植物原生质体是指去除细胞壁的植物活细胞，仍然保留细胞正常的生长、分裂等生理活性，在一定的条件下，可以再生成新的植株(Davey et al., 2005；彭邵锋等，2013)。随着纤维素酶、果胶酶等的商品化，原生质体分离体系得到迅速发展，已在水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、毛果杨(Populus trichocarpa)、大麦(Hordeum vulgare)等植物中取得成功(Mathur et al., 1995；Pati et al., 2008；Tan et al., 2013；Bai et al., 2014；Burris et al., 2016；Endo et al., 2016)。原生质体也被广泛应用于基因定位、启动子活性、蛋白互作及植物育种等方面的研究，基于原生质体的相关技术已成为植物分子生物学研究的重要手段(Eeckhaut et al., 2013；Jiang et al., 2013；Jung et al., 2015；Woo et al., 2015)。虽然植物原生质体的酶解分离方法已经比较成熟，但几乎所有的研究都表明，不同的植物种类，甚至同种植物不同的供试组织材料，其原生质体的分离条件都存在很大差异(Jones et al., 2012；Lin et al., 2014；Lionetti et al., 2015；Nanjareddy et al., 2016；Wu et al., 2017)。对菜豆(Phaseolus vulgaris)原生质体分离条件的研究发现，以叶片、花瓣和下胚轴等组织分离原生质体，其最佳条件中酶的浓度、种类、酶解时间及是否需质壁分离预处理等均有所不同(Nanjareddy et al., 2016)；对陆地棉(Gossypium hirsutum)叶肉原生质体分离条件的比较发现，叶片年龄、酶液配方、酶解时间等条件均对原生质体的分离有重要影响(李妮娜等，2014)。因此，针对特定的植物材料，一般需要通过系统研究才能建立高效的原生质体分离体系。

杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国特有的常绿针叶树种，也是我国南方造林面积最大的用材树种之一，被广泛应用于家具、建筑、桥梁等方面(傅星星，2007)。近年来，杉木的分子生物学研究逐渐受到重视，分离鉴定了许多功能基因(Wang et al., 2007；Wan et al., 2012；Li et al., 2015)。通过转录组测序建立了杉木基因数据库，并鉴定获得了与纤维素、木质素合成相关的基因(Huang et al., 2012)；通过差减文库对杉木木材形成过程特异表达基因进行了鉴定与分析，获得了一大批可能与杉木木材形成相关的基因(Wang et al., 2007)。但由于杉木没有完善的遗传转化体系，导致对杉木基因功能的研究只能进行模式植物异源转化间接验证(Li et al., 2015)。原生质体作为基因功能快速分析检测的平台，有望为杉木分子生物学研究提供新的途径。因此，本研究以杉木组培苗幼嫩叶片为材料，通过酶液组合、真空处理时间、渗透压、BSA浓度及酶解时间的筛选，建立了高效的杉木叶片原生质体分离技术；通过不同RNA提取方法的比较，筛选出了杉木原生质体RNA提取的最佳方法。这些研究结果将为今后利用原生质体开展杉木分子生物学研究提供重要的技术基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

以培养2~3个月的杉木B13无性系组培苗为材料，取其最上部幼嫩叶片，称取0.15~0.20 g，用手术刀快速切成1~2 mm小段用于原生质体的分离。

1.2 原生质体分离与纯化

针对影响原生质体分离的主要因素，对酶液组合(表 1)、渗透压(甘露醇0.3、0.4、0.5、0.6 mol·L^-1)、真空处理时间(200 Pa，0、5、10、15、20 min)、BSA (牛血清蛋白)浓度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，W/V)和酶解时间(1、2、3、4、5 h)等进行了比较。酶液组合包含纤维素酶C2605(Sigma)、纤维素酶R-10(Yakult)、纤维素酶RS(Yakult)、离析酶R-10(Yakult)和果胶酶Y-23(Yakult)5种酶不同浓度的组合(表 1)。酶液其他成分均为0.4 mol·L^-1甘露醇、20 mmol·L^-1 KCl、20 mmol·L^-1 MES(pH5.7)、20 mmol·L^-1 CaCl₂以及0.1%(W/V)BSA。酶液配制时，先加入不同的酶、甘露醇、KCl和MES混匀，55 ℃水浴10 min，冷却至室温后再加入CaCl₂和BSA。将切好的叶片放入酶液，真空处理适当时间后，放在水平摇床上100 r·min^-1避光酶解。

酶解结束后，加入等体积的W5溶液[154 mmol·L^-1 NaCl、125 mmol·L^-1 CaCl₂、2 mmol·L^-1 MES(pH5.7)、5 mmol·L^-1 KCl]轻轻冲洗酶解液，将混合液用40 μm的细胞筛过滤至10 mL离心管中，100×g离心3 min；轻轻吸去上清，沉淀用3 mL W5溶液清洗沉淀，100×g离心3 min；轻轻吸去上清，沉淀用适量的MMG溶液[0.5 mol·L^-1甘露醇、4 mmol·L^-1 MES (pH5.7)、15 mmol·L^-1 MgCl₂]重悬，将重悬液再次用40 μm的细胞筛过滤至新的离心管中，收集获得原生质体细胞。

1.3 原生质体产量与活力测定

采用0.1 mm血球计数板对原生质体进行计数，用0.01%二乙酸荧光素(FDA)测定细胞活性。取10 μL原生质体悬液滴于血球计数板，加盖盖玻片后置于显微镜下计数，每个样品5次重复，取平均值。原生质体产量(个·g^-1)=(5个中方格内原生质体总数/80×400×10⁴×稀释倍数)/叶片总质量(g)。取10 μL原生质体悬液和1 μL 0.01%二乙酸荧光素(FDA)，混匀后滴加于血球计数板上，静置5~10 s，加盖盖玻片后置于荧光显微镜(LEICA DFC450 C)下观察统计具有活性的原生质体数量和总原生质体数量，每个样品计数5次，取平均值。原生质体活力(%)=发绿色荧光原生质体数/原生质体总数×100%。

1.4 总RNA提取

取原生质体细胞(约10⁶个)置于RNase-free离心管中，用液氮速冻后放入-80 ℃冰箱中保存。用7种不同的方法提取杉木原生质体RNA，改良Trizol法和改良Trizol+10 μg糖原法的具体步骤参照郭萍等(2014)的方法；CTAB-LiCl、CTAB-LiCl+10 μg糖原参照Chang等(1993)方法；改良CTAB-异丙醇法和改良CTAB-异丙醇+10 μg糖原法参照谢传胜等(2009)方法；天根RNA提取试剂盒法参考说明书进行。

1.5 RNA检测

取2 μL RNA样品在1%琼脂糖凝胶(含染料GelRed)上电泳后，在凝胶成像系统(Bio-Rad GelDoc XR)下拍照，检测RNA是否降解。取1 μL RNA样品，用微量紫外分光光度计Nanodrop 2000测定RNA浓度、OD_{260 nm}、OD_{280 nm}和OD_{230 nm}的值，用于分析RNA纯度。

1.6 RT-PCR

取1 μg总RNA，采用逆转录试剂盒Prime Script^TMRT reagent Kit(TaKaRa)合成cDNA，操作按试剂盒说明书进行，合成的cDNA在-20 ℃保存备用。以合成cDNA为模板，对杉木内参基因β-actin、18S rRNA以及杉木MYB2、MYB6基因，进行PCR检测，以检验RNA的质量。β-actin的引物为F: 5′-CAGCAACTGGGATGATATGG-3′和R:5′-ATTTCGC TTTCAGCAGTGGT-3′；18S rRNA的引物为F:5′-GGAGTCTGGTCCTGTTCCGT-3′和R:5′-CGAGCCCC CAACTTTCGTTCT-3′；MYB2的引物为F:5′-GAA TGAGCAACATAAGGGAGGAG-3′和R:5′-TCTTA GGTTCCAATGTAGCCAGC-3′；MYB6的引物为F: 5′-GGAGTATGGATTTCCAAACCCAG-3′和R:5′-CGATCAACCCAAGAGCTTTCATC-3′。PCR扩增体系为20 μL，扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。

1.7 数据分析

采用Excel软件进行数据计算，采用SPSS10.0软件进行显著性检验。

2 结果与分析 2.1 原生质体分离体系的建立 2.1.1 酶组合对原生质体分离的影响

酶解法是分离植物原生质体的主要方法，酶的类型和组合是影响原生质体分离效果的重要因素。各种酶的主要作用是降解纤维素、半纤维素和果胶等细胞壁成分，从而释放原生质体细胞。因此，不同植物由于细胞壁的组成成分不同，所需酶组合及浓度也存在差异。本研究首先对不同酶组合(表 1)对杉木叶片原生质体分离的影响进行了分析。结果(图 1)表明：组合3(1.5%纤维素酶C2605+1%离析酶R-10)的酶解效果最差，其产量和细胞活力仅有0.21×10⁶个·g^-1和36%；而组合4(1.5%纤维素酶R-10+0.2%果胶酶Y-23+1%离析酶R-10)和5(1.5%纤维素酶R-10+0.4%果胶酶Y-23+1%离析酶R-10)的分离效果较好，其产量分别达到了6.6×10⁶个·g^-1和7.9×10⁶个·g^-1；但组合4分离得到的原生质体活力最高，可达到73.67%，明显高于组合5的54.04%。这说明，添加一定量的果胶酶有助于杉木叶片原生质体的分离，但过多的果胶酶会影响细胞的活性(图 1)。因此，综合考虑，1.5%纤维素酶R-10+0.2%果胶酶Y-23+1%离析酶R-10的酶组合能较好地分离杉木叶片原生质体。

2.1.2 真空处理时间对原生质体的影响

真空处理可增加酶液对植物组织的渗透，提高酶解的效果，从而影响原生质体分离的效率。利用酶液组合4(表 1)，酶解3 h，通过不同时间的真空(200 Pa)处理筛选最佳真空处理条件。结果表明，在真空处理10 min时，原生质体的活力达到最高76%，产量为6.8×10⁶个·g^-1；而真空处理20 min时，虽然原生质体产量最高，但细胞活性明显降低(图 2)。试验过程中发现真空处理与无真空处理相比，不仅细胞质量提高，而且获得的原生质体较干净，杂质明显减少，说明真空处理促进了叶片的酶解。因此，真空处理10 min是杉木叶片原生质体分离的合适条件。

2.1.3 渗透压对原生质体分离的影响

渗透压过高过低均会影响原生质体的细胞形态和活性，添加一定量的渗透稳定剂，可以保持原生质体膜的稳定，避免破裂。利用酶液组合4(表 1)，真空处理10 min后酶解3 h，通过不同浓度甘露醇调节渗透压，筛选杉木叶片原生质体制备的最佳渗透压。由图 3可知，随着甘露醇浓度的提高，原生质体的产量和活性均先升高后下降，当甘露醇浓度为0.5 mol·L^-1时，原生质体产量和活力均达到最高，分别为6.7×10⁶个·g^-1和78.3%；当甘露醇浓度达到0.6 mol·L^-1时，原生质体的活性明显降低，仅有40.91%，说明过高的渗透压可能使得原生质体破裂死亡。因此，在杉木叶片原生质体分离时，选择0.5 mol·L^-1的甘露醇浓度最为适宜。

2.1.4 BSA浓度对原生质体分离的影响

酶在降解细胞壁过程中会对原生质体造成损伤，添加一定量BSA(牛血清蛋白)可减少或防止细胞壁降解过程中对细胞器的破坏。利用酶液组合4(表 1)，加入0.5 mol·L^-1甘露醇，真空处理10 min后酶解3 h，添加不同浓度的BSA，筛选最合适的BSA添加量。结果表明，随着BSA浓度的增加，叶片原生质体的产量和活力呈现逐渐升高然后降低的趋势；在BSA浓度为0.3%时，叶片分离的原生质体产量和活力皆达到最高，分别为7.27×10⁶个·g^-1和89.2%；在BSA浓度达到0.4%时，原生质体产量和活力则显著下降(图 4)。综上所述，添加0.3%BSA有助于杉木叶片原生质体的分离。

2.1.5 酶解时间对原生质体分离的影响

酶解时间也是影响原生质体产量和活力的重要因素之一。利用酶液组合4(表 1)，加入0.5 mol·L^-1甘露醇和0.3%BSA，真空处理10 min后，通过不同酶解时间处理，筛选效率最高的酶解时间。由图 5可以看出，酶解1 h的分离效率最差，酶解2 h的分离效率最高，其获得的原生质体产量和活力最高，分别达到7.27×10⁶个·g^-1和94%；而随着酶解时间的继续延长，原生质体产量和活力呈逐步下降的趋势，且细胞碎片增多，说明酶解时间过长会对原生质体细胞产生损伤，细胞容易破裂死亡，进而影响原生质体的产量(图 5，图 6)。因此，杉木叶片最适酶解时间为2 h。

2.2 高质量杉木叶片原生质体分离体系的建立

通过上述5个不同筛选条件的试验，综合分析影响杉木叶片原生质体分离的主要因素，建立了杉木叶片原生质体的分离体系。酶液包括1.5%纤维素酶R-10、0.2%果胶酶Y-23、1%离析酶R-10、0.5 mol·L^-1甘露醇、20 mmol·L^-1 MES、20 mmol·L^-1 KCl、20 mmol·L^-1 CaCl₂和0.3%BSA。试验流程为：选取生长2~3个月的幼嫩组培苗(图 7A)，取组培苗最上端未分轮的幼嫩叶片作为酶解材料(图 7B)，将0.15~0.20 g的叶片切成1~2 mm小块放入六孔板中(图 7C)，真空处理10 min，使酶液完全渗入叶片，黑暗处轻轻振荡酶解2 h，充分释放叶片中的原生质体(图 7D)。对杉木叶片原生质体进行纯化，消除分离过程中产生的细胞碎片或杂质(图 7E)，离心后得到原生质体沉淀(图 7F)。基于上述流程，分离获得的杉木叶片原生质体形状均一、杂质少，原生质体量多(图 7G)并且活性高(图 7H)，原生质体产量可达7.0×10⁶个·g^-1以上，活力可达90%以上。

2.3 杉木原生质体RNA提取方法

由于缺乏成熟的遗传转化体系，杉木基因功能验证的研究未能深入开展。原生质体培养与转化为杉木基因功能验证提供有效的技术平台。纯度高、完整性好的RNA是进行杉木基因功能验证等分子生物学试验的重要前提之一。在前期工作中，发现杉木原生质体RNA提取存在得率低、易降解的问题，成为后续利用杉木原生质体进行分子生物学研究主要制约因素之一。因此，本研究通过7种不同的方法对杉木原生质体RNA提取的最佳条件进行了筛选，并利用管家基因和转录因子的PCR扩增对RNA质量验证。

2.3.1 RNA完整性的检测

总RNA的完整性主要通过28S rRNA与18S rRNA电泳谱带的特征判断，如果带型清晰，28S rRNA亮度高于18S rRNA，且约是18S rRNA的1.5~2.0倍，则表明所提取到的总RNA完整、未降解。将分别用7种方法提取获得的总RNA，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图 8所示。

7种方法都可以提取获得原生质体总RNA，但不同方法的效果差异极大。其中，采用改良Trizol法和改良Trizol+10 μg糖原法提取的RNA，其电泳条带呈弥散状，表明所提取的RNA有明显降解，完整性差，不符合分子生物学试验要求；采用CTAB-LiCl、CTAB-LiCl+10 μg糖原法提取的RNA，没有5S RNA条带，28S RNA条带和18S RNA条带有拖带现象，表明RNA有降解；改良CTAB-异丙醇法、改良CTAB-异丙醇+10 μg糖原法提取的RNA，28S RNA条带、18S RNA条带和5S RNA条带清晰明亮，添加糖原后RNA得率明显提高，且28S RNA的亮度大约是18S RNA的2倍，说明RNA完整性较好，可用于后续试验；采用天根RNA提取试剂盒分离获得的RNA，经电泳检测其28S RNA条带和18S RNA条带明亮，说明所提取的RNA完整性较好，可用于后续试验(图 8)。

2.3.2 RNA纯度与浓度的检测

利用Nanodrop紫外分光光度计对7种方法提取RNA样品的纯度和浓度进行检测。检测结果表明，改良Trizol法和改良Trizol+10 μg糖原法提取的RNA样品OD_{260 nm}/OD_{280 nm}值、OD_{260 nm}/OD_{230 nm}值和浓度均较低，明显达不到试验的要求；CTAB-LiCl法、CTAB-LiCl+10 μg糖原法、改良CTAB-异丙醇法和天根RNA试剂盒提取的RNA虽然纯度有所提高，但浓度仍较低；CTAB-异丙醇+10 μg糖原法提取的RNA样品纯度和浓度最高，OD_{260 nm}/OD_{280 nm}值为2.06，OD_{260 nm}/OD_{230 nm}值为2.06，浓度757.1 ng·μL^-1，均在理想范围，且10⁶个细胞RNA产量平均可达到6.89 μg，分别是改良CTAB-异丙醇法和天根RNA提取试剂盒法的1.73倍和1.58倍(表 2)

2.3.3 RNA质量的RT-PCR检验

为进一步确定所提取RNA的质量，采用特异引物对杉木内参基因β-actin、18S基因引物以及2个转录因子MYB2和MYB6进行RT-PCR扩增。结果表明，以7种方法所提取的RNA为模板，均能扩增出β-actin大小一致的目的片段，但改良Trizol法、改良Trizol+10 μg糖原法提取的RNA扩增条带较弱；而改良Trizol法、改良Trizol+10 μg糖原法提取的RNA不能扩增出18S rRNA基因目的片段，其他5种方法均能扩增出大小一致的目的片段；只有改良CTAB-异丙醇法、改良CTAB-异丙醇+10 μg糖原法和天根RNA提取试剂盒提取的RNA能扩增出MYB2和MYB6的目的片段(图 9)。综合上述完整性、纯度、浓度和RT-PCR的结果，改良CTAB-异丙醇+10 μg糖原法是杉木原生质体RNA提取的最有效手段。

3 讨论 3.1 高质量杉木原生质体的制备

分离获得大量有活力的原生质体是利用原生质体进行基因功能研究的前提之一。原生质体的产量和活力与酶的种类浓度、酶解时间和酶解渗透压等几个关键因素有密切联系。目前，酶解法被认为是分离植物叶片原生质体的最有效的手段，常用的酶有纤维素酶R-10、纤维素酶RS、半纤维素酶、果胶酶Y-23、普通果胶酶、离析酶R-10等，一般需其中2~3种酶组合使用。如采用1.5%纤维素酶R-10和0.4%离析酶R-10的酶组合，进行陆地棉(Gossypium hirsutum)叶肉原生质体分离，获得了高质量的原生质体细胞(李妮娜等，2014)；1.6%纤维素酶R-10和0.8%离析酶R-10可分离出高质量的木薯(Manihot esculenta)叶肉原生质体(Wu et al., 2017)；采用2%纤维素酶C2605和0.5%果胶酶P2611的酶液组合，成功地快速分离得到了高质量的杨树叶片原生质体(Tan et al., 2013)。本研究通过筛选，发现1.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10和0.2%果胶酶Y-23酶组合，可分离出高质量的杉木叶片原生质体(图 1，图 7)。这些研究结果说明，不同植物原生质体分离对酶的种类和浓度的要求均有所差异，这可能与不同植物细胞壁成分与结构存在差异有关。

酶解时间对原生质体产量和活力也有重要影响。酶解时间过短则细胞壁降解不充分，影响原生质体产量，酶解时间过长则会影响原生质体的活力。不同植物材料制备原生质体时，材料的状态以及酶液组合条件，酶解时间均有所不同，多数在2~16 h之间，且幼嫩组织的酶解时间一般要少于成熟组织(Tan et al., 2013；王鹏凯等, 2013；李妮娜等，2014；Wu et al., 2017)。本研究的结果表明，酶解时间对杉木叶片原生质体的产量和活力有重要的影响，酶解时间过短(1 h)原生质体细胞产量明显较低，酶解时间过长(3 h以上)原生质体细胞的活力则明显降低(图 5、图 6)，与其他植物原生质体制备有相似的规律。上述研究结果表明，原生质体制备需要在最佳酶组合、最适酶含量和最适酶解时间下完成，这样才能保证原生质体产量和活力，满足后续研究的要求。

此外，渗透压也是影响原生质体分离效果的重要因素之一，在适当的渗透压下，植物原生质体可保持完整的形态和活力。甘露醇是常用的渗透压调节剂，常被用于植物原生质体分离，以防止原生质体与外界酶液不能保持等渗时发生的原生质体破裂或皱缩的现象。研究大麦原生质体分离时发现0.3 mol·L^-1甘露醇为最适渗透压环境，原生质体细胞产量高、活力强(Bai et al., 2014)；在建立杨树叶片原生质体分离体系时，选择0.4 mol·L^-1甘露醇为最适渗透压环境，获得了高效的杨树原生质体(Guo et al., 2012)。本文研究发现，当甘露醇浓度在0.5 mol·L^-1时，杉木叶片原生质体产量和活力最高；如果甘露醇浓度过低(0.3 mol·L^-1)或过高(0.6 mol·L^-1)时，杉木原生质体的活力明显降低，说明渗透压不合适导致细胞死亡，直接影响有效原生质体细胞的产量(图 3)。

杉木组培苗叶片较草本植物叶片木质化程度高，次生代谢物多，导致酶液渗入胞间较难，分离获得原生质体易损伤。因此，针对其他可控因素，本研究对杉木叶片原生质体分离进行了进一步的优化。为了充分酶解杉木叶片细胞，对叶片组织和酶液的混合物进行了真空处理，加速酶液渗透叶片组织，缩短了酶解时间，防止因解离时间过长对细胞造成过多伤害(图 2)。解离后的杉木原生质体极易受渗透压变化、解离酶的影响而导致细胞受到损伤，影响细胞活力。因此，在原生质体的制备时，一般需在酶解液中添加一定量的BSA，起保护细胞、减少损伤的作用(王莉等，2009)。在本研究中发现，在酶解液中添加0.3%的BSA可减少细胞损伤，提高杉木原生质体细胞的产量和活力(图 4)。

3.2 原生质体的RNA提取

高质量的RNA是进行分子克隆、基因表达等分子生物学试验的基础。Trizol等商业化试剂盒是常用的植物原生质体RNA提取方法。如Lin等(2014)利用RNeasy plant mini kit提取杨树木质部原生质体的RNA，可满足RT-PCR以及RNA测序等试验的要求；Bai等(2014)利用Trizol试剂盒从大麦原生质体中提取获得了高质量的RNA，进行了基因表达分析。在本文研究中发现利用商业化试剂盒进行杉木叶片原生质体RNA提取存在得率低、易降解的问题，可能是由于用于RNA提取的杉木叶片原生质体细胞较少以及细胞中酚类等次生代谢物较多造成。因此，比较了Trizol、CTAB、LiCl和糖原等试剂提取杉木原生质体RNA的效果。结果表明，以Trizol为基础的方法提取效果最差，RNA得率很低，也检测不到完整的条带；CTAB裂解细胞、LiCl沉淀RNA的方法提取效果稍好，但得率仍较低，且未检测到小分子的RNA；天根RNA试剂盒的提取效果与之类似；CTAB裂解细胞、异丙醇沉淀RNA的方法提取效果最好，且加入适量糖原后大大提高了RNA的得率(图 8，表 2)。进一步的RT-PCR验证结果也表明，改良CTAB-异丙醇+10 μg糖原法提取的杉木原生质体RNA可用于内参基因和特异基因的检测(图 9)。因此，本研究建立的改良CTAB-异丙醇+10 μg糖原法为杉木叶片原生质体RNA提取提供了有效的解决方案。

4 结论

本研究通过酶液组合、酶解时间等关键因素的筛选以及不同RNA提取方法的比较，建立了高效的杉木叶片原生质体分离及其RNA提取的技术体系。选择培养2~3个月的杉木组培苗幼嫩叶片为外植体，在1.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10和0.2%果胶酶Y-23酶液组合，0.5 mol·L^-1甘露醇渗透压下，真空处理10 min，黑暗振荡酶解2 h，获得产量达7.0×10⁶个·g^-1、活力达90%以上的杉木原生质体。通过改良CTAB-异丙醇+10 μg糖原法可高效提取杉木原生质体RNA，10⁶个细胞RNA产量达到7 μg以上，且RNA完整性和纯度良好；RT-PCR验证表明该方法提取的RNA可满足目的基因检测的要求。利用该技术体系，可大量获得高质量的杉木原生质体，为提高杉木重要性状关键基因发掘效率及其在育种研究中的应用提供了重要基础。