陆生维管植物出现时还没有进化出叶片，枝条是主要的光合器官(Nilsen, 1995)。尽管枝条光合被认为是原始性状，但至今至少在12个科的木本植物中被保留，绝非是叶片光合进化的冗余产物(Ávila et al., 2014; Pfanz et al., 2001)。木本植物枝条中的叶绿体能将线粒体呼吸释放和木质部蒸腾流中扩散的CO₂固定，因绿色光合细胞主要位于皮层组织，因此将枝条中的叶绿体称为皮层叶绿体，枝条的光合作用称为皮层光合(蔡锡安等, 2015)。皮层光合可降低枝条内部的CO₂浓度，减轻酸化对细胞中碱性机构的破坏，同时释放O₂，减少无氧呼吸产生的醇、酮类有毒物质(Wittmann et al., 2014)。特别是在干旱胁迫导致叶片气孔关闭甚至脱落的条件下，皮层光合成为全株唯一的碳来源，对维持木本植物的生存延续至关重要(Cernusak et al., 2015)。目前，关于皮层光合提高茎干生长量、促进叶芽发生发育(Saveyn et al., 2010)及保障木质部水分运输(Schmitz et al., 2012)等生理生态功能的报道较多，而关于皮层光合的途径和机制仍不清楚。光合作用决定于叶绿体的结构和功能。皮层叶绿体位于枝条中高CO₂浓度、低O₂分压、低光强、长波长光质的理化环境(Pfanz, 2008)，与叶片叶绿体所处的细胞环境截然不同，皮层叶绿体结构、功能的特化是其适应枝条特殊环境行使光合作用的基础。

旱柳(Salix matsudana)是我国北方地区重要的园林景观、生态修复、工业用材树种。旱柳当年生枝条皮层组织中绿色光合细胞丰富，皮层光合可将枝条释放的80%CO₂回收固定(张金尧等, 2014)。因此，本研究以旱柳当年生枝条为试验材料，在明确枝条中叶绿体的分布及其光化学活性的基础上，从光系统激发能分配、光合色素组成和叶绿体超微结构等方面阐明皮层叶绿体与叶片叶绿体的差异，进而解析皮层叶绿体的光合生理特性，探明皮层叶绿体结构的特化，为揭示皮层光合的运行和调节机制奠定基础。

2014年春季，从中国林业科学研究院内的一株旱柳成年雌株(胸径42 cm，树高约10 m)树冠上选取直径(1.5±0.5)cm的1年生枝条，剪成15 cm长的插穗，露地扦插培养，株行距1.5 m×2 m，最外侧设置为保护行，常规养护管理。2016年7月，从保护行内的30株旱柳无性系随机选2株，分别在其南向1.5 m高度处取长度为(50±10)cm的当年生枝条，进行枝条叶绿素荧光参数、枝条和叶片低温叶绿素荧光光谱、枝条和叶片光合色素含量的测定；随机选1株，取当年生枝条及其上叶片，观察枝条皮层和叶片叶绿体超微结构；分别重复3次。

从枝条中部取5 cm长茎段，在其上取约为50 μm厚的横切片，暗适应30 min后应用配备micro探头(3.5 mm×4.5 mm)的Imaging PAM叶绿素荧光仪(Walz, Germany)测定横切片的最大光化学效率。应用Imaging Win v2.3.2软件分析最大光化学效率的径向变化，并在叶绿素荧光成像中的髓心、维管组织和皮层组织选择样点，获取最大光化学效率的观测值。

以枝条中部3 cm长枝段及功能叶片为材料，参考阳成伟等(2004)的方法，应用HITACHI F-7000荧光光谱仪测定二者的77 K荧光发射光谱，激发光波长为436 nm，扫描波长范围为600~800 nm。

取枝条中部茎段的树皮和功能叶片各1 g，去离子水清洗、滤纸吸干后用液氮充分研磨，加入80%丙酮20 mL，黑暗中浸提至沉淀为白色，2 000g离心10 min，上清液用80%丙酮定容，参考高俊凤(2006)的方法测定光合色素含量。

取枝条中部茎段的树皮和功能叶片，切成2 mm²的组织块，投入2.5%戊二醛中，抽真空使样品下沉，固定3 h后用0.1 mol·L^-1的磷酸缓冲液冲洗3次，转到1%锇酸中固定2 h，磷酸缓冲液冲洗3次后分别用体积比为30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脱水。经环氧树脂SPURR包埋、聚合、修块后采用LEICA UC6型超薄切片机切片，用醋酸双氧铀、柠檬酸铅对切片双重染色。每个样品的切片放在一个铜网上，应用中国农业大学电镜室JEM-1230型透射电子显微镜观察、拍照，加速电压80 kV。

采用Image J图像分析软件对旱柳叶片和皮层叶绿体的形态和亚细胞器结构进行量化分析。每样品选取10个叶绿体统计叶绿体的长径、短径、基粒数、嗜锇颗粒数、淀粉粒占叶绿体面积比例，从每叶绿体随机选取3个基粒统计基粒片层数、基粒片层厚度、基粒片层占总片层数的比例。

用Excel2007整理试验数据并绘制图表。应用SPSS 19.0软件对不同处理的数据进行方差分析。对于2个处理间的差异显著性，根据方差分析得到的P值判断；对于3个处理间的差异显著性，采用LSD多重比较法检验；显著性水平为P < 0.05。

由图 1a可知，在旱柳当年生枝条横切面范围内均可检测到最大光化学效率的信号，表明髓、射线、皮层、表皮等活组织中都有叶绿体分布。由图 1b可知，由髓心到皮层，最大光化学效率逐渐升高；由皮层到表皮，最大光化学效率逐渐降低。图 1c的结果表明，皮层组织的最大光化学效率显著高于维管组织和髓心，是维管组织的1.53倍，是髓心的2.10倍。

图 1 枝条中叶绿体的分布格局及最大光化学效率的空间异质性 Figure 1 The distribution pattern of chloroplast in stem and the spatial heterogeneity of maximum photochemical efficiency of PSⅡ a.枝条横切面最大光化学效率成像：图中带箭头的虚线表示由髓心到表皮的路径；b.沿图a虚线箭头方向最大光化学效率的径向变化；c.枝条横切面不同组织间最大光化学效率的差异：图中小写字母不同表示差异显著(P < 0.05)，下图与此相同。 a. The image of max photochemical efficiency of transverse section from stem segment: the dotted line with arrow indicates radical pathway from pith to epidermis; b. The radial change of max photochemical efficiency follow the arrow direction of dotted line in figure a; c. The difference of max photochemical efficiency among tissues of transverse section from stem segment: different lowercase letters indicate significant difference(P < 0.05), the same below.

由图 2a可知旱柳枝条和叶片均在694 nm和737 nm出现荧光发射峰(F694和F737)，F694发自于叶绿体的PSⅡ，F737来自于PSⅠ，皮层叶绿体与叶片叶绿体均表现出PSⅠ的荧光发射强度大于PSⅡ。图 2b的结果表明枝条的PSⅡ与PSⅠ激发能分配比例(F694/F737)显著高于叶片，是叶片的1.42倍。

图 2 旱柳枝条和叶片77 K荧光发射光谱及其PSⅡ与PSⅠ的激发能分配比例 Figure 2 Fluorescence emission spectrum at 77 K and the ratio of excited energy allocation of PSⅡto PSⅠin twig and leaf of Salix matsudana a.枝条和叶片的77 K荧光发射光谱; b.枝条和叶片PSⅡ与PSⅠ的激发能分配比例。 a. Fluorescence emission spectrum of leaf and twig at 77 K; b. The ration of excited energy allocation of PSⅡto PSⅠin twig and leaf.

由表 1可知，旱柳叶片叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量和类胡萝卜素含量均显著高于枝条皮层叶绿体。其中，皮层总叶绿素含量为叶片的9.8%，类胡萝卜素含量为叶片的13.6%。皮层中的叶绿素a与叶绿素b的比值显著低于叶片，而类胡萝卜素与总叶绿素的比值则显著高于叶片。

表 1 枝条皮层叶绿体和叶片叶绿体的光合色素组成差异^① Tab.1 The difference of photosynthetic pigment composition between leaf and twig cortex chloroplast

表 1 枝条皮层叶绿体和叶片叶绿体的光合色素组成差异① Tab.1 The difference of photosynthetic pigment composition between leaf and twig cortex chloroplast 材料 Materials 叶绿素a含量 Content of chlorophyll a/ (mg·g-1FW) 叶绿素b含量 Content of chlorophyll b/ (mg·g-1FW) 总叶绿素含量 Content of total chlorophyll/ (mg·g-1FW) 类胡萝卜素含量 Content of carotenoid/ (mg·g-1FW) 叶绿素a/b Ratio of chlorophyll a to chlorophyll b 类胡萝卜素/总叶绿素 Ratio of carotenoid to total chlorophyll 皮层 Cortex 0.12±0.01b 0.05±0.01b 0.17±0.01b 0.03±0.00b 2.40±0.09b 0.18±0.02 a 叶片 Leaf 1.30±0.14a 0.43±0.06a 1.73±0.16a 0.22±0.02a 3.02±0.16a 0.13±0.01b   ①皮层和叶片的一对数据间小写字母不同表示差异达到显著水平，P < 0.05，下表与此相同。Different lowercase letters indicate significant difference between the pair data of cortex and leaf at 5%level, the same below.

枝条皮层叶绿体和叶片叶绿体均在细胞液内沿质膜分布，长轴方向与质膜平行，皮层叶绿体的排列较疏松，叶片叶绿体的排列较紧密。图 3表明，叶片叶绿体呈椭圆形，体积大；皮层叶绿体呈长椭圆形、较瘦长，体积小；二者都具有发达的类囊体膜系统，且均由基粒片层和基质片层2部分组成；皮层叶绿体同样具有淀粉粒、嗜锇颗粒等典型的亚细胞器结构。由统计分析(表 2)可知，皮层叶绿体长轴和短轴长度均显著小于叶片叶绿体，但长轴与短轴的比例显著高于叶片叶绿体。皮层叶绿体的基粒数量与叶片叶绿体无显著差异，垛叠层数约为叶片叶绿体的50%，基粒片层厚度显著低于叶片叶绿体。皮层叶绿体中淀粉粒的空间比例约为叶片叶绿体的3倍，基粒片层占总片层数的比例显著高于叶片叶绿体，嗜锇颗粒的数量与后者无显著差异。

图 3 旱柳枝条皮层叶绿体和叶片叶绿体超微结构的差异 Figure 3 The chloroplast ultrastructure of twig cortex and leaf of Salix matsudana CE:叶绿体被膜；G：基粒；GL：基粒片层；OG：嗜锇颗粒；SG：淀粉粒；SL：基质片层。 A, B表示皮层叶绿体，a, b表示叶片叶绿体：用于统计叶绿体的长轴、短轴长度，基粒、嗜锇颗粒数目，淀粉粒比例。C, D表示皮层叶绿体的基粒，c, d表示叶片叶绿体的基粒：用于统计基粒的片层数、基粒片层厚度、基粒片层占总片层数的比例。 CE: Chloroplast envelope; G: Grana; GL: Grana lamella; OG: Osmiophilic granule; SG: Starch grain; SL: Stroma lamella. A, B: Twig cortex chloroplast; a, b: Leaf chloroplast(For analyzing the indicators of long diameter and short diameter distance, grana and osmiophilic granule number and the ration of starch grain to chloroplast area). C, D: Grana of cortex chloroplast; c, d: Grana of leaf chloroplast(For analyzing the indicators of grana lamella number, grana lamella thickness and the ration of grana lamella to total lamella amount).

表 2 旱柳枝条皮层叶绿体和叶片叶绿体的细胞器及亚细胞器结构参数 Tab.2 The organelle and sub-organelle structure parameters of chloroplast in twig cortex and leaf of Salix matsudana

表 2 旱柳枝条皮层叶绿体和叶片叶绿体的细胞器及亚细胞器结构参数 Tab.2 The organelle and sub-organelle structure parameters of chloroplast in twig cortex and leaf of Salix matsudana 结构参数 Structure parameters 皮层叶绿体 Cortex chloroplast 叶片叶绿体 Leaf chloroplast 细胞器结构参数 Organelle structure parameters 长轴 Long diameter/μm 4.18±1.06b 5.11±1.14a 短轴 Short diameter/μm 1.77±1.39a 2.46±0.82a 长轴/短轴 The ratio of long diameter to short diameter 3.21±1.81a 2.22±0.66b 亚细胞器结构参数 Sub-organelle structure parameters 基粒数 Number of grana (number per chloroplast) 6.70±1.64a 10.45±5.74a 嗜锇颗粒数 Number of osmiophilic granule (number per chloroplast) 7.60±5.23a 9.65±6.05a 淀粉粒占叶绿体的比例 The ration of starch grain area to chloroplast (%) 40.17±14.41a 12.18±8.46b 基粒的片层数 Lamella number of grana (layers per grana) 8.42±1.78b 17.60±5.70a 基粒片层厚度 Grana lamella thickness/nm 18.78±2.27b 21.43±1.71a 基粒片层占总片层数的比例 The ration of grana lamellas to total lamellas amount (%) 63.92±11.25a 48.73±6.46b

在木本植物枝条的树皮、射线薄壁组织、韧皮部、木质部甚至髓中都可发现叶绿体(Pfanz et al., 2002)。旱柳当年生枝条中，由髓心至表皮均可检测到叶绿素荧光信号，表明各组织中都有叶绿体的分布。以往的报道多关注枝条中叶绿体的分布和数量，本研究在此基础上对不同组织部位叶绿体光化学活性进行了比较，结果表明最大光化学效率在枝条横切面呈异质性分布，峰值位于皮层组织。皮层组织叶绿体的光化学活性高于其他组织部位，这可能与枝条中随着深度的增加叶绿体数量减少和结构改变有关(蔡锡安等，2015)。

根据以往对其他树种的报道，枝条叶绿素含量在52~673 mg·m^-2之间，叶绿素总量相当于对应叶片的10%~165%，叶绿素a/b值相当于对应叶片的49%~74%(王文杰等，2007)。本研究得到的结果亦在此范围内，旱柳皮层组织的光合色素含量约为叶片的1/10，与叶片叶绿体相比，皮层叶绿体具有较高的叶绿素b/叶绿素a比例，叶绿素b丰度高有利于对光能的捕捉和传递，是典型阴生植物的特点(蔡锡安等，2015)。旱柳枝条皮层叶绿体的长轴方向与质膜平行，皮层叶绿体具有较高的长短轴比例，增加了其对枝条内有限光照的受光面积。旱柳皮层叶绿体发育完整，具有典型的亚细胞器结构。与叶片叶绿体相比，皮层叶绿体具有较高的基粒片层占总片层数的比例和较高的淀粉粒比例，这与陈登举等(2013)对毛竹(Phyllostachys edulis)茎干和叶片叶绿体超微结构研究所得到的结果相一致。较高的基粒片层比例决定了皮层叶绿体的垛叠程度高于叶片叶绿体，这是皮层叶绿体对枝条中长期弱光环境的适应(Kotakis et al., 2006)，使得PSⅡ的聚光色素复合体(LHCⅡ)间连接更紧密，提高了捕光能力和光能向反应中心的传递效率，有利于2个光系统的协调以及同化力的形成。但垛叠程度的提高将导致热耗散能力的降低(陈悦，2007)，皮层细胞中的酸化环境也会削减光化学途径的能量分配(Levizou et al., 2004)，二者易使皮层叶绿体产生光氧化胁迫，而皮层叶绿体较高的类胡萝卜素比例有利于过剩激发能的淬灭，可以起到光保护的作用(Yang et al., 2002)。由于PSⅡ主要位于垛叠的基粒片层上，较高的基粒片层比例决定了激发能将更多地向PSⅡ分配，这与77 K低温皮层叶绿体PSⅡ与PSⅠ激发能分配比例显著高于叶片叶绿体的结果形成了相互佐证。进入枝条中的光以长波长红光为主，红光会抑制光合产物的输出(Sæbø et al., 1995)，这可能导致了皮层叶绿体中淀粉的积累。在皮层叶绿体中积累淀粉，将有利于在碳同化物供给短缺时满足枝条对非结构碳水化合物的需求，对防御干旱等逆境胁迫导致的碳饥饿和水力学失败发挥着重要作用(Vandegehuchte et al., 2015)。

旱柳当年生枝条不同组织部位都有叶绿体的分布，叶绿体最大光化学效率存在径向异质性，皮层组织叶绿体是枝条皮层光合的主要贡献者。皮层叶绿体通过增加受光面积、提高天线色素比例，增加对枝条中有限光能的捕捉；通过提高光保护色素的比例减轻光氧化胁迫；通过增加类囊体的垛叠，促进光能向PSⅡ的传递。综上，皮层叶绿体通过对光合色素组成的调整和亚细胞器结构的特化来适应枝条内的理化环境，最大限度地利用枝条中有限的光能，为枝条的非结构性碳水化合物需求提供保障。