幼苗根系中的K含量比无铝环境中的低,可能是因为Al可与K竞争杉木幼苗根系中的吸收位点,从而在一定程度上抑制根系对K+的吸收,降低其体内K含量,影响了杉木幼苗的正常代谢过程。类似地,王娟等(2012)对水花生(Alternanthera philoxeroides)愈伤组织进行研究,发现逆境胁迫使得其组织内的K含量降低。本研究发现,低磷和铝毒处理下Al和Fe更多地富集在杉木幼苗的根部,Ca、Mg和P较多地积累在其叶片中,与张莉莉(2014)陈文荣等(2008)的研究结果(铝胁迫后Al在杉木植株根部的积累较高,而K、Mg和Ca则较多地富集在叶片)有相似之处,说明低磷和铝毒的复合作用下,Al3+大部分被固定在杉木幼苗的根部。Mg是叶绿素的重要组成成分,在光合作用中具有重要作用,Mg更多地积累在杉木幼苗的叶片中,能促进叶片进行光合作用,使得杉木幼苗对低磷和铝毒胁迫的抗性增强。Gupta等(1998)的研究证明,有毒金属的增加使得植物对各种营养元素的吸收下降。与之相反的是,在低磷和铝毒处理下,随着供磷水平的增加,杉木幼苗体内的Ca含量增加。由于Ca是细胞壁的组成成分,同时也能使细胞中的膜结构保持稳定,本研究的结果表明低磷和铝胁迫能增加杉木幼苗对Ca的吸收,有利于维持杉木细胞的正常结构和功能,提高其适应低磷和铝毒胁迫的能力,与肖细元等(2006)的研究结果一致。在无Al3+处理的情况下,随着供磷程度的增加,根系中K、Zn和P的含量呈现出相反的趋势,说明铝能提高根系对K、Zn和P的积累,同时在有铝环境中杉木幼苗根系需要吸收更多的磷素来缓解铝的毒害作用。这可能是磷素存在条件下,杉木幼苗通过增加对Ca、K、Mg和Zn的吸收和转运,竞争Al在根系当中的吸附位点,从而减少杉木对Al的吸收。

大量数据证明,金属在植物亚细胞中的分布情况可以为植物应答金属胁迫的研究提供理论依据(Wang et al., 2006; Wallace et al., 2003)。研究表明,细胞壁是有害金属进入植物根系的第一道屏障(Taylor et al., 2000)。本试验中,杉木幼苗根系细胞壁组分(F1)中Al含量最高(表 3图 4图 5),这也证明Al与细胞壁结合是杉木耐铝毒的机制之一。杉木细胞壁之所以能够大量吸附Al3+是因为Al3+带正电,很容易在带负电的细胞壁处被大量吸附而沉积。此外,细胞壁含有蛋白质和多糖以及大量配位基团(羟基、羧基、醛基、氨基等),容易吸附Al3+,本研究通过TED-EDS也清晰证实了Al在细胞壁周围聚集,这一结果和俞慧娜等(2009)的结果类似。随着供磷水平的升高,细胞壁组分(F1)中的Al有所下降,而在F4可溶性组分中的比例明显增加(表 3图 4图 5),这说明磷使得进入细胞内的Al3+被转运到液泡内。研究表明液泡是植物体内磷素的“储存库”,在磷饥饿的情况下,液泡当中磷素会降低以供给细胞质中的细胞器使用,在磷素充裕的条件下,90%的磷又会存储到液泡当中(Yang et al., 2017)。磷使得进入细胞内的Al3+被转运到液泡内,可能是其能够与含磷物质及液泡内有机酸、蛋白质和生物碱等物质形成Al4(PO4)3等不溶物或络合物,降低其生物有效性和毒性,使Al3+在植物细胞内区室化,从而增强细胞对铝的抗性。此外,随着供磷程度降低,Al不断增加在细胞壁组分(F1)中所占的比例,Ca、K、Mg、P和Zn呈现出同样的规律,在其他组分中所占的比例呈降低的趋势,可能是由于缺磷和铝毒能够降低杉木幼苗根系细胞壁中的果胶浓度,为保持杉木苗根系细胞膜流动性和膜渗透性,其细胞壁组分中的Ca、K、Mg、P和Zn增加,与Maine等(2001)Zhu等(2012)Maejima等(2014)的研究结果有相似之处。阳离子吸收是植物耐金属胁迫的一个重要指标(Douchiche et al., 2010),用于引导Al和相同结合位点的必需营养元素的竞争。在低磷和铝毒胁迫下,为防止Mg2+被Al3+替代,含核糖体的可溶组分(F4)中含有较高的Mg,这与Qiao等(2015)Kupper等(2000)的研究结果有相似之处。

4 结论

铝胁迫对杉木幼苗根系的毒害作用较大,造成根系细胞膜脂过氧化,同时对杉木幼苗吸收利用和传导养分产生了不利影响。磷素能够通过:1)改变杉木细胞内抗氧化酶活性,缓解铝毒对杉木幼苗造成的膜脂过氧化作用;2)增加对Ca、K、Mg和Zn的吸收和转运,减少对铝的吸收以及增加其在杉木体内的转运;3)促进Al3+向液泡部分转运,使Al3+在植物细胞内区室化;从而增强细胞对铝的抗性,维持根系细胞壁的正常结构和功能,减轻Al对杉木幼苗的毒害作用。

参考文献(References)
陈文荣, 刘鹏, 徐根娣, 等. 2008. 施钙处理对大豆铝毒缓解作用的研究[J]. 浙江师范大学学报:自然科学版, 31(2): 201-207.
(Chen W R, Liu P, Xu G D, et al. 2008. Effects of calcium applicated on alleviation of aluminum toxicity to soybean[J]. Journal of Zhejiang Normal University: Natural Sciences, 31(2): 201-207. [in Chinese])
郭天荣, 姚鹏程, 张子栋, 等. 2013. 铝毒和低磷胁迫下水稻幼苗抗氧化系统的响应[J]. 中国水稻科学, 27(6): 653-657.
(Guo T R, Yao P C, Zhang Z D, et al. 2013. Involvement of antioxidative defense system in rice seedling exposed to aluminum toxicity and phosphorus deficiency[J]. Chin J Rice Sci, 27(6): 653-657. [in Chinese])
黄玫英, 罗洁文, 黄彩凤, 等. 2016. Pb在类芦组织和亚细胞中的分布规律和毒害效应[J]. 农业环境科学学报, 35(11): 2077-2085.
(Huang M Y, Luo J W, Huang C F, et al. 2016. The distribution and toxic effects of Pb at the levels of the tissue and sub-cellular in Neyraudia reynaudiana[J]. Journal of Agro-Environment Science, 35(11): 2077-2085. DOI:10.11654/jaes.2016-0627 [in Chinese])
黄文方, 陈晓阳, 邢承华, 等. 2013. 磷对水稻耐铝性及根尖细胞壁组分的影响[J]. 中国水稻科学, 27(2): 161-167.
(Huang W F, Chen X Y, Xing C H, et al. 2013. Effects of phosphorus on aluminum tolerance and cell wall polysaccharide components in rice root tips[J]. Chin J Rice Sci, 27(2): 161-167. [in Chinese])
罗洁文, 黄玫英, 殷丹阳, 等. 2016. 类芦对铅镉的吸收动力特性及亚细胞分布规律研究[J]. 农业环境科学学报, 35(8): 1451-1457.
(Luo J W, Huang M Y, Yin D Y, et al. 2016. Uptake kinetic characteristics and subcellular distribution of Pb2+ and Cd2+ in Neyraudia reynaudiana[J]. Journal of Agro-Environment Science, 35(8): 1451-1457. DOI:10.11654/jaes.2016-0202 [in Chinese])
沈宏, 严小龙. 2001. 铝对植物的毒害和植物抗铝毒机理及其影响因素[J]. 土壤通报, 32(6): 281-285.
(Shen H, Yan X L. 2001. Types of aluminum toxicity and plants resistance to aluminum toxicity[J]. Chinese Journal of Soil Science, 32(6): 281-285. [in Chinese])
孙红英. 2010. 低磷和铝毒对杉木幼苗若干生理过程的影响. 福州: 福建农林大学硕士学位论文.
(Sun H Y. 2010. Influence of low phosphorus and aluminum toxicity on some physiological processes of Chinese fir seedlings. Fuzhou: MS thesis of Fujian Agriculture and Forestry University. [in Chinese])
仝雅娜, 丁贵杰. 2008. 铝对植物生长发育及生理活动的影响[J]. 西部林业科学, 37(4): 56-60.
(Tong Y N, Ding G J. 2008. Influences of aluminum on development and physiological activities of plant[J]. Journal of West China Forestry Science, 37(4): 56-60. [in Chinese])
王娟, 张乐乐, 康宜宁, 等. 2012. Pb在水花生愈伤组织中的超微定位及对矿质元素的影响[J]. 水生生物学报, 36(2): 307-315.
(Wang J, Zhang L L, Kang Y N, et al. 2012. Ultrastructural localization and effect of lead on mineral elements in callus of Alternanthera philoxeroides[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 36(2): 307-315. [in Chinese])
向万胜, 黄敏, 李学垣. 2004. 土壤磷素的化学组分及其植物有效性[J]. 植物营养与肥料学报, 10(6): 663-670.
(Xiang W S, Huang M, Li X Y. 2004. Progress on fractioning of soil phosphorous and availability of various phosphorous fractions to crops in soil[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 10(6): 663-670. DOI:10.11674/zwyf.2004.0621 [in Chinese])
肖细元, 廖晓勇, 陈同斌, 等. 2006. 砷超富集植物蜈蚣草中磷和钙的亚细胞分布及其与耐砷毒的关系[J]. 环境科学学报, 26(6): 954-961.
(Xiao X Y, Liao X Y, Chen T B, et al. 2006. Subcellular distributions of phosphorus and calcium in arsenic hyperaccumulator Pteris vittata L. and its tolerance to phytotoxicity of arsenic[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 26(6): 954-961. [in Chinese])
许小丽. 2016. 不同钙、磷处理对杉木苗铝毒害的缓解作用及其机理. 福州: 福建农林大学硕士学位论文.
(Xu X L. 2016. Alleviating effects of calcium and phosphorus on aluminum toxicity in Chinese fir seedlings and its mechanism. Fuzhou: MS thesis of Fujian Agriculture and Forestry University. [in Chinese])
杨梅. 2007. 邻羟基苯甲酸胁迫对不同杉木无性系化感效应及差异蛋白质组分析. 福州: 福建农林大学博士学位论文.
(Yang M. 2007. Analysis on the allelopathic effects and differential proteome of different Chinese fir clones under salicylic acid stress. Fuzhou: PhD thesis of Fujian Agriculture and Forestry University. [in Chinese])
杨振德, 方小荣, 牟继平. 1996. 铝对桉树幼苗生长及某些生理特性的影响[J]. 广西科学, 3(4): 30-33.
(Yang Z D, Fang X R, Mou J P. 1996. Effect of aluminium on the growth and some physiological characters of Eucalyptus seedlings[J]. Guangxi Sciences, 3(4): 30-33. [in Chinese])
俞慧娜, 刘鹏, 徐根娣. 2007. 大豆生长及叶绿素荧光特性对铝胁迫的反应[J]. 中国油料作物学报, 29(3): 257-265.
(Yu H N, Liu P, Xu G T. 2007. Responses of growth and chlorophyll fluorescence characteristics of soybean to aluminum treatment[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences, 29(3): 257-265. [in Chinese])
俞慧娜, 刘鹏, 徐根娣, 等. 2009. 铝胁迫下大豆根尖细胞铝的微区分布与耐铝性分析[J]. 作物学报, 35(4): 695-703.
(Yu H N, Liu P, Xu G T, et al. 2009. Distribution of Al3+ in subcellular structure of root tips cells and aluminum tolerance in soybean[J]. Acta Agronomica Sinica, 35(4): 695-703. [in Chinese])
张莉莉. 2014. 铝、镁、钙复合作用对杉木幼苗生理生化特征的影响. 福州: 福建农林大学硕士学位论文.
(Zhang L L. 2014. Effect of aluminum, magnesium and calcium on physiological and biochemical characteristics of Chinese fir seedlings. Fuzhou: PhD thesis of Fujian Agriculture and Forestry University. [in Chinese])
邹显花, 吴鹏飞, 贾亚运, 等. 2016. 杉木根系对不同磷斑块浓度与异质分布的阶段性响应[J]. 植物营养与肥料学报, 22(4): 1056-1063.
(Zou X H, Wu P F, Jia Y Y, et al. 2016. Periodical response of Chinese fir root to the phosphorus concentrations in patches and heterogeneous distribution in different growing stages[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer, 22(4): 1056-1063. DOI:10.11674/zwyf.15076 [in Chinese])
Cakmak I, Yazici A, Tutus Y, et al. 2009. Glyphosate reduced seed and leaf concentrations of calcium, manganese, magnesium, and iron in non-glyphosate resistant soybean[J]. European Journal of Agronomy, 31(3): 114-119. DOI:10.1016/j.eja.2009.07.001
Delhaize E, Ryan P R, Randall P J. 1993. Aluminum tolerance in wheat (Triticum aestivum L.). Ⅱ. Aluminum-stimulated excretion of malic acid from root apices[J]. Plant Physiology, 103(3): 695-702. DOI:10.1104/pp.103.3.695
Douchiche O, Soret-Morvan O, Chaibi W, et al. 2010. Characteristics of cadmium tolerance in 'Hermes' flax seedlings: Contribution of cell walls[J]. Chemosphere, 81(11): 1430-1436. DOI:10.1016/j.chemosphere.2010.09.011
Gupta M, Chandra P. 1998. Bioaccumulation and toxicity of mercury in rooted-submerged macrophyte Vallisneria spiralis[J]. Environmental Pollution, 103(2): 327-332.
Kiegle E, Gilliham M, Haseloff J, et al. 2000. Hyperpolarisation-activated calcium currents found only in cells from the elongation zone of Arabidopsis thaliana roots[J]. The Plant Journal: for cell and molecular biology, 21(2): 225-229. DOI:10.1046/j.1365-313x.2000.00659.x
Kinraide T B, Pedler J F, Parker D R. 2004. Relative effectiveness of calcium and magnesium in the alleviation of rhizotoxicity in wheat induced by copper, zinc, aluminum, sodium, and low pH[J]. Plant and Soil, 259(1/2): 201-208.
Kupper H, Lombi E, Zhao F J, et al. 2000. Cellular compartmentation of cadmium and zinc in relation to other elements in the hyperaccumulator Arabidopsis halleri[J]. Planta, 212(1): 75-84. DOI:10.1007/s004250000366
Li X, Zhang L, Li Y, et al. 2012. Changes in photosynthesis, antioxidant enzymes and lipid peroxidation in soybean seedlings exposed to UV-B radiation and/or Cd[J]. Plant and Soil, 352(1): 377-387.
Liu K, Luan S. 2001. Internal aluminum block of plant inward K+ channels[J]. The Plant Cell, 13(6): 1453-1465.
Maejima E, Watanabe T, Osaki M, et al. 2014. Phosphorus deficiency enhances aluminum tolerance of rice (Oryza sativa) by changing the physicochemical characteristics of root plasma membranes and cell walls[J]. Journal of Plant Physiology, 171(2): 9-15. DOI:10.1016/j.jplph.2013.09.012
Maine M A, Duarte M V, Sune N L. 2001. Cadmium uptake by floating macrophytes[J]. Water Research, 35(11): 2629-2634. DOI:10.1016/S0043-1354(00)00557-1
Pan W L, Hopkins A G, Jackson W A. 1989. Aluminum inhibition of shoot lateral branches of Glycine max and reversal by exogenous cytokinin[J]. Plant and Soil, 120(1): 1-9. DOI:10.1007/BF02370285
Pineros M A, Kochian L V. 2001. A patch-clamp study on the physiology of aluminum toxicity and aluminum tolerance in maize. Identification and characterization of Al3+-induced anion channels[J]. Plant Physiology, 125(1): 292-305. DOI:10.1104/pp.125.1.292
Qiao X, Zheng Z, Zhang L, et al. 2015. Lead tolerance mechanism in sterilized seedlings of Potamogeton crispus L.: Subcellular distribution, polyamines and proline[J]. Chemosphere, 120: 179-187. DOI:10.1016/j.chemosphere.2014.06.055
Samac D A, Tesfaye M. 2003. Plant improvement for tolerance to aluminum in acid soils-a review[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 75(3): 189-207. DOI:10.1023/A:1025843829545
Taylor G J, McDonald-Stephens J L, Hunter D B, et al. 2000. Direct measurement of aluminum uptake and distribution in single cells of Chara corallina[J]. Plant Physiology, 123(3): 987-996. DOI:10.1104/pp.123.3.987
Wallace W G, Lee B G, Luoma S N. 2003. Subcellular compartmentalization of Cd and Zn in two bivalves. I. Significance of metal-sensitive fractions (MSF) and biologically detoxified metal (BDM)[J]. Marine Ecology Progress Series, 249: 183-197. DOI:10.3354/meps249183
Wang W, Rainbow P S. 2006. Subcellular partitioning and the prediction of cadmium toxicity to aquatic organisms[J]. Environmental Chemistry, 3(6): 395-399.
Wang Y S, Yang Z M. 2005. Nitric oxide reduces aluminum toxicity by preventing oxidative stress in the roots of Cassia tora L[J]. Plant and Cell Physiology, 46(12): 1915-1923. DOI:10.1093/pcp/pci202
Yang S Y, Huang T K, Kuo H F, et al. 2017. Role of vacuoles in phosphorus storage and remobilization[J]. Journal of Experimental Botany, 68(12): 3045-3055.
Zhu X F, Lei G J, Jiang T, et al. 2012. Cell wall polysaccharides are involved in P-deficiency-induced Cd exclusion in Arabidopsis thaliana[J]. Planta, 236(4): 989-997. DOI:10.1007/s00425-012-1652-8