马尾松(Pinus massoniana)是我国南方山地主要的针叶用材树种，也是我国最主要的采脂树种。其自然分布范围为21°41'—33°56'N，102°10'—123°14'E，覆盖17个省、自治区和直辖市，其中广东、广西、湖南、湖北、四川、重庆、贵州、浙江、福建和江西是马尾松主要的松脂产区(秦国峰等，2012)。马尾松自20世纪50年代开始进行遗传改良，主要致力于通过提高树木的生长和木材性状来获得较大的木材产量(俞新妥，1959；周志春等，1993；金国庆等，2008；刘青华等，2009)。目前，生长性状的遗传改良已进入马尾松选育第3轮(谭小梅等，2011)。与生长和木材性状相比，产脂性状的改良起始于20世纪80年代。当时我国建立了全国马尾松高产脂育种协作组，并选择了许多优树(郑元英，1988；张建忠等，2010)。随后，由于缺乏国家项目资助，松脂改良项目进展缓慢。2011年获批的林业公益性行业科研专项(批准号：201104020)和2012年获批的国家科技支撑课题(批准号：2012BAD01B02)重启了全国马尾松松脂的遗传改良工作。

松脂作为松节油(单萜和倍半萜烯)和松香(二萜树脂酸)的混合物，主要贮存在针叶树的根、茎、叶和球果中(Trapp et al., 2001)。在我国，常采用割皮法从松树中采集松脂。作为工业化学品的重要天然来源，松脂广泛用于溶剂、清漆、香精香料、合成橡胶、消毒剂、涂料、印刷油墨和防水材料等化工产业中(Coppen et al., 1995；Kelkar et al., 2006)。并且松脂组分在针叶树的防御体系中也起着重要的作用(Strom et al., 2002；Martin et al., 2005；Miller et al., 2005)，在遭受生物或非生物刺激后，树木从树脂道释放出松脂，同时又诱导合成新的松脂(Nagy et al., 2000；McKay et al., 2003)。此外，松脂还可以作为优质的液体生物燃料(Harvey et al., 2010)。

在针叶树中，产脂力的变异是可遗传的，通过高产脂优树的选择可获得较高的遗传增益(Tadesse et al., 2001；Roberds et al., 2003；Westbrook et al., 2013；刘青华等，2013)。而松脂组分含量在种内也显示出较大的变异性(Smith，2000)。其中，一些组分可被用作生物化学标记来区分物种和种群(Gallis et al., 1997；Manninen et al., 2002；Pureswaran et al., 2004；Arrabal et al., 2005；Karanikas et al., 2010)。然而，现有研究很少估计松脂性状在产地间和产地内的变异模式和变异大小，了解产地间和产地内的遗传变异大小是林木改良的第1步(White，2007)。生长和产脂力是马尾松的2个重要的经济性状，在改良过程中希望能同时改良这2个性状，或改良1个性状时至少对另外1个性状无不利影响。因此，在制定育种策略前，估计生长与产脂力的相关性非常重要。刘青华等(2013)通过子代测定估计了马尾松生长和产脂力之间的遗传相关性，认为生长和产脂力之间存在显著的正相关。但由于受群体大小及试验点个数的影响，估计的遗传相关系数可能会有偏差，因此，生长与产脂力的遗传关系仍为研究重点。另外，研究产脂力与松脂组分含量间的关系也至关重要，鉴于松脂组分含量的稳定性，可以选用与产脂力相关的松脂化学组分对松脂产量进行早期选择，以缩短育种周期。

松脂中各种组分的功能不同。研究表明，蒎烯(包括α-蒎烯和β-蒎烯)含量的高低是松材线虫能否在树体内定殖的关键(王璇等，2017)。α-蒎烯具有抗肿瘤、抗真菌、抗过敏及改善溃疡的药理作用。β-蒎烯可被开发为替代石油燃料的潜在生物燃料。蒎烯及其衍生物均是难得的化工原材料，被广泛应用于香料、医药、食品、农业、高分子材料、功能材料等行业中(朱福鸿等，2015；Peralta-Yahya et al., 2012)。枞酸型树脂酸是松香的主要成分，主要包括枞酸、长叶松酸、新枞酸等。研究结果表明枞酸具有优良的消炎活性，长叶松酸在较高浓度下可以作为昆虫拒食剂，新枞酸是一种天然的抗肿瘤试剂。但是现有的分离方法的得率和纯度普遍不高，因此在改进分离提纯方法的同时应该注重提高原料中高枞酸型树脂酸的含量(Fernandez et al., 2001)。松脂中各化学组分的含量决定着松脂的品质(Rodrigues-Correa et al., 2013)。尽管目前松脂的价格不受树体内每种组分含量的影响，但是在育种改良中有必要了解这些组分与松脂品质之间的关系，以便进一步选育生长好、产脂力高、松脂品质优良的马尾松无性系。

本研究的主要目的是：1)确定松脂的定性和定量组成；2)估计马尾松产地间和产地内的生长、产脂力和松脂组分性状的遗传变异；3)估计生长、松脂组分和产脂力之间的遗传和表型相关性，以及组分之间的遗传和表型相关性。这些结果对未来马尾松多性状的遗传改良具有非常重要的价值。

1 材料与方法 1.1 试验林概况

马尾松无性系试验林位于浙江省淳安县姥山林场(29°32'34"N，119°04'04"E，海拔152 m)，包括从9个省份选出的300多个无性系(基因型)。这些无性系母株为根据生长表型优势从天然林或起源清楚的人工林中选出来的优树，优树间无亲缘关系。1985年4月，从优树的上冠收集健壮的枝条作为接穗。随后，采用髓心形成对接法将接穗嫁接到2年生的砧木上。第2年，利用这些嫁接苗造林。试验为双因素巢式分组设计，10次重复。株行距4.0 m×4.0 m。所在地年平均降水量1 430 mm，年平均气温17.0 ℃。土壤由中等肥力的黄土组成。在试验之前没有采割过松脂。

1.2 生长性状和产脂力的调查

选取来自广西、贵州、安徽、浙江和江西5个省的50个健康的马尾松无性系(表 1)进行调查，以了解样株的生长性状(胸径、树高、冠幅、冠高和树干通直度)和产脂性状(产脂力、松脂组分)。其中每个产地选择10个无性系。对于每个无性系，选择3~5个分株测量生长性状和产脂力。然后，随机选择其中的3个分株来检测松脂组分。树干通直度评估使用5级标度(1=非常弯曲，2=弯曲，3=一般，4=通直，5=完全通直)。

割脂高度约在1.3 m处，采用下降式单刀采脂法，割面与树干成45°，负荷率约为25%，侧沟深入木质部约0.5 cm，步距约0.1 cm。为了减少对树体的伤害，2017年7— 9月，每月选择相同时间连续割脂3次，2次割脂间隔时间大约24 h，每月最后一次割脂24 h后收脂并称质量。产脂力以每日每厘米刀口的松脂产量计算。没有使用刺激剂来诱导松脂渗出。

1.3 松脂收集及化学组分分析

同时收集新鲜的松脂于5 mL聚乙烯管中，在松脂达到管体积的2/3后，立即封闭管口放入冰盒中，随后转移到-20 ℃的冰箱中保存直至测定。利用气相色谱-质谱联用技术(GC/MS)分析和测定各样木松脂的组分含量，以揭示产地间和产地内无性系间松脂的组成特性和变异。为了定量分析，样品根据Karanikas等(2010)的方法制备。其中使用异丁基苯作为单萜和倍半萜的内标，使用十七烷酸作为二萜的内标。随后，使用Agilent 6890N气相色谱与HP-5MS色谱柱(内径0.25 mm，长度30 m，膜厚0.25 μm)和Agilent 5975B质谱联用，通过GC/MS检测马尾松无性系的松脂组分含量。对于GC，烘箱温度程序为60 ℃，保持2 min，以2 ℃·min^-1的速率升至80 ℃，保持5 min，随后以4 ℃·min^-1的速率升至280 ℃，保持5 min。使用氦气作为载气，流速为1 mL ·min^-1，注射器温度设定在260 ℃，注射量为1 μL，分流比为1: 50。电子电离质谱分析条件为电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，连接处温度280 ℃。通过将获得的片段与NIST08质谱搜索库(National Institute of Standards and Technology，USA)进行匹配来识别松脂化学组分，然后根据各种组分和内标的面积确定各组分在松脂中的含量(单位为mg·g^-1)。

1.4 数据分析

产脂力以每日每厘米刀口的松脂产量计算。

单株材积(V)按公式V=0.000 062 341 803×D_1.3^{1.856 149 7}×H^{0.956 849 2}估算(周志春等，1993)。

所有性状通过以下线性模型进行方差分析：X_ijk=μ + P_i + C_j(i) + ε_ijk。式中：X是表型个体观察值，μ是总体平均值，P_i是第i产地的效应(i=1，2，…，5)，C_j(i)是第i个产地内的第j个无性系的效应(j=1，2，…，10)，ε_ijk是残差。除总体平均值外，产地间和产地内无性系的影响被认为是随机的(沈熙环，1990)。

使用SAS软件(SAS Institute，Inc.，SAS/STAT软件，版本8)的PROC GLM进行ANOVA分析以检验产地间与产地内无性系间的差异。在上述线性模型的基础上，还估计了σ_p²(产地间)、σ_c(p)²(产地内)和σ_e² (残差)的方差分量。

方差分析和遗传相关分析时，树干通直度经$ \sqrt X $数据转换。

变异系数(CV)根据以下公式估算：

$ {\rm{CV}} = \frac{{\sqrt {\sigma _{\rm{e}}^2} }}{\mu } \times 100\% 。$

两性状之间的遗传相关系数r_G由下式计算：$ {r_{\rm{G}}} = \frac{{{\mathop{\rm cov}} \left({x, y} \right)}}{{\sqrt {\sigma _x^2 \cdot \sigma _y^2} }} $。式中，cov(x, y)是性状x和y之间的遗传协方差，σ_x²和σ_y²分别是性状x和性状y的遗传方差分量。使用DPS(数据处理系统，v14.5)估算遗传相关系数和表型相关系数并检验其显著性。

为了对这些松脂组分进行分类，利用松脂组分之间的遗传相关系数，使用遗传算法(UPGMA)，在MATLAB得到的欧氏距离基础上，进行聚类分析。

2 结果与分析 2.1 马尾松生长和产脂力的遗传变异

方差分析结果(表 2)表明，产地对胸径、树高、单株材积和冠高(HLC)有显著影响(P < 0.05)。产地效应占4种性状总变异的40.13%~52.89%。广西产地的无性系种群的胸径、树高、单株材积和HLC最大，分别为32.36 cm、15.87 m、0.575 6 m³和7.31 m(表 3)。江西产地的无性系种群的胸径最小，而安徽产地的无性系种群的树高最小(表 3)。产地内无性系间的胸径、树高、单株材积和HLC无显著差异。对于树干通直度，产地内和产地间的无性系变异均未达到显著水平(P＞0.05)，平均通直度得分为4.57分。对于冠幅和产脂力，遗传变异的主要来源是产地内无性系间的变异，特别是产脂力。与胸径和树高相比，产脂力存在较大的表型变异(49.01%)。

2.2 马尾松松脂组分的遗传变异

去除与NIST08(National Institute of Standards and Technology，USA)匹配度低于90%、含量低于0.01%和未确定的组分外(表 4)，共检出26种松脂组分。其中，单萜7种，倍半萜11种，二萜8种。在单萜中，含量最高的组分是α-蒎烯，约占85%，其次是β-蒎烯和柠檬烯。在倍半萜中，含量最高的组分是长叶烯和β-石竹烯，其总量达到倍半萜烯的82%。在二萜中，含量最高的是长叶松酸/左旋海松酸，其次是新枞酸和枞酸。对松脂化学组分方差分析(表 4)发现，除了α-蒎烯、山达海松酸、长叶松酸/左旋海松酸和8, 12-枞二烯酸外，其他组分的含量变异在产地间或产地内无性系间差异显著(P < 0.05)。其中，产地内无性系间的变异是松脂组分遗传变异的主要来源，其方差分量在30.93%~80.89%之间，表明松脂组分在马尾松无性系间存在着丰富的变异，通过无性系选择可对这些组分进行遗传改良。表 4还显示，这些组分的遗传变异占表型变异的47.86%~84.85%，即这些松脂组分主要受遗传因子控制。

2.3 马尾松生长、产脂力与松脂组分的相关性

由前文分析可知，树干通直度在产地内和产地间的差异不显著，因此在进行性状相关分析时剔除了该性状。不同性状之间的表型和遗传相关性如表 5所示。结果显示几乎所有性状的遗传相关系数都比相应的表型相关系数高。产脂力与胸径显著正相关(r_G=0.674 3)，而产脂力与树高、单株材积、冠高和冠幅的遗传相关系数没有达到显著水平，系数范围为0.206 4~0.408 6。这意味着胸径可作为产脂力的间接选择指标。

在26种松脂组分中，仅观察到6种组分与产脂力存在显著相关水平(P < 0.05)(表 6)。产脂力与三环烯、长叶蒎烯、枞酸和新枞酸的相关性呈中度至弱度的负相关，表型相关系数为-0.476 9~-0.410 3，遗传相关系数为-0.312 6~-0.279 2。产脂力与莰烯、异海松酸含量呈中度至弱度的正相关，表型相关系数分别为0.507 3和0.439 8，遗传相关系数分别为0.341 0和0.297 6。

2.4 马尾松松脂组分间的相关性

对松脂中各组分含量间的相关性进行分析，结果表明，48.7%的组分间表型相关性达到显著水平(P < 0.05)(图 1)，且遗传相关系数要高于对应的表型相关系数。在单萜类别中，主要组分α-蒎烯与月桂烯、柠檬烯和龙脑具有中度到高度的正相关性(r_G=0.519 1~0.753 8)(图 1)。而这4种组分却与三环烯具有负的遗传相关性。在倍半萜类别中，大部分组分间呈正相关关系，如倍半萜中含量最高的长叶烯与长叶环烯、衣兰烯、洒剔烯和反式-β-金合欢烯相关性极高，相关系数为0.915 5~1.000 0。在二萜中，山达海松酸与海松酸和异海松酸呈极显著的正相关(r_G为0.840 7和0.640 8)。除此之外，二萜间较强的或中等的遗传相关性都是负的。

在不同类别的萜类间，可以发现几个明显的遗传规律。单萜和倍半萜组分间几乎所有的相关系数皆为负值，尤其莰烯几乎与所有倍半萜呈中度至强度负遗传相关。二萜中山达海松酸与大部分单萜具有中度至强度的正遗传相关性，而与所有倍半萜具有负相关性。为了揭示26种组分之间的关系，使用UPGMA进行等级聚类分析。如图 1所示，可将26种组分清楚地分为2组，分别为Ⅰ和Ⅱ。簇Ⅰ主要由倍半萜组成，簇Ⅱ由单萜和二萜组成。

2.5 基于生长、产脂力和松脂组分的马尾松无性系选择

按以下标准进行优良无性系的多性状选择：产脂力与胸径的乘积超过所有测试无性系的平均值，树干通直度评分超过4，以此作为生长好兼产脂力高的优良无性系入选标准。在生长和松脂产量的基础上，分别进行高品质松节油和松香的选择。指标要求为α-蒎烯、枞酸型树脂酸含量超过所有测试无性系的平均值。总共选择出11个高蒎烯和9个高枞酸型树脂酸含量的优良无性系(表 7)。

3 讨论 3.1 松脂和生长性状的遗传变异

种植在不同地区的优树，其遗传差异是无法评价的，因为遗传和环境对表型的影响较复杂(White et al., 2007)。为了量化遗传变异，需将这些优树收集在同一试验点，开展遗传测定。以往的许多研究已经证明，针叶树种的生长性状和产脂力皆受到中度到强度的遗传控制(Westbrook et al., 2013；刘青华等，2013；Dean，2010；Weng et al., 2015)，这在本研究中也得到了证实。来自广西产地的无性系生长最快，与马尾松种源试验结果(刘青华等，2009)一致。然而，由于本试验所采用的无性系母株是依据生长性状和树干通直度选择的优树，因此对于生长性状其产地内无性系的方差分量估计值会偏小。树干通直度在产地和产地内的差异也不显著。对于产脂力，产地间的差异不明显，大部分遗传变异来自产地内无性系间的变异。表明在松脂产量的改良过程中，应更多地关注产地内优树的选择。

松脂化学组分在种内无种类差异，只有含量差异(Jantan et al., 1999)。在本研究中，所有样本的化学成分几乎完全相同，共检测到26种松脂组分。在这些组分中，α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、长叶烯、海松酸、山达海松酸、异海松酸、长叶松酸/左旋海松酸、脱氢枞酸、枞酸和新枞酸是主要成分，这和古研等(2011)和王振洪等(2007)关于马尾松的研究报道的结果一致。然而，与此前对这一树种的研究相比，本研究中检测出更多的微量成分。在26种松脂组分中，在产地间和产地内无性系间存在显著的变化，并且大多数组分的遗传变异占据总体变异的极大部分，表明这些组分遗传较为稳定。在以前的研究中也已经提出了许多针叶树种类似的观点(Hanover，1992)。基于松脂组分的稳定性，一些组分的浓度已经作为生化遗传标记，并且应用于分类学和进化研究，特别是单萜。例如，Pureswaran等(2004)使用单萜烯在树干和树叶中区分了4种针叶树同源树种。Arrabal等(2005)根据对异海松酸和α-蒎烯的研究发现，可以将西班牙海岸松(P. pinaster)的5个种源分为2组。此外，Kossuth等(1988)认为β-水芹烯是一种很好的生化标记，它能将同一树种80%以上的无性系区分开。而这些组分在马尾松种群中也存在着丰富的遗传变异，因此通过选择，这些目标组分可取得良好的改良效果。

3.2 生长、产脂力和松脂组分间的相关性

在本文研究中，产脂力与胸径存在着正相关，这与以前的马尾松研究结果(覃冀等，2005；刘青华等，2013)是一致的。在其他针叶树种中也发现了类似的结果，如湿地松(P. elliottii)、海岸松和火炬松(P. taeda)(Trapp et al., 2001；Roberds et al., 2003)。这表明间接选择胸径可能会提高松脂的产量。

松脂的化学性质由其组成决定。例如，Fischer等(2008)提出，未遭受松甲虫(Dendroctonus adjunctus)危害的西黄松(Pinus ponderosa)树干内具有较高含量的β-蒎烯。α-蒎烯和柠檬烯的组合物被认为是天然的驱虫剂(Nerio et al., 2010)。因此，一般希望所选择的个体具有高的产脂力，还含有相对比较高的组分。在本研究中，发现6种组分与产脂力显著相关。其中莰烯和异海松酸与产脂力呈正相关，三环烯、长叶蒎烯、枞酸和新枞酸与产脂力呈负相关，其遗传相关系数中等偏弱。因此，马尾松改良方案对产脂力的选择会在一定程度上造成6种组分的遗传变化。

3.3 松脂组分之间的相关性

松脂是由甲基赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)和甲羟戊酸(MVA)2条生物途径合成的。单萜和二萜由MEP途径合成(Lange et al., 2003)，而倍半萜由MVA途径合成(Zulak et al., 2010)。在本研究中，大部分较强的相关性存在于同一类萜类中，尤其是倍半萜类别中。Karanikas等(2010)在地中海松(P. halepensis)中也发现了倍半萜之间具有较强的正相关性。然而，在不同类型的萜类中，大部分单萜与倍半萜，特别是与莰烯具有负的遗传相关性，这表明这些单萜和倍半萜的生物合成途径可能彼此相互抑制。此外，本研究还发现山达海松酸与大部分单萜具有中度至强度的正遗传相关，而与所有倍半萜呈负相关，由此可推断山达海松酸的形成与单萜的形成可能为协同作用，而与倍半萜存在着相反的作用。另外，聚类结果还表明，单萜和二萜之间的距离更近，首先聚在一起，而与通过MVA生物合成途径产生的倍半萜距离相对较远。

4 结论

本研究揭示了马尾松产地间和产地内无性系间的变异大小。对于生长性状，除冠幅外其他性状的遗传变异主要来自产地间，即通过种源选择能显著提高生长性状。对于产脂力和松脂组分，变异主要来自产地内无性系间，即产地内优树选择对提高松脂性状具有重要意义。在生长性状中，产脂力仅与DBH相关，即可通过胸径对产脂力性状进行早期间接选择。在松脂组分中，三环烯、长叶蒎烯、莰烯、异海松酸、枞酸和新枞酸的组分与产脂力显著相关，可用于间接选择松脂产量或与产脂力同步改良。同一萜类内，尤其是倍半萜烯之间存在较强的正相关性，而在不同类别中，单萜与大部分倍半萜呈负相关，与大部分二萜呈正相关。最后，兼顾生长、产脂力和松脂品质，选出11个高蒎烯和9个高枞酸型树脂酸含量的优异无性系。