群体遗传结构的研究对物种的保护、利用和遗传改良具有重要的理论和实践意义(Millar et al., 1992；Tana et al., 2015)。其中，遗传多样性是遗传结构的核心，在揭示物种的演化历史、进化潜力和探讨物种稀有或濒危原因方面具有重要作用(Hedrick，2004；杨梅等，2014)；同时，物种有效保护策略的制定，如优先保护种群的确定、有效的取样策略以及近交衰退种群的恢复策略等要依赖于遗传多样性和遗传结构的分析(Millar et al., 1992)。

光核桃(Amygdalus mira)(2n=2x=16)原产自中国西藏，属蔷薇科(Rosaceae)桃属(Amygdalus)，多年生落叶乔木，是桃(A.persica)野生近缘种中唯一子叶出土的原始种(王力荣等，2012；谭江平等，2012)。光核桃寿命可达千余年，是国内外珍贵的桃种质资源“活化石群”。其树体高大，早春先叶开花，花色美，多为白色或粉红色(Guan et al., 2014；刘丽等，2013)；果实营养丰富，含糖量高达11.6%，Vc、钙、铁等营养成分含量也很高；核仁富含油酸、亚油酸、硬脂酸和棕榈酸，具有极高的食用价值，还可用于治疗月经不调、跌打损伤、瘀血作痛诸症等，是食品、化妆品和制药工业等的重要原料(张姗姗等，2016；邢春等，2013)。另外光核桃具有抗逆性强、结果力高、适应性强等优良特性，可为桃种质的抗旱、抗病育种及改良提供重要的遗传基础(Yan et al., 2015)。

西藏光核桃主要分布于雅鲁藏布江河谷及其支流帕隆藏布和尼洋河流域的20个县境内，其中，雅鲁藏布江中下游的林芝和山南地区最为集中(Guan et al., 2014；刘丽等，2013)。山南地区平均海拔3 700 m，属于典型的藏南谷地，具有独特的高原温带干旱性气候(白淑英等，2015)，该地区光核桃资源年龄结构稳定，开花期3月15日至3月27日；而林芝地区平均海拔3 000 m，地貌复杂，东南部以高山峡谷为主，北部存留有较完整的高原宽谷地貌和高原丘陵地貌，在气候类型上，东南部属于热带、亚热带山地季风湿润气候，西部为高原温带季风半湿润气候，东北部为高原温带季风湿润气候(葛立雯等，2013)，该区光核桃资源年龄结构处于衰退阶段，树龄均高于10年，开花期3月7日至3月20日。

近年来，西藏地区过度开垦、基础设施修建以及乱砍滥伐，造成光核桃生境严重破坏，使其分布范围和数量逐年减少。同时，光核桃果实遭人为过度采摘和野生动物抢食，造成种群无法更新，面临濒危状况(张姗姗等，2016；邢春等，2013)。因此，研究西藏光核桃遗传多样性和遗传结构对光核桃资源合理保护与利用具有重要意义。传统的遗传多样性分析主要利用形态指标，但获得形态特征的周期较长，且易受环境及基因显隐性的影响(曾秀丽，2016)，而随着分子生物学技术的快速发展和不断完善，分子标记已被普遍应用于群体遗传多样性和遗传结构等研究中(陈新民等，2003；Bertini et al., 2006)，如SSR(simple sequence repeat)、RFLP(restriction fragment length polymorphism)、RAPD(random amplified polymorphism DNA)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)和ISSR(inter simple sequence repeat)等(Bovine et al., 2009；Hagen et al., 2002；Sánchez-Pérez et al., 2006；Vicente et al., 1998)，其中SSR分子标记具有操作简单、多态性高、覆盖面广、共显性、重复性高等优点，并且在近缘物种间具有很高的通用性，能够很好地满足遗传多样性等研究要求(Kijas et al., 1995；Du et al., 2012)。目前，SSR标记已用于光核桃遗传多样性等研究中(Mu et al., 2015；Chun et al., 2015)。但以往的研究所涉及的SSR标记和种群数量太少，缺乏代表性。因此，本文选用25个SSR分子标记对西藏地区21个光核桃天然群体进行研究，拟通过大规模样本间遗传多样性及遗传结构的详细比较和分析，揭示西藏光核桃的遗传多样性地理分布特点和群体间的遗传结构，为光核桃资源可持续利用提供科学依据。

2013年7—8月间，对西藏光核桃自然分布区进行全面的野外调查和采集，收集到21个天然群体共420个单株，具体样品分布及信息见图 1和表 1。采集新鲜、健康的叶片，立即放入预装变色硅胶的自封袋内干燥保存，用于DNA的提取。每个样品进行GPS定位，相邻株间距至少50 m。基于行政区地理分布可将调查的21个群体分为2组，分别为林芝地区(G1)和山南地区(G2)，G1组包括P1-P16群体，其中P1-P5、P14分布于低海拔区(2 921~2 979 m)，而P6-P13、P15、P16分布于中海拔区(3 111~3 394 m)；G2组包括剩余的5个群体(P17-P21)，分布于高海拔区(3 661~3 844 m)(表 1)。供试21个群体均处于野生状态，但由于西藏地区的快速开发和修建，有的群体位于农户周围或公路边，其中P7、P9和P12在农户周围，而P6、P10、P13和P15处于公路边；另外群体P1-P5位于雅鲁藏布江大峡谷自然保护区内。

图 1 西藏地区21个光核桃群体的地理位置 Figure 1 Geographic distribution of the analyzed Amygdalus mira samples from Tibet 图中字母代表群体编号，见表 1。 Letters in the figure indicate the population ID shown in Tab. 1.

表 1 西藏地区21个光核桃群体地理位置及采样信息 Tab.1 Location and sample size of the 21 populations of Amygdalus mira in Tibet

表 1 西藏地区21个光核桃群体地理位置及采样信息 Tab.1 Location and sample size of the 21 populations of Amygdalus mira in Tibet 群体 Population 编号 ID 数量 Sample size 纬度 Latitude (N) 经度 Longitude (E) 海拔 Altitude/ m 生境 Habitats 玉松Yusong P1 20 29°33′—29°37′ 96°19′—96°22′ 2 921~2 958 山谷Valley 蹦噶Bengga P2 20 29°34′—29°51′ 96°50′—96°54′ 2 931~2 962 山谷Valley 中沙Zhongsha P3 20 29°35′—29°54′ 95°44′—95°56′ 2 939~2 972 山谷Valley 丹娘Danniang P4 20 29°43′—29°58′ 95°23′—95°36′ 2 944~2 963 山谷Valley 朗嘎Langga P5 20 30°01′—30°36′ 95°35′—95°49′ 2 937~2 966 山坡Hillside 卢夏Luxia P6 20 30°06′—30°11′ 95°09′—95°13′ 3 232~3 244 路边Roadside 结果Jieguo P7 20 30°01′—30°59′ 94°47′—94°56′ 3 198~3 228 农户周围Around rural house 呛那Qiangna P8 20 29°45′—29°53′ 94°34′—94°59′ 3 295~3 311 高坡High slope 才巴Caiba P9 20 29°57′—30°05′ 94°24′—94°57′ 3 286~3 302 农户周围Around rural house 布久Bujiu P10 20 29°16′—29°50′ 94°04′—94°22′ 3 129~3 169 路边Roadside 多当Duodang P11 20 29°43′—29°49′ 94°18′—94°26′ 3 238~3 256 山坡Hillside 公众Gongzhong P12 20 29°30′—29°44′ 94°32′—94°39′ 3 111~3 152 农户周围Around rural house 巴嘎Baga P13 20 29°49′—29°55′ 93°56′—94°04′ 3 294~3 338 路边Roadside 岗嘎Gangga P14 20 29°20′—29°29′ 94°16′—94°24′ 2 953~2 979 山坡Hillside 桌木Zhuomu P15 20 29°16′—29°24′ 93°13′—93°53′ 3 359~3 394 路边Roadside 桃花Taohua P16 20 29°54′—30°01′ 93°30′—93°41′ 3 297~3 318 高坡High slope 夏客Xiake P17 20 29°31′—29°39′ 92°43′—92°54′ 3 661~3 703 山坡Hillside 色麦3 Semai 3 P18 20 29°15′—29°23′ 92°30′—92°39′ 3 778~3 793 山谷Valley 色麦6 Semai 6 P19 20 29°22′—29°30′ 92°00′—92°59′ 3 836~3 844 山谷Valley 桃花2 Taohua 2 P20 20 29°25′—29°31′ 91°18′—91°32′ 3 802~3 839 高坡High slope 吞米Tunmi P21 20 29°08′—29°22′ 92°05′—92°17′ 3 667~3 708 山坡Hillside

采用改良的CTAB法(冯晨静等，2005)提取光核桃基因组DNA，1%的琼脂糖凝胶电泳及微量分光光度计检测其纯度后，将浓度调至20 ng·μL^-1，-20 ℃保存备用。

采用25对多态性高、特异性强、重复性高的SSR引物(表 2)，对光核桃种质进行遗传多样性分析。PCR扩增反应体系为20 μL的混合体系，由0.2 μL的2×Taq Plus Master Mix，1 μL的DNA模板(10~20 ng·μL^-1)，2 μL的10×buffer，0.5 μL的正向引物和反向引物(0.8 μmol·L^-1)，0.5 μL的dNTP(0.25 mol·L^-1)，0.5 μL的DMSO(10%)和14.8 μL的无菌去离子水(ddH₂O)组成；PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，按各引物退火温度(50 ~ 55 ℃)退火30 s，72 ℃延伸30 s，30次循环；72 ℃终延伸5 min。PCR扩增产物经由ABI 3500XL(Applied Biosystems，USA)DNA分析仪进行检测，利用Gene-Marker软件(Soft Genetics LLC，USA)读取每个位点的片段大小。

表 2 25个SSR位点在供试光核桃种质中的遗传多样性指数^① Tab.2 The genetic diversity parameters of 25 SSR primers in all tested collections of Amygdalus mira

表 2 25个SSR位点在供试光核桃种质中的遗传多样性指数① Tab.2 The genetic diversity parameters of 25 SSR primers in all tested collections of Amygdalus mira 位点Loci Na Ne I He Ho PIC FIS FST Fna 引物获得文献 Reference of primers PMS67 15.0±2.4 5.9±0.8 1.63±0.32 0.62±0.15 0.55±0.12 0.74±0.13 0.11±0.03 0.13±0.01 0.07 Cantini et al., 2001 BPPCT-002 5.0±0.9 2.3±0.3 1.08±0.21 0.53±0.11 0.47±0.10 0.62±0.10 0.13±0.04 0.15±0.01 -0.09 Yamamoto et al., 2002 MA013a 14.0±2.3 5.7±0.7 1.60±0.23 0.64±0.12 0.58±0.11 0.73±0.13 0.10±0.03 0.13±0.01 0.12 Wang et al., 2002 UDP98-412 8.0±1.3 3.9±0.6 0.81±0.21 0.38±0.08 0.33±0.08 0.46±0.10 0.15±0.02 0.19±0.01 -0.05 Dirlewanger et al., 2002 BPPCT-030 14.0±2.7 5.1±0.5 1.57±0.11 0.62±0.11 0.56±0.11 0.68±0.12 0.11±0.02 0.08±0.01 -0.13 Yamamoto et al., 2002 PMS2 9.0±2.1 4.2±0.3 1.80±0.32 0.63±0.13 0.59±0.13 0.80±0.11 0.07±0.01 0.08±0.01 -0.09 Xie et al., 2006 M9A 5.0±0.8 2.3±0.3 0.74±0.21 0.45±0.11 0.40±0.09 0.51±0.12 0.11±0.03 0.11±0.01 -0.10 Wang et al., 2002 Pchgms4 5.0±1.3 1.8±0.2 0.18±0.04 0.31±0.10 0.26±0.08 0.32±0.10 0.16±0.02 0.12±0.02 -0.12 Sosinski et al., 2000 MA039A 6.0±1.5 2.7±0.3 1.09±0.33 0.43±0.11 0.37±0.10 0.59±0.11 0.14±0.01 0.52±0.03 -0.03 Wang et al., 2002 M7A 7.0±1.0 2.3±0.3 1.44±0.31 0.66±0.12 0.59±0.11 0.76±0.12 0.11±0.03 0.13±0.02 -0.11 Wang et al., 2002 pchgms12 9.0±1.3 4.5±0.2 1.16±0.22 0.51±0.13 0.49±0.12 0.60±0.13 0.05±0.01 0.12±0.01 -0.06 Sosinski et al., 2000 ASSR2 6.0±0.9 2.7±0.3 1.25±0.21 0.60±0.14 0.49±0.12 0.69±0.12 0.18±0.03 0.12±0.02 -0.10 Cipriani et al., 1999 BPPCT-004 5.0±0.6 2.3±0.2 0.70±0.23 0.43±0.11 0.37±0.10 0.48±0.11 0.13±0.01 0.11±0.01 -0.07 Yamamoto et al., 2002 BPPCT-001 14.0±1.9 5.5±0.5 1.67±0.35 0.62±0.13 0.49±0.12 0.72±0.12 0.20±0.02 0.14±0.02 0.13 Yamamoto et al., 2002 BPPCT-017 9.0±1.6 4.8±0.3 1.21±0.13 0.55±0.15 0.46±0.12 0.65±0.13 0.16±0.03 0.15±0.02 -0.06 Yamamoto et al., 2002 BPPCT-025 15.0±1.7 7.5±0.2 2.07±0.34 0.72±0.13 0.64±0.13 0.82±0.13 0.11±0.02 0.13±0.01 -0.04 Yamamoto et al., 2002 PceGA25 10.0±1.3 4.6±0.2 1.23±0.30 0.51±0.11 0.42±0.11 0.62±0.11 0.17±0.02 0.18±0.02 -0.09 Testolin et al., 2000 pchgms25 7.0±0.7 2.2±0.3 1.36±0.24 0.62±0.11 0.54±0.11 0.72±0.12 0.13±0.01 0.14±0.02 0.13 Sosinski et al., 2000 UDP97-402 7.0±1.1 3.3±0.3 1.33±0.23 0.56±0.11 0.50±0.10 0.71±0.12 0.11±0.02 0.22±0.03 -0.06 Dirlewanger et al., 2002 UDP98-405 6.0±0.8 3.0±0.3 0.60±0.12 0.29±0.10 0.23±0.08 0.33±0.10 0.20±0.02 0.17±0.02 -0.07 Dirlewanger et al., 2002 UDP98-406 9.0±1.3 4.0±0.3 1.22±0.12 0.59±0.11 0.53±0.11 0.66±0.12 0.10±0.01 0.10±0.01 -0.10 Dirlewanger et al., 2002 UDP98-408 5.0±1.2 2.1±0.3 0.72±0.12 0.39±0.12 0.32±0.10 0.48±0.11 0.18±0.02 0.18±0.02 -0.11 Dirlewanger et al., 2002 UDP98-409 14.0±1.8 4.8±0.2 1.39±0.22 0.55±0.13 0.48±0.11 0.64±0.13 0.13±0.02 0.14±0.02 -0.10 Dirlewanger et al., 2002 UDP96-003 6.0±0.6 2.0±0.2 1.20±0.23 0.51±0.11 0.46±0.10 0.67±0.12 0.10±0.01 0.13±0.01 -0.06 Dirlewanger et al., 2002 UDP96-019 4.0±0.8 1.5±0.2 0.66±0.10 0.41±0.12 0.36±0.10 0.45±0.11 0.12±0.01 0.11±0.01 0.11 Dirlewanger et al., 2002 均值Mean 8.6±1.4 3.6±0.3 1.19±0.22 0.52±0.12 0.46±0.11 0.62±0.12 0.13±0.02 0.15±0.02 0.09 ①Na：等位基因；Ne：有效等位基因；I：Shannon’s信息指数；He：期望杂合度；Ho：观察杂合度；PIC：多样性信息指数；FIS：居群内近交系数；FST：遗传分化系数；Fna：无效等位基因频率。Na: Number of alleles; Ne: Number of effective alleles; I: Shannon’s information index; He: Expected heterozygosity; Ho: Observed heterozygosity; PIC: Polymorphism information content; FIS: Inbreeding coefficient; FST: Genetic differentiation coefficient; Fna: Frequency of null alleles.

将检测到的SSR片段大小，录入Excel表格中，采用Cervus 3.0.7软件(Kalinowski et al., 2007)计算各SSR位点的无效等位基因(null alleles)频率。采用GenAlEx 6.501 (Peakall et al., 2006)软件计算等位基因数(N_a)、有效等位基因数(N_e)、期望杂合度(H_e)、观察杂合度(H_o)、Shannon’s多样性指数(I)、群体内部近交系数(F)、等位基因频率、特有等位基因数、Nei’s遗传距离(D)和基因流(N_m)。为了衡量群体遗传分化程度，利用GenAlEx 6.501统计各位点的近交系数(F_IS)和遗传分化系数(F_ST)等F-统计量(Nei，1973)。

基于Arlequin v3.1(Raffaele et al., 2000)软件检测群体的Hardy-Weinberg(HWE)平衡，并计算SSR引物的多态性信息含量(PIC)值，评价所用25对SSR引物在光核桃遗传多样性分析中的多态性信息指数，其值越大，表明多态性越大，越适合遗传多样性研究。

利用STRUCTURE(Pritchard et al., 2000)软件的贝叶斯聚类法对西藏光核桃群体遗传结构进行分析；将类群数K设置为2 ~ 21，开始时不作数迭代(length of burn-in period)和MCMC(Markov Chain Monie Carfo)值均设为100 000次，重复运行20次。采用ΔK值最大原则选取最佳K值(Evanno et al., 2005)，结果由STRUCTURE Harvester(Earl et al., 2012)在线(http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/)计算，并通过CLUMPP(Mattias et al., 2007)软件重复抽样分析，由Distruct软件(Noah et al., 2002)绘制群体遗传结构图。

为了估计群体间及群体内部的遗传差异，使用Arlequin v3.1(Raffaele et al., 2000)软件对物种水平的遗传变异进行分子方差分析(AMOVA)。为了检验西藏光核桃天然群体间是否存在地理隔离效应及群体间遗传变异是否受海拔梯度的影响，采用GenAlEx 6.501 (Peakall et al., 2006)软件进行Mantel检测(Zhe et al., 2014)，分析其遗传距离与地理距离、海拔梯度的相关性。采用NTSYS pc version 2.10(Rohlf，1994)软件，以Nei’s遗传距离(D)(Nei，1973)作为参数，完成非加权成组配对算术平均法(UPGMA)的树状聚类分析。主坐标分析(PCoA)以Nei’s遗传距离为参数，用GenAlEx软件(Peakall et al., 2006)完成。

25对SSR引物中，有6对引物的无效等位基因(null alleles)频率为正值，但其频率均小于0.2，表明供试25对引物在后续遗传多样性分析中的结果准确可靠(表 2)。25对SSR引物在420份光核桃样品中，共检测到214个等位基因，平均每位点8.6个等位基因(N_a)和3.6个有效等位基因(N_e)(表 2)。Shannon’s信息指数(I)变异范围为0.18 ~ 2.07，平均为1.19。物种水平上的观察杂合度(H_o)和期望杂合度(H_e)分别为0.46和0.52。25个SSR位点的F统计量检测显示，西藏光核桃的F_ST为0.15，F_IS为0.13，说明西藏光核桃遗传分化程度适中。各位点多态信息含量指数(PIC)在0.32 ~ 0.82之间，平均为0.62，表明所选SSR引物均能有效揭示光核桃遗传多样性。

21个光核桃天然群体遗传多样性分析结果(表 3)显示，各群体遗传多样性水平存在差异。其中，群体P17遗传多样性最高，而群体P18和P19遗传多样性最低。在21个群体中，除P4、P17和P20群体外其余的18个群体均含有特有等位基因，特有等位基因数为1 ~ 4，其中P18和P19群体较特殊，具有的特有等位基因数最多(4和3)，然而遗传多样性却最低。

表 3 21个光核桃群体的遗传多样性^① Tab.3 Genetic diversity of the 21 populations of Amygdalus mira

表 3 21个光核桃群体的遗传多样性① Tab.3 Genetic diversity of the 21 populations of Amygdalus mira 群体Population 数量Amount Na Ne I He Ho F Np HWE P1 20 3.3 ± 0.6 2.4 ± 0.5 0.89 ± 0.09 0.52 ± 0.05 0.43 ± 0.05 0.18 ± 0.09 1 * P2 20 3.8 ± 0.5 2.3 ± 0.4 0.92 ± 0.11 0.52 ± 0.08 0.44 ± 0.05 0.16 ± 0.04 1 ns P3 20 3.8 ± 0.4 2.6 ± 0.3 1.00 ± 0.13 0.57 ± 0.09 0.49 ± 0.08 0.13 ± 0.06 1 ns P4 20 3.6 ± 0.5 2.2 ± 0.3 0.89 ± 0.08 0.50 ± 0.07 0.45 ± 0.03 0.11 ± 0.04 0 ns P5 20 3.5 ± 0.6 2.2 ± 0.5 0.91 ± 0.04 0.53 ± 0.05 0.44 ± 0.03 0.17 ± 0.08 2 ns P6 20 3.8 ± 0.4 2.5 ± 0.3 0.95 ± 0.09 0.53 ± 0.04 0.47 ± 0.04 0.12 ± 0.07 2 * P7 20 3.5 ± 0.5 2.6 ± 0.4 1.00 ± 0.07 0.58 ± 0.05 0.47 ± 0.03 0.19 ± 0.07 2 * P8 20 3.5 ± 0.6 2.3 ± 0.4 0.90 ± 0.07 0.52 ± 0.05 0.44 ± 0.04 0.15 ± 0.07 1 ns P9 20 3.6 ± 0.6 2.5 ± 0.4 0.99 ± 0.08 0.57 ± 0.05 0.43 ± 0.03 0.24 ± 0.08 2 * P10 20 3.6 ± 0.5 2.4 ± 0.5 0.94 ± 0.07 0.54 ± 0.04 0.44 ± 0.03 0.19 ± 0.07 2 * P11 20 4.2 ± 0.6 2.7 ± 0.4 1.05 ± 0.09 0.58 ± 0.04 0.49 ± 0.04 0.15 ± 0.05 2 ns P12 20 4.1 ± 0.7 2.6 ± 0.5 1.03 ± 0.08 0.57 ± 0.04 0.42 ± 0.04 0.26 ± 0.05 2 * P13 20 4.2 ± 0.6 2.5 ± 0.4 0.99 ± 0.08 0.54 ± 0.04 0.45 ± 0.04 0.16 ± 0.06 2 * P14 20 4.3 ± 0.7 2.6 ± 0.5 1.03 ± 0.08 0.57 ± 0.04 0.46 ± 0.04 0.19 ± 0.05 1 ns P15 20 4.1 ± 0.7 2.5 ± 0.5 1.00 ± 0.08 0.56 ± 0.03 0.42 ± 0.05 0.25 ± 0.04 1 * P16 20 3.9 ± 0.7 2.4 ± 0.4 0.94 ± 0.09 0.53 ± 0.04 0.42 ± 0.04 0.20 ± 0.06 1 ns P17 20 6.7 ± 0.5 4.7 ± 0.6 1.57 ± 0.05 0.63 ± 0.02 0.56 ± 0.01 0.11 ± 0.03 0 ns P18 20 2.1 ± 0.4 1.7 ± 0.5 0.49 ± 0.09 0.30 ± 0.05 0.22 ± 0.05 0.26 ± 0.10 4 * P19 20 2.5 ± 0.4 1.8 ± 0.4 0.58 ± 0.09 0.34 ± 0.05 0.32 ± 0.05 0.06 ± 0.10 3 * P20 20 3.6 ± 0.4 2.3 ± 0.5 0.99 ± 0.07 0.52 ± 0.04 0.43 ± 0.04 0.17 ± 0.03 0 ns P21 20 4.9 ± 0.4 2.3 ± 0.4 1.01 ± 0.07 0.51 ± 0.04 0.47 ± 0.03 0.08 ± 0.03 2 ns 均值Mean 20 3.8 ± 0.5 2.5 ± 0.4 0.95 ± 0.08 0.52 ± 0.05 0.44 ± 0.04 0.17 ± 0.06 1.50 ns ①F：群体内近交系数；Np：特有等位基因。HWE：哈迪-温伯格平衡；*：P < 0.05，显著偏离于哈迪-温伯格平衡; ns：不偏离于哈迪-温伯格平衡。F: Inbreeding coefficient within populations; Np: Number of private alleles. HWE: Hardy-Weinberg Equilibrium; *: P < 0.05, Significantly deviated from the Hardy-Weinberg Equilibrium; ns: Non-significantly deviated from the Hardy-Weinberg Equilibrium.

西藏光核桃各群体内近交系数(F)均大于零(0.06 ~ 0.26)，平均为0.17。Hardy-Weinberg平衡(HWE)检测显示，有10个群体(P1、P6、P7、P9、P10、P12、P13、P15、P18和P19)显著偏离于HWE。

利用STRUCTURE分析西藏光核桃群体遗传结构，当K=3时ΔK值为最大(图 2)，表明420份光核桃材料具有3个不同类群(图 3)，虽然类群间存在一定的遗传混杂(基因交流现象)，但仍存在较明显的分化。对420个个体的Q(即第i材料基因组变异源于第K群体的概率)值进行统计，有394个(占93.8%)个体遗传组分相对单一(Q＞0.6)，并被划分到相应的3个类群中。第1类群(黄色基因池)包括6个低海拔区群体(P1、P2、P3、P4、P5和P14)，其中有7个个体(5.8%)Q值小于0.6；有15个个体来自其他类群被划分至该组，包括P6、P11、P17和P20的各2份，P12的4份以及P15的3份。第2类群(橙色基因池)包括10个中海拔区群体(P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13、P15和P16)，有11个个体(3.4%)Q值小于0.6，有33个个体来自其他类群被划分至该组，包括P1和P21的各3份，P2和P5的各2份，P3和P4的各6份，P14的5份，P17和P20的各1份，P19的4份。第3类群(蓝色基因池)包括5个高海拔区群体(P17、P18、P19、P20和P21)，有12个个体(12%)的遗传组分较混杂，Q值小于0.6。

图 2 最佳类群数K与推断值ΔK的关系b Figure 2 Relations between the rational groups number K and estimated value ΔK

图 3 基于STRUCTURE分析的西藏光核桃21个群体的遗传结构 Figure 3 Genetic structural map of 21 wild populations of Amygdalus mira in Tibet based on STRUCTURE analysis 图中相同的颜色代表同一个类群；黄、橙和蓝色分别代表类群Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。 The same color indicates the same group; Yellow, orange and blue in figure represent the groupⅠ, Ⅱ and Ⅲ, respectively.

为了进一步探讨西藏光核桃群体间的遗传关系，分别利用21个群体和420份个体的Nei’s遗传距离进行UPGMA聚类分析(图 4A)和主坐标分析(PCoA)(图 4B)，其结果与STRUCTURE划分结果基本一致，均将供试群体分为3组，大部分地理位置相近、海拔高度相近的群体依次划分至同一类群中。这与Mantel检测结果相吻合，即西藏光核桃群体遗传距离与地理距离(r=0.50，P＜0.01)(图 5A)、海拔梯度(r=0.61，P＜0.01)(图 5B)呈显著正相关。表明西藏光核桃群体间存在地理距离和海拔梯度的遗传变异，具有明显的地理区域特性，群体间存在地理隔离效应。

图 4 基于遗传距离的光核桃21个群体的UPGMA聚类分析(A)及420个个体的主坐标分析(B) Figure 4 UPGMA dendrogram (A) based on genetic distance of the 21 populations of Amygdalus mira and Principal coordinates analysis (B) based on genetic distance of 420 individuals of A. mira

图 5 供试光核桃群体的遗传距离与地理距离(A)、海拔梯度(B)的相关性 Figure 5 Correlation between genetic distance and geographic distance (A), geographic altitudes (B) of all sampled populations of Amygdalus mira

通过分子方差分析(AMOVA)(表 4)可知，西藏光核桃遗传变异主要来自群体内个体间(83.7%)，群体间的遗传变异占16.3%。检测各群体间的遗传分化(F_ST)和基因流(N_m)(表 5)可知，21个光核桃群体间的遗传分化系数为0.01 ~ 0.36，基因流水平为0.44 ~ 20.33，其中相同遗传组群体间遗传分化较小，基因交流较频繁，而来自不同遗传组群体间的分化较大，基因交流较少，这与划分结果相吻合；21个群体中有4对群体间的F_ST值较小，分别为P10-P11(0.02)、P10-P13(0.02)、P12-P15(0.01)和P18-P21(0.01)。3个遗传组中C1-C3(0.14)和C2-C3(0.13)的遗传分化程度较高。

表 4 25个光核桃群体的分子方差分析 Tab.4 Analysis of molecular variance of 25 populations of Amygdalus mira

表 4 25个光核桃群体的分子方差分析 Tab.4 Analysis of molecular variance of 25 populations of Amygdalus mira 变异来源 Source of variation 自由度 d.f. 离差平方和 Sum of squares 方差分量 Variance components 方差分量比例 Percentage of variation (%) 群体间Among populations 20 1 172.81 1.30 16.3 群体内Within populations 819 5 480.55 6.69 83.7 总Total 839 6 653.36 7.99 100.0

表 5 光核桃21个群体间遗传分化系数(F_ST，对角线下方)和基因流(N_m，对角线上方) Tab.5 Genetic differentiation (F_ST, below diagonal) and gene flow (N_m, above diagonal) between 21 populations of Amygdalus mira

表 5 光核桃21个群体间遗传分化系数(FST，对角线下方)和基因流(Nm，对角线上方) Tab.5 Genetic differentiation (FST, below diagonal) and gene flow (Nm, above diagonal) between 21 populations of Amygdalus mira 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 1 3.52 6.58 2.60 3.25 2.27 2.05 1.39 1.39 1.43 1.89 2.78 1.83 8.62 1.88 1.63 0.46 0.57 0.87 1.23 0.96 2 0.07 2.81 1.84 3.97 1.45 2.72 1.92 1.61 1.17 1.65 1.87 1.65 6.25 1.43 1.32 0.48 0.55 1.08 1.17 0.87 3 0.04 0.08 3.97 2.75 1.98 2.00 1.30 1.66 1.72 2.38 2.75 2.16 8.93 2.17 1.91 0.69 0.87 1.01 2.02 1.47 4 0.09 0.12 0.06 1.85 1.88 1.56 1.10 1.62 1.91 3.29 2.63 2.72 7.35 2.23 2.36 0.50 0.66 1.17 1.42 1.03 5 0.07 0.06 0.08 0.12 1.23 2.23 1.23 1.52 1.10 1.60 1.62 1.33 5.68 1.24 1.28 0.44 0.48 1.03 1.21 0.78 6 0.10 0.15 0.11 0.12 0.17 2.05 1.85 1.77 1.35 1.76 4.46 1.76 2.45 9.62 1.80 0.58 0.79 1.19 1.11 1.37 7 0.11 0.08 0.11 0.14 0.10 0.11 4.81 4.46 1.95 3.29 2.75 3.09 3.38 1.95 3.01 0.53 0.60 1.05 1.25 0.98 8 0.15 0.12 0.16 0.19 0.17 0.12 0.05 3.73 1.57 2.14 1.91 2.25 1.66 1.53 1.87 0.61 0.79 1.04 1.13 1.23 9 0.15 0.13 0.13 0.13 0.14 0.12 0.05 0.06 2.55 3.33 2.38 4.46 1.95 1.83 3.43 0.58 0.71 1.21 1.24 1.11 10 0.15 0.18 0.13 0.12 0.19 0.16 0.11 0.14 0.09 13.16 1.84 14.71 1.85 1.97 11.91 0.45 0.57 0.84 0.94 0.82 11 0.12 0.13 0.10 0.07 0.14 0.12 0.07 0.11 0.07 0.02 2.75 11.36 3.25 3.25 11.36 0.49 0.64 1.02 1.16 1.01 12 0.08 0.12 0.08 0.09 0.13 0.05 0.08 0.12 0.10 0.12 0.08 2.55 3.91 20.33 2.50 0.59 0.80 1.30 1.25 1.43 13 0.12 0.13 0.10 0.08 0.16 0.12 0.08 0.10 0.05 0.02 0.02 0.09 2.63 2.53 2.55 0.48 0.63 1.08 1.10 0.98 14 0.03 0.04 0.03 0.03 0.04 0.09 0.07 0.13 0.11 0.12 0.07 0.06 0.09 2.45 2.45 0.53 0.63 1.30 1.56 1.04 15 0.12 0.15 0.10 0.10 0.17 0.03 0.11 0.14 0.12 0.11 0.07 0.01 0.09 0.09 2.53 0.52 0.71 1.06 0.98 1.19 16 0.13 0.16 0.12 0.10 0.16 0.12 0.08 0.12 0.07 0.02 0.02 0.09 0.09 0.09 0.09 0.46 0.60 0.99 1.03 0.94 17 0.35 0.35 0.27 0.34 0.36 0.30 0.32 0.29 0.30 0.36 0.34 0.30 0.34 0.32 0.33 0.35 5.21 2.54 2.52 2.66 18 0.31 0.31 0.22 0.28 0.34 0.24 0.29 0.24 0.26 0.31 0.28 0.24 0.28 0.28 0.26 0.29 0.05 2.84 2.29 17.86 19 0.22 0.19 0.20 0.18 0.20 0.17 0.19 0.19 0.17 0.23 0.20 0.16 0.19 0.16 0.19 0.20 0.09 0.08 4.90 11.36 20 0.17 0.18 0.11 0.15 0.17 0.18 0.17 0.18 0.17 0.21 0.18 0.17 0.19 0.14 0.20 0.20 0.09 0.10 0.05 3.47 21 0.21 0.22 0.15 0.20 0.24 0.15 0.20 0.17 0.18 0.23 0.20 0.15 0.20 0.19 0.17 0.21 0.09 0.01 0.02 0.07

遗传多样性是物种长期生存和保持进化的基础(Nei，1978；Botstein et al., 1980)。一般而言，特有种、濒危种的遗传多样性水平较低(Hamrick et al., 1996)，但也有些保持较高水平的遗传多样性(Richter et al., 1994)。本研究中，25个SSR位点的平均H_e和H_o分别为0.52和0.46；21个群体平均H_e和H_o分别为0.52和0.44，高于此前利用SSR标记分析西藏光核桃的遗传多样性[H_e=0.340 (Mu et al., 2015); H_e=0.352 (Chun et al., 2015)]以及同属的桃(H_e=0.46，H_o=0.34)(Maria et al., 2010)和扁桃(Amygdalus communis)(H_o=0.339，H_e=0.219)(Tahan et al., 2009)，而低于同一生活史的一些物种，如西藏核桃(Juglans regia)(H_e=0.605)和西藏泡核桃(Juglans sigillata)(H_e=0.678)(王滑，2010)，表明西藏光核桃属于中度杂合物种，遗传多样性处于中等水平。

光核桃属于多年生、虫媒花、自交不亲和植物，广泛分布于青藏高原，能够适应各种恶劣环境(王力荣等，2012；Guan et al., 2014)，其遗传多样性水平应与多数学者认为的分布广、适应性强、多年生、异交物种的遗传多样性水平较高的特点(Hamrick，1990；刘华波等，2012)相契合；然而，本研究中，西藏光核桃遗传多样性处于中等水平，究其原因，可能是光核桃寿命较长，分布范围较为广泛，长期的演化使其沉积了丰富的遗传变异，只是后期人为乱砍滥伐造成光核桃生境的破坏，分布逐渐呈现片段化，但片段化时间较短，遗传多样性还未丧失。

生境片段化是影响群体遗传结构和遗传多样性的重要因素，生境片段化会降低有效种群大小，使物种的适应能力下降，引起有些等位基因的消失，而降低群体的多样性(Templeton et al., 1990；Saunders et al., 1991；Young et al., 1996)。作者在调查时发现，西藏光核桃各群体的生境差异较大，部分群体在其分布区内形成优势种(如P11和P17)，分布连续，数量较多；有些群体则生境退化或遭人为破坏严重，导致个体数量减少，种群分布呈现片段化(如P7、P8、P13、P15、P18和P19)，后者必然会限制群体间和群体内部的基因流，降低其遗传多样性水平，并会加剧群体遗传分化。通过Hardy-Weinberg平衡(HWE)检验显示，有10个群体显著偏离于HWE，其中有7个群体是位于人类活动较频繁的农户周围或公路边，表明西藏光核桃受人为活动的干扰比较明显。另一方面，种群规模的下降也会使种群的近交频率增加，从而降低该物种遗传多样性及生存能力(Emerson，2002；Yao et al., 2011)。通常异花授粉植物不接受自花授粉或近亲交配，但因生境片段化或地理因素，花粉传播被限制，随机交配系统被打破，群体中容易产生近亲繁殖(Murawski et al., 1991；1992)。本研究结果也表明21个群体近交系数均大于0(0.06 ~ 0.26)，群体内均存在近亲繁殖，使物种缺乏足够的杂合子(H_o＜H_e)来维持高水平的遗传多样性。类似结果同样发现于其他树种中，如中国野生山杏(Armeniaca sibirica)由于群体内存在较高的近亲繁殖，表现杂合子不足(Zhe et al., 2014)；山茱萸(Cornus officinalis)群体内存在较多的半同胞间的交配，导致山茱萸群体杂合子不足(Hadziabdic et al., 2012)。综上可知，西藏光核桃群体遗传多样性处于中等水平，这主要与西藏光核桃生境片段化、自身生物学特性及悠久的演化历史相关。

遗传分化系数(F_ST)是反映群体遗传结构的重要指标(Hamrick et al., 1996)。本研究中，AMOVA分析(F_ST=0.16)显示，西藏光核桃遗传分化水平适中，遗传变异主要来自于群体内个体间。这与谭江平等(2012)研究结果相一致，也与多年生木本植物的遗传变异规律相符(Yeh et al., 1995；Hamrick et al., 1996；Gillies et al., 1999)，即群体内遗传变异水平较高，而群体间遗传变异水平较低。相比于其他一些近缘种，山杏遗传分化系数(F_ST)为0.06(Zhe et al., 2014)、豆梨(Pyrus calleryana)的F_ST为0.088 (Mitsui et al., 2010)、秋子梨(Pyrus ussuriensis)的F_ST为0.072 (Tana et al., 2015)等，西藏光核桃表现较高的遗传分化，不仅山南地区和林芝地区间存在较为明显的差异，林芝区域群体间也表现明显的遗传分化。造成这一结果的可能原因是西藏地区高山环绕，峡谷深切，山川骈列，地形十分复杂，使物种区域分布的山脉阻隔特点突出，导致各居群间的隔离(万雪琴等，2009)；因此，山南、林芝地区之间较大的遗传差异可能源自中部地区山川及河流地势所产生的地理隔离。另外，光核桃群体间的海拔差异较大(2 921~3 844 m)。一般情况下，尤其是高山地区，海拔差异构成不同的水、光、热、土壤梯度，使植物生长的自然地理环境多样化，也使植物对环境产生复杂的适应性变化而加剧群体间的遗传分化(Hirao et al., 2004；Ortego et al., 2012)。UPGMA聚类分析和STRUCTURE群体遗传结构分析均表明，绝大部分群体均按海拔高度相近而聚为一类。如本研究中，群体P14没有与地理位置相近的P11、P12和P13等群体划分在一起，而与地理位置较远但海拔高度相近的5个群体(P1-P5)划分至一起。推测群体P1-P5和P14在类似的海拔高度，受到类似的自然选择，发生了相似的等位变异，从而表现相似的遗传结构。

遗传多样性和遗传结构的研究是制定物种保护措施的前提条件(Newton et al., 1999)。西藏光核桃群体遗传多样性处于中等水平，但目前受人类活动的影响较严重，应及时采取保护措施，保证西藏光核桃资源的合理利用及有效保护。

本研究结果表明西藏光核桃可划分为3个保护单位(C1、C2和C3)。C1类群的5个群体位于国家自然保护区，保护有保障；今后的重点应放在C2和C3类群的保护。其中，应对C2和C3类群中少数地区遗传多样性高的群体进行优先就地保护，如C2中的P11群体、C3中的P17群体。另外，西藏光核桃受人为影响较严重，尤其人类集中的农户周围和公路边的群体遭破坏较严重，如P6、P7、P9、P10、P12、P13和P15，这些群体在保护中也应重视种群基因流，加强抚育管理。对于一些树龄较大的种质，应挂牌进行保护。同时也要迁地保护一些特异群体，避免一些特殊基因的消失，如P18和P19群体遗传多样性低却含有较多的特异等位基因。

本文利用25对SSR引物对西藏地区21个光核桃群体的420份个体进行遗传多样性及遗传结构分析，共得到214个等位基因，多态信息含量(PIC)为0.62。西藏光核桃遗传多样性适中，群体间存在地理隔离效应和海拔梯度的遗传变异。西藏光核桃受人为干扰较严重，遗传分化程度较高，且个体间的近亲繁殖较频繁。STRUCTURE分析、UPGMA分析和主坐标分析(PCoA)均将21个群体划分为3个类群，可将西藏光核桃分为3个保护单元；应限制人为活动对西藏光核桃的破坏，实施就地保护的同时，建立光核桃种质资源库，促进不同居群间的基因交流，保护西藏光核桃的遗传多样性。