松材线虫病(pine wilt disease)又称松树萎蔫病或松树枯萎病, 是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)寄生在松树体内引发的一种特大毁灭性森林病害, 该病蔓延速度快, 染病植株死亡率高, 被称为“森林癌症”, 严重危害着森林生态安全, 并给林业带来巨大经济损失(Wang et al., 2010; Vicente et al., 2012)。松属(Pinus)中被松材线虫危害过的植株并不会全部死亡, 即使在同一树种中也存在抗松材线虫病的基因型(杨宝君等, 1995), 利用抗病品种替代易感品种是防治森林病害最经济、最有效的途径。日本于1978年率先开始抗性育种, 通过一套完整的选育程序, 选育出208个日本赤松(P.densiflora)和110个日本黑松(P.thunbergii)抗性无性系, 死亡率较未选择林分分别提高16%和40%(Tada et al., 2004)。我国在20世纪90年代也开展了抗松材线虫育种, 目前已选出一批抗性种源、家系和无性系(刘伟等, 1995; 徐福元等, 1998; 杨宝君等, 1999; 章健等, 2012), 但对松树的抗性机制了解较少。

活性氧(ROS)作为一种重要信号分子在植物体生命活动的多方面发挥着关键作用(Barceló et al., 1970)。活性氧包括超氧阴离子(${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$)、单线态氧(¹O₂)、过氧化氢(H₂O₂)和羟基自由基(·HO)等, 在正常代谢过程中(如光合作用和呼吸作用), 植物细胞内ROS的产生和清除是平衡的; 但当植物体遭遇外来生物和非生物胁迫时, ROS的产生和代谢将失去平衡, 产生过量的ROS(Neill et al., 2002)。体内ROS含量对寄主的作用具有双重性:一是ROS过度积累可破坏质膜、蛋白和DNA等生物大分子, 直接导致植物细胞死亡(Lamb et al., 1997); 二是适量的ROS可作为信号转导分子激活多种生物进程, 如植物对病虫害防卫反应和细胞程序性死亡(Foyer et al., 2005)。${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$和H₂O₂已被证实参与了植物的防卫反应(Vivancos et al., 2010; Camejo et al., 2011); 而且研究发现, 一氧化氮(NO)也是调控植物抗感病信号的重要信号分子(Gouvea et al., 1997), 在虫或病原菌侵染引起的氧化猝发过程中, NO可通过增强H₂O₂诱导的死亡效应来阻止虫或病原菌从侵染位点扩散(Durner et al., 1998)。也有研究认为, 胞内H₂O₂、${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$以及NO的平衡在植物防卫过程中起决定性作用(Neill et al., 2002)。此外, NO还可通过Ca²⁺途径调控植物对病原体的防御反应, NO刺激胞内的Ca²⁺库, 将胞内的Ca²⁺释放到胞质中, 诱导寄主细胞对外界胁迫做出应答(Clark et al., 2010)。但这些信号分子在松树防御松材线虫病过程中所起的作用仍不明确。

马尾松(Pinus massoniana)速生、耐干旱瘠薄、适应性强, 是我国主要的速生丰产用材林和高产脂用林造林树种之一, 广泛分布于南方14个省(区、市), 依据第八次全国森林资源调查结果马尾松林分面积达1 001万hm², 为松材线虫主要危害对象之一。因此, 本研究以通过2次强度接种选育出来的高抗和易感马尾松无性系为试验材料, 研究ROS、NO和Ca²⁺等多种防御信号转导分子在接种松材线虫后不同时间点的变化差异, 解析在防御反应中信号转导分子的动态变化特征, 为阐明马尾松的抗性机制提供理论依据。

试验地选在安徽省林业科学研究院苗圃, 地理坐标为31°51′N, 117°10′E, 属亚热带湿润季风气候, 年均气温15.7 ℃左右, 年均日照时数2 100 h左右, 年均降水量1 000 mm左右, 全年无霜期228天左右, 四季分明, 自然条件优越。

根据安徽省林业科学研究院选育出的马尾松松材线虫病抗性无性系抗性指数, 选择高抗无性系“休宁-5”、易感无性系“黄山-1”各30株, 皆为5年生。在天气晴好、气温维持在30 ℃左右时接种, 接种时间为2015年7月25日, 线虫为高致病性“广株3B”和“全4”混合株系。接种时采用斜切接种法:在当年生枝条结节下5 cm处, 沿枝干斜切入木质部, 切口深约1 mm、长约5 cm, 随后用锯齿在裸露的木质部上刮几下(模拟天牛咬食痕, 同时防止接入的悬浮液下滑), 迅速将线虫悬浮液200 μL(约含10 000头线虫)均匀注入切口处。对高抗和易感马尾松剩余的各15株注入等量蒸馏水, 作为接种松材线虫的对照。

依据前期接种试验观察, 易感马尾松在接种后15天部分针叶开始出现变黄现象, 接种30天有接种枝条枯萎死亡, 接种后50天后会大部分死亡。为了检测不同时间松材线虫侵染情况, 在接种后第1、7、15、30、50天时截取接种口上方(靠近枝条顶端)2~7 cm茎段、下方(靠近树干方向)2~7 cm茎段和侧枝结节以上5 cm茎段, 剪碎后利用贝尔曼漏斗法分离松材线虫(Dai et al., 2014), 统计不同时间的松材线虫数量。

本试验依次在接种后第1、3、7、15、30天取距离接种口位置相同处的当年生嫩枝针叶, 每个时间点取同一无性系的3株作为生物学重复。采集的嫩叶立即投入液氮中, 置于-80 ℃冰箱中保存。

采用KI法测定马尾松叶片中H₂O₂含量, 羟氨氧化法测定超氧阴离子自由基(${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$)浓度(王爱国等, 1990), 硝酸还原酶法测定马尾松叶片中NO含量, 酶标仪法测定Ca²⁺浓度。

采用SPSS19软件对数据进行方差分析及Ducan多重比较, 采用EXCEL 2007软件作图。

接种松材线虫后, 不同抗性马尾松体内松材线虫数量差异显著。其中, 易感马尾松体内松材线虫数量在接种后1~15天时呈暴发式增长, 15天时达到最大值(5 173条), 随着针叶变黄枯萎程度加重, 存活的松材线虫数量降低; 而高抗马尾松在整个侵染过程中, 体内未检测到松材线虫或仅有未达到统计学意义的少量松材线虫存在(图 1)。

图 1 不同抗性马尾松体内松材线虫数量 Figure 1 Number of nematode in different resistant P.massoniana R.高抗无性系接种口 Inoculation spot in high resistant clones; S.易感无性系接口 Inoculation spot in susceptible clones. up.上方 Above the spot; down.下方 Below the spot; beside.侧枝 Lateral branch.

在易感马尾松接种口上方、下方和侧枝均检测到松材线虫, 但不同部位的松材线虫数量存在较大差异。其中, 接种口下方茎段中松材线虫最多, 表明松材线虫首先沿成熟树脂道迅速侵袭树干并逐渐蔓延至其他部位。侵袭后期, 枝条逐渐枯萎死亡, 松材线虫迁移至其他部位, 数量降低。高抗马尾松接种口上方、下方和侧枝茎内均未检测到松材线虫。

对同一时间点不同处理间马尾松针叶内H₂O₂含量进行方差分析, 发现各时间点差异均达到显著或极显著水平(表 1)。在接种后第1天, 高抗马尾松(R_I)和易感马尾松(S_I)针叶内H₂O₂含量均显著升高, 约高于各自对照处理(R_w和S_w)的48.04%和21.70%, 且R_I针叶内H₂O₂含量高于S_I。随后S_I针叶内H₂O₂含量继续升高, 在接种后第3、7、15和30天, H₂O₂含量均显著高于R_I和S_W, 且在第15天达到最高, 约为269.8 μmol·g^-1。而R_I针叶内H₂O₂含量虽然在接种后第1、3、7天显著高于其对照R_w, 但之后H₂O₂含量下降, 在接种后第15、30天, 针叶内H₂O₂含量已与R_w相近, 差异不显著(图 2)。该结果表明, 高抗马尾松对多余的H₂O₂具有更强的清除能力。

表 1 不同抗性马尾松针叶内信号分子含量方差分析^① Tab.1 Variance analysis of signal molecular content in different resistant P.massoniana

表 1 不同抗性马尾松针叶内信号分子含量方差分析① Tab.1 Variance analysis of signal molecular content in different resistant P.massoniana 信号分子 Signal molecular 1 d 3 d 7 d 15 d 30 d 自由度 df 均方 MS F 自由度 df 均方 MS F 自由度 df 均方 MS F 自由度 df 均方 MS F 自由度 df 均方 MS F H2O2 3 2 554 4.34* 3 2 338 4.15* 3 8 024 5.09* 3 12 082 8.76** 3 9 360 7.44** ${\rm{O}}_2^{\bar \cdot } $ 3 19.12 4.57* 3 6.46 3.64* 3 17.65 3.55* 3 22.36 7.84** 3 41.68 15.19** NO 3 265 097 5.61* 3 1 973 169 4.09* 3 2 960 896 4.87* 3 143 425 8.72** 3 772 053 4.01* Ca2+ 3 7.55 11.32** 3 0.48 4.31* 3 2.32 4.30* 3 12.25 5.97* 3 0.545 4.36* ① *:在0.05水平差异显著  Significant difference at 0.05 level; **:在0.01水平差异显著  Significant difference at 0.01 level.

图 2 不同抗性马尾松针叶内H2O2含量的多重比较 Figure 2 Multiple comparison of H2O2 content at five time points in different resistant P.massoniana 字母表示同一时间点不同处理间的差异显著性(P < 0.05)  The different letters showed significant difference between mean values (P < 0.05). RI、RW:高抗无性系及对照 High resistant clone and its CK. SI、SW:易感无性系及对照 Suceptible clone and its CK.

对同一时间点不同处理间马尾松针叶内${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$含量进行方差分析, 发现各时间点差异也均达到显著或极显著水平(表 1)。接种松材线虫后, R_I和S_I针叶内${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$含量均显著升高, 在不同时间点, ${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$含量均显著高于其对照R_w和S_w。图 3显示, 在接种后第1、3、7和15天, 马尾松针叶中${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$含量在R_I和S_I中的变化趋势一致, 虽然R_I针叶内${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$含量略高于S_I, 但差异不显著。在接种后第30天, S_I针叶内${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$含量继续升高, 达14.9 μmol·g^-1, 约为S_w的2.01倍; 而R_I针叶内${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$含量则在接种后第30天开始下降, 为S_I的70.5%。该结果表明, 高抗马尾松受到松材线虫侵染后, 在后期对细胞内${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$含量具有更强的控制力, 不会导致针叶内${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$含量继续升高。

图 3 不同抗性马尾松针叶内${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$含量的多重比较 Figure 3 Multiple comparison of ${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$ content at five time points in different resistant P.massoniana

对同一时间点不同处理间马尾松针叶内NO含量进行方差分析, 发现各时间点差异也达到显著或极显著水平(表 1)。接种松材线虫后, S_I针叶内NO含量显著升高, 其中在接种后第7天含量最高, 达3 468 μmol·g^-1, 之后NO含量下降, 但仍显著高于S_w, 比对照高31.74%;R_I针叶内NO含量虽有升高, 但除在接种后第30天R_I显著高于R_w外, 其他时间点R_I与R_w差异未达到显著水平。同时, S_I针叶内NO含量始终高于R_I, 在接种后1~30天, 含量为R_I的11.91%~54.98%, 其中在接种后第15天S_I与R_I的差异达到最大(图 4)。

图 4 不同抗性马尾松针叶内NO含量的多重比较 Figure 4 Multiple comparison of NO content at five time points in different resistant P.massoniana

接种松材线虫后第1天, R_I和S_I针叶内Ca²⁺含量均显著升高, 分别是其对照的2.78和2.62倍(图 5)。相对于接种后第1天, R_I内Ca²⁺含量在接种后第3天和第7天呈降低趋势, 与R_w差异不显著, 含量仅为1.17和1.74 μmol·g^-1, 而在接种后第15天, Ca²⁺含量又迅速升高至最大值5.66 μmol·g^-1, 至接种后第30天, R_I针叶内Ca²⁺含量已恢复到R_w水平。而S_I变化趋势与R_I基本相似, 呈现“升-降-升-降”的趋势, 但在接种后各个时间点, S_I针叶内Ca²⁺含量均高于S_W。接种松材线虫后, R_I与S_I在各个时间点差异也较显著, 其中在接种后第1天和第15天, R_I针叶内Ca²⁺含量显著高于S_I, 但在接种后第3、7和30天, S_I针叶内Ca²⁺含量显著高于R_I。

图 5 不同抗性马尾松针叶内Ca2+含量的多重比较 Figure 5 Multiple comparison of Ca2+ content at five time points in different resistant P.massoniana

松树的抗病性可能与其产生的次生代谢物质有直接关系, 作为传递植物受胁迫的信号分子, 如活性氧(ROS)、NO和Ca²⁺等受到越来越多的关注(Pereira et al., 2011; Hossain et al., 2014; Zhang et al., 2014)。俞禄珍等(2013)研究H₂O₂在黑松-松材线虫早期互作应答中的调控作用时发现, 黑松受到松材线虫侵染后, 体内产生大量的H₂O₂, 影响寄主体内抗氧化保护酶活性、苯丙烷代谢途径的表达, 加速感病症状。何龙喜等(2010)对不同抗性树种感染松材线虫后针叶内H₂O₂含量进行分析, 发现高度感病树种黑松和中度感病树种马尾松在接种后针叶内H₂O₂含量远高于高度抗病树种火炬松(Pinus taeda)。本研究表明, 马尾松接种松材线虫后, 体内活性氧(ROS)、NO和Ca²⁺含量均发生了显著变化, 其中高抗和易感马尾松在接种后初期, H₂O₂和${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$含量均显著升高, 但在接种后30天高抗马尾松针叶内H₂O₂和${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$含量逐渐恢复到正常水平或较之前时间点有降低的趋势, 而易感马尾松针叶内H₂O₂和${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$含量则一直很高。适量的ROS可作为信号转导分子激活多种生物进程, 但过多的ROS对植物细胞具有毒害作用(Miller et al., 2005)。接种后30天, 高抗马尾松形态特征无明显变化, 而易感马尾松叶子开始变黄, 因此可推测高抗马尾松对多余的ROS具有更强的清除能力, 以维持植株正常生理代谢。

NO与ROS互作可以共同诱导细胞过敏性反应和细胞膜质过氧化, 这是植物抗病反应中的关键性生理生化过程(何龙喜, 2011)。Tada等(2004)研究发现, 细胞过敏反应从原发细胞向周围扩增过程中, 需要细胞间NO介导。NO浓度适量时会抑制过氧化物酶和过氧化氢酶的活性, 由此降低膜脂的过氧化, 对植物起到保护作用, 而高浓度的NO则会与ROS一起形成具有强氧化性的过氧亚硝酸, 对植物细胞具有毒害作用(Beligni et al., 1999)。本研究中易感马尾松接种松材线虫后, 针叶内NO即大量增加, 但高抗马尾松接种松材线虫后第1、3、7、15天, 其NO含量与对照差异不显著, 仅在接种后30天NO含量才显著高于对照, 但显著低于S_I。何龙喜等(2012)对不同松树感染松材线虫后针叶内NO含量的变化进行了分析, 认为接种松材线虫后, 高度感病树种黑松针叶内NO平均积累量最高, 而高度抗病树种火炬松虽然针叶内NO含量也升高, 但与黑松相比, 其积累量较低, 与本研究结果基本一致。Garcia等(2006)研究发现, 在植物防御中, H₂O₂和NO协同作用参与植物对外界刺激的防御反应, 二者都可能参与了细胞的程序性死亡过程。因此可推测易感马尾松由于体内ROS和NO剧增, 对植物细胞造成伤害; 而高抗马尾松在松材线虫入侵后, 通过增加ROS和NO的浓度来激活防御反应, 且多余的ROS可被有效清除, 使马尾松的生理代谢保持在正常水平。

细胞内Ca²⁺浓度的升高多在瞬间完成, 信号传递后又迅速恢复到静息状态(钙稳态), 否则对细胞将造成严重伤害。这种伤害主要表现在2方面:一是可能会使细胞内其他信号的传递受阻, 造成细胞代谢过程发生障碍, 二是如果细胞内长时间保持较高浓度的Ca²⁺, 则容易与细胞代谢过程产生的磷酸根发生化学反应, 产生大量磷酸钙沉淀, 这对细胞结构和功能是极为不利的(陈斌等, 2015)。本研究中高抗马尾松受到侵袭后, 立即产生大量Ca²⁺, 之后Ca²⁺恢复到稳态, 接种后15天Ca²⁺再次激增, 但在接种后30天Ca²⁺再次趋于稳态, 植株体内生理生化过程基本恢复正常。易感马尾松接种松材线虫后, 针叶内Ca²⁺含量始终高于对照, 可能对植株的伤害不断加重, 最终导致植株枯萎死亡, 证实了了金钢等(2007)和和徐亮(2013)对黑松和马尾松的研究结果。在遭受外界刺激时, 能够迅速恢复其细胞内Ca²⁺稳态的植物, 通常有着更强的抵御环境胁迫能力(龙书生, 2011), 本研究中高抗马尾松针叶内Ca²⁺在迅速增加后立即恢复稳态, 其抵御松材线虫的能力要高于易感马尾松, 验证了植物快速恢复Ca²⁺稳态的重要性。综上, ROS、NO和Ca²⁺在马尾松对松材线虫侵染的防御反应中均具有至关重要的作用, 表明马尾松抗松材线虫病途径是一个相互交织、彼此关联的复杂网络。

接种松材线虫后, 高抗与易感马尾松针叶内H₂O₂、${\rm{O}}_2^{\bar \cdot }$和Ca²⁺含量均会迅速升高, 作为信号分子诱导植株产生防御反应, 其中高抗马尾松能有效控制信号分子在体内的含量, 最终恢复到正常生理代谢水平, 植株表型基本不发生变化; 而易感马尾松不能有效控制, 多余的ROS和Ca²⁺会对植株产生毒害, 使针叶变黄进而导致植株枯萎死亡。接种松材线虫后高抗马尾松针叶内NO含量的变化基本不明显, 但易感马尾松针叶内在每个时间点均积累了过多的NO, 不利于植株正常代谢。