植物甾醇(phytosterol)是一类以环戊烷全氢菲(甾核)为骨架的天然活性物质，广泛存在于植物根、茎、叶、花、果实和种子中(钟建华等，2005)，在降低血液胆固醇含量、抑制肿瘤和乳腺增生、防治前列腺肥大和调节免疫力等方面具有重要作用(韩军花，2001；梁艳等，2006)。坚果、谷物和豆类中植物甾醇含量较为丰富，因此目前有关大豆油、菜籽油和米糠油等油类物质中植物甾醇的研究较多(管伟举等，2006；Carmona et al., 2015)。随着科学研究特别是生命科学、油脂科学和工程技术的快速发展，植物甾醇在医学、食品、化工、饲料和植物基因工程等领域引起了广泛重视与关注(吴时敏等，2002)。

松针(pine needles)为松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物的针叶，是松类植物的主要副产品之一(刘晓庚等，2003)。我国对松针的利用有着悠久的历史，根据《食品添加剂使用标准》(GB 2760—2014)，松针油是在食品中允许使用的天然香料。现代科技对松针的成分和功能进行了大量分析研究，结果发现松针中富含叶绿素、类胡萝卜素、多种维生素、萜类化合物、植物激素和植物杀菌剂等活性成分(吕静等，2011)。松针对人体无毒性、无致畸性、无致突变性，具有采收时间长、再生速度快、天然蓄积量大等特点。近年来，国内外学者对松针研究较多，但主要集中在其化学成分，尤其是挥发油类和木脂素类等有效成分的鉴定和药理研究上(张志琴等，2011)，而对松针聚戊烯醇精制时分离出的松针甾醇研究很少。

相较于传统提取方法，超临界CO₂提取具有非化学性反应、无易燃性、安全性高、环境友好等诸多优点(Nyam et al., 2011)。提取动力学可以有效反映传质的过程和机制(郭庆启等，2014)，而有关超临界CO₂萃取松针甾醇的动力学和热力学研究未见报道。鉴于此，本文研究不同萃取压力和萃取时间对红松(Pinus koraiensis)松针甾醇提取效果的影响，通过非线性拟合提取动力学方程函数，并通过Fick定律和Gibbs方程计算萃取过程的扩散系数和自由能，以期为超临界CO₂萃取天然植物化学有效成分提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料、试剂与仪器

红松松针取自哈尔滨市阿城区亚沟林场，样品低温干燥后粉碎，密闭保存。

试剂：CO₂气体购自哈尔滨市黎明气体有限公司(食品级)；所用化学试剂均为分析纯。

试验仪器：HA121-50-02型超临界流体萃取设备，江苏南通华安公司；7820A气相色谱仪，安捷伦公司；FW135粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 试验方法 1.2.1 甾醇提取的单因素试验

准确称取200.0 g松针粉末置于萃取釜中，在一定温度和压力下萃取一段时间后，进行甾醇含量测定，平行试验3次，以确定最佳的工艺条件。在单因素试验基础上，考察不同萃取压力和萃取时间对甾醇提取效果的影响。

1.2.2 甾醇含量测定

采用气相色谱法GB/T 25223—2010/ISO12228：1999进行总甾醇含量的测定。

1.2.3 萃取动力学模型

传质过程的扩散系数采用Fick扩散系数计算，萃取过程溶液的Fick扩散公式如下：

$ E = \frac{{{C_{\rm{s}}} - {C_{\rm{t}}}}}{{{C_{\rm{s}}}}} = \frac{6}{{{{\rm{ \mathsf{ π} }}^2}}}{\sum\limits_{n = 1}^\infty {\frac{1}{{{n^2}}}{\rm{e}}} ^{ - \left({\frac{{{n^2}{{\rm{ \mathsf{ π} }}^2}{D_{{\rm{eff}}}}}}{{{r^2}}}t} \right)}}。$

式中：E为t时刻原料中残留的甾醇含量与原料总甾醇含量之比；C_s为原料中总甾醇含量；C_t为t时刻原料中可提取的甾醇含量；D_eff为有效扩散系数(m² ·h^-1)；r为扩散半径(m)。

1.2.4 热力学模型

从红松松针中提取甾醇的热力学参数可以通过下列方程估算：

$ \begin{array}{c} \ln K = - \frac{{\Delta G}}{{RT}} = - \frac{{\Delta H}}{{RT}} + \frac{{\Delta S}}{R};\\ K = \frac{{{Y_{\rm{e}}}}}{Y}。\end{array} $

式中：K为平衡常数；Y_e为给定时间时甾醇得率；Y_n为给定时间时原料中剩余的甾醇含量；R为气体摩尔常数(8.314 J ·kg^-1K^-1)；ΔH、ΔS和ΔG分别为提取时的焓、熵和自由能。

2 结果与分析 2.1 甾醇提取工艺条件的确定 2.1.1 原料粒度的确定

在萃取压力20 MPa、CO₂流量20 L ·h^-1、60 ℃条件下萃取6 h时，不同松针原料粒度与甾醇得率的关系如图 1所示。在松针粒度为20~80目时，随着原料粒度减小，甾醇得率增大；当原料粒度小于80目后，甾醇得率下降。

易军鹏等(2009)采用超临界CO₂萃取牡丹籽油，单因素试验结果表明，当初始物料的筛分粒度为80目时，得油率最高，进一步提高筛分粒度得油率呈下降趋势，分析其原因是由于筛分粒度越小，超临界流体与物料的接触比表面积越大，更有利于破坏细胞壁，降低内部传质阻力，从而提高萃取率；但筛分粒度过小，原料的堆积密度增大，会增大外部传质阻力，同时在压力作用下也有可能使原料迅速板结成块，从而影响萃取效果。张敏等(2003)研究认为原料形态对萃取效果具有双重影响，为提高物质的扩散系数应尽量减小物料尺寸，但过细的粒度会加剧超临界萃取固体界面的热效应，使传热不均匀，影响物质溶出，因此确定物料为80目松针粉筛下物。

2.1.2 萃取压力的确定

图 2为超临界萃取条件下松针甾醇得率与萃取压力的关系。当萃取压力从10 MPa上升到25 MPa时，甾醇得率随之上升，萃取压力为25 MPa时甾醇得率最高，比萃取压力为30 MPa时高11.88%。

萃取压力是超临界CO₂萃取过程中的重要参数之一，是影响萃取能力的关键因素。文震等(2006)研究不同萃取压力和温度条件下胆甾醇在超临界CO₂中溶解度的变化，结果发现随着萃取压力升高，超临界流体的密度增大，胆甾醇在超临界流体中的溶解度也随之增大。史学伟等(2010)采用超临界CO₂提取新疆棉籽油脱臭馏出物中的甾醇，单因素试验结果表明，当萃取压力为25 MPa时，甾醇提取率达到最高，进一步增大萃取压力甾醇提取率呈下降趋势，这可能是由于随着萃取压力增大，处于超临界状态下的CO₂的黏度和密度也会发生一定程度改变，有更趋向于液体状态变化的趋势，对比超临界状态其对原料的渗透性和溶解能力略有降低，从而使甾醇得率下降。

2.1.3 CO₂流量的影响

不同超临界CO₂流量状态下的松针甾醇得率如图 3所示。随着CO₂流量增加，甾醇得率上升，在流量为20 L ·h^-1时达到最大，然后下降。

高爱新等(2010)采用正交试验对超临界CO₂萃取松花粉中的植物甾醇工艺进行优化，发现随着CO₂流量增加甾醇提取率逐渐增大，但达到一定流量时提取量开始下降，其认为当CO₂流量大时，超临界流体只沿阻力小的路线穿过物料层，形成流体“短路”从而不利于目标物质提取。牟德华等(2007)研究认为，CO₂流量对超临界CO₂萃取能力有2方面作用：萃取阶段随着CO₂流量增加，传质推动力加大，传质系数和传质面积都相应增大，从而提高提取效果；但当CO₂流量增大时，部分原料易被超临界流体夹带出来，从而降低目标物质的提取效果。

2.1.4 萃取温度的确定

当萃取压力为25 MPa、CO₂流量为20 L ·h¹时，不同萃取温度条件下的甾醇得率如图 4所示。

由图 4可见，当超临界CO₂萃取温度在30~60 ℃范围内变化时，随着温度升高，甾醇得率增加；但当超过萃取温度60 ℃时，随着温度升高，甾醇得率下降。温度对甾醇溶解度的影响比较复杂(赵亚平等，1999)，在某一临界压力条件下，随着萃取温度升高，甾醇的蒸汽压增加很快，分子热运动加剧，此时蒸汽压的影响占主导地位，表现为甾醇溶解度增大；但随着温度继续升高，会引起超临界CO₂的可压缩性发生改变(Temelli et al., 2012)，温度升高所带来的扩散系数的增加要低于CO₂密度的下降，从而使物质溶解度下降。所以本研究选择60 ℃为超临界CO₂萃取松针甾醇的最佳温度。

2.2 甾醇提取动力学 2.2.1 甾醇提取动力学方程的拟合

不同萃取压力和时间对甾醇得率的影响如图 5所示。

采用OriginPro8.5软件对试验数据进行非线性拟合，结果见表 1。

回归系数(R²)越大，表明模型的拟合程度越高，即该模型越能准确描述某一条件下甾醇的提取动力学过程。由表 1可知，当超临界萃取压力为10、15和25 MPa时，最能反映甾醇得率随时间变化的动力学模型为一阶衰减指数函数(ExpDec1)模型，其对应的R²分别为0.995 5、0.978 7和0.958 4；而在萃取压力20 MPa条件下的最佳动力学模型为逻辑斯蒂(Logistic)模型，R²为0.996 8。

2.2.2 甾醇提取动力学模型的验证

为进一步验证模型的准确度，分别在萃取压力为10、15和25 MPa时采用ExpDec1模型，在萃取压力为20 MPa时采用Logistic模型，分别选择不同的萃取时间点测定甾醇得率，并将预测值与实测值进行拟合程度的比较，结果如表 2所示。

由表 2可知，甾醇得率预测值与实测值之间的拟合程度变化范围为0.936 4~0.986 0，拟合程度较高，说明拟合出的方程能够很好地反映甾醇在4种压力条件下的萃取动力学过程。

2.2.3 甾醇提取扩散过程的评价

当外部传质阻力可以忽略不计，并假设松针粉末为球形且浓度差异在径向方向上，甾醇的扩散过程可以采用Fick扩散公式描述。不同萃取压力和时间条件下对应的扩散系数见表 3。

由表 3可知，在相同萃取压力下，有效扩散系数随着萃取时间延长而减小，这是因为随着萃取时间延长，在固定相和流动相之间甾醇的浓度梯度差减小，传质的推动力逐渐消失，有效扩散程度降低；而在相同的萃取时间内，随着萃取压力增加，会增大传质的推动力，使物料中的甾醇更容易进入到超临界流体中，表现为有效扩散系数增加。

2.3 甾醇提取的热力学过程

超临界CO₂萃取松针甾醇，萃取过程中的平衡常数(K)、自由能(ΔG)如表 4所示。

平衡常数可反映传质过程进行的程度。由表 4可见，随着萃取压力和时间增大，平衡常数随之增大，说明萃取进行得更加完全。自由能变化体现的是传质进行的自发程度，自由能为负值表明超临界CO₂萃取松针甾醇的传质过程为自发过程，随着萃取压力和时间增大，自由能减小，说明萃取更容易进行。

3 讨论

功能性植物化学成分提取工艺是功能食品研究重要且基础的部分，目前相关工艺参数的确定多采用正交、响应面均匀试验设计等，这虽然能寻找到某一功能性成分在试验设计条件下的最佳参数，但无法详细阐述提取过程中各工艺参数的相互关系，使其在实际应用中具有一定的局限性。

本文在Fick定律的基础上，进行了单一组分甾醇的超临界CO₂提取，假设颗粒为球形并且有效成分提取过程的速率受扩散控制，虽然模型存在着一定的假设前提，但试验结果表明也接近实际的萃取过程。本研究可为提取工艺的现代化控量提取、电脑模拟提取及结果预测、工艺的优化研究、多成分的数学模型研究提供一定的应用指导。

4 结论

1) 通过单因素试验优化出松针甾醇超临界CO₂萃取最佳工艺条件为：松针粉原料粒度80目、萃取压力25 MPa、CO₂流量20 L ·h^-1、萃取温度60 ℃，此条件下的甾醇得率为(40.00±1.23)mg ·(100 g)^-1。

2) 对不同萃取压力条件下甾醇得率随时间的动力学变化过程采用Origin8.5软件进行拟合，发现当萃取压力为10、15和25 MPa时，一阶衰减指数函数模型拟合度最好，而当萃取压力为20 MPa时，逻辑斯蒂模型拟合度最好。验证试验结果表明，甾醇得率的最佳模型预测值与实测值之间的拟合程度大于0.936 4。

3) 自由能计算结果表明，超临界CO₂萃取松针甾醇的传质过程为自发过程，随着萃取压力和萃取时间增大，萃取更容易自发进行且传质进行得更完全。