化学药剂防治是森林有害生物综合治理中有效而直接的急救措施(Jin et al., 2014)。但是在同一地区长时间施用同一种药剂等不科学的农药使用方法，往往使得害虫产生严重的抗药性。而采用作用机制或代谢途径不同的药剂进行合理混用，可以提高防治效果，并且有效地延缓害虫抗药性的产生(张国财, 2013)。

阿维菌素(Abamectin)是一类从阿维链霉菌发酵液中分离提纯的十六元大环内酯类化合物(Barrett et al., 1994)，对昆虫、螨类以及线虫具有高效广谱的杀虫活性(Siddique et al., 2015; Xu et al., 2016; Mermans et al., 2017)。通过对阿维菌素母体改造得到多种衍生物(Bai et al., 2016; Ozdemir et al., 2016)，其中阿维菌素和甲氨基阿维菌素(Emamectin)被广泛应用于农林业害虫防治，而伊维菌素(Ivermectin)被广泛用于线虫和节肢动物类寄生虫防治(Wei et al., 2018)。阿维菌素进入昆虫体内后，可以通过对γ-氨基丁酸受体(γ-aminobutyric acid, GABAr)的作用，以激动剂的方式引发神经突触膜释放GABA，使得细胞膜Cl^-通透性增加，从而导致GABA介导的中枢神经系统以及神经-肌肉传导受阻，引起虫体麻痹，最终致死(Wann, 2010; Zhao et al., 2016; Wei et al., 2018)。

苯甲酰苯基脲(Benzoylphenylurea, BPU)是在除草剂筛选过程中发现的一类具有杀虫活性的物质(Sun et al., 2015)，主要作用于昆虫几丁质合成通路，干扰昆虫几丁质合成，导致蜕皮失败、畸形，甚至死亡(Merzendorfer, 2006; 2013)。已发现或合成的BPU类药剂超过1万种，用于商品化生产的BPU类药昆虫生长调节剂有15种(Henriques et al., 2016)，其中杀铃脲(Triflumuron)广泛应用于农林业(Chernaki- Leffer et al., 2011; Sagheer et al., 2012)、畜牧业(Waghorn et al., 2013)和卫生害虫(Belinato et al., 2013; Jacups et al., 2014)防治。

在生产实践中采用阿维菌素和杀铃脲联合使用防治舞毒蛾幼虫具有显著的增效作用，但关于二者联合作用增效的机制尚未见报道。本文采用阿维菌素和杀铃脲单剂、复合剂处理3龄舞毒蛾幼虫，测定幼虫解毒酶和保护酶活力，对阿维菌素和杀铃脲联合作用机制进行探究。

舞毒蛾虫卵及饲料购自中国林业科学研究院；阿维菌素和杀铃脲原药购自哈尔滨美望科技发展有限公司；分析纯考马斯亮蓝G-250、无水乙醇、磷酸、氯仿、异丙醇购自天津市永大化学试剂有限公司；生物纯牛血清蛋白购自Beijing Biotopped Science & Technology Co., Ltd；谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、羧酸酯酶(CarE)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

HPG-280H型人工气候培养箱；Adventure AR2130电子分析天平；DK-S14电热恒温水浴锅；ULtrospec 5300 pro紫外分光光度计；MX-F漩涡振荡器；D3024R低温离心机。

舞毒蛾虫卵经10%甲醛溶液浸泡消毒、流水冲洗、室温阴干卵表面后，置于恒温培养箱内25 ℃孵化。孵化的幼虫转接到新的养虫盒内，采用人工饲料饲养。饲养条件：温度25 ℃±1 ℃，相对湿度75%，光照时间16 h·d^-1。每天及时更换新鲜饲料，定期清理排泄物和食物残渣。

饲料煮熟前在人工饲料中添加不等量的9 000 μg·mL^-1阿维菌素丙酮溶液和25 000 μg·mL^-1杀铃脲丙酮溶液，分别配制成含有阿维菌素、杀铃脲单剂和复合剂混毒饲料。不同处理组饲料中药剂含量及编号见表 1。挑选大小一致临近蜕皮的3龄健康幼虫饥饿处理12 h后，采用混有杀虫剂的饲料进行饲喂处理，以加入丙酮的饲料作为溶剂对照。24 h后统计死亡率。存活幼虫液氮处理后，置于-75 ℃冰箱保存备用。每处理为30头幼虫，水平重复3次。

表 1 饲料中阿维菌素和杀铃脲含量 Tab.1 Contents of abamectin and triflumuron in the artificial diet

表 1 饲料中阿维菌素和杀铃脲含量 Tab.1 Contents of abamectin and triflumuron in the artificial diet 浓度组别Concentration groups 药剂处理Treatments 阿维菌素Abamectin/(μg·g-1) 杀铃脲Triflumuron/(μg·g-1) 低浓度Low concentration 阿维菌素单剂Single abamectin 0.50 — 杀铃脲单剂Single triflumuron — 8.30 阿维菌素·杀铃脲复合剂Mixed pesiticide 0.50 8.30 高浓度High Concentration 阿维菌素单剂Single abamectin 1.10 — 杀铃脲单剂Single triflumuron — 16.60 阿维菌素·杀铃脲复合剂Mixed pesiticide 1.10 16.60 对照CK 溶剂对照Solvent control — —

解毒酶CarE、GST和保护酶SOD、POD、CAT、PPO活力测定采用南京建成生物工程研究所试剂盒，按说明书进行测定计算。酶液制备取液氮研磨的舞毒蛾虫体组织0.1 g，按说明书加入生理盐水或提取液后，漩涡振荡抽提2 min，再按说明书要求进行离心，取上清液作为酶液。酶液中组织蛋白含量采用Bradford考马斯亮蓝G-250法进行测定(Bradford, 1976)。

数据统计采用SPSS 21.0单因素ANOVA分析进行。试验数据以“平均值±标准误”表示，图表中字母完全不同表示组间差异显著(P＜0.05)。

从表 2可知，对照组、阿维菌素和杀铃脲单剂处理舞毒蛾幼虫死亡率为0；低浓度处理组中阿维菌素和杀铃脲复合剂处理的幼虫死亡率为1.15%，与对照组无显著差异；高浓度处理组中阿维菌素和杀铃脲复合剂处理的幼虫死亡率为4.11%，与对照组有显著差异。

表 2 药剂处理24 h舞毒蛾幼虫死亡情况 Tab.2 Mortality of Lymantria dispar at 24 h after drugs treatment

表 2 药剂处理24 h舞毒蛾幼虫死亡情况 Tab.2 Mortality of Lymantria dispar at 24 h after drugs treatment 浓度组别Concentration groups 药剂处理Treatments 死亡率Mortality(%) 低浓度Low concentration 阿维菌素单剂Single abamectin 0±0b 杀铃脲单剂Single triflumuron 0±0b 阿维菌素·杀铃脲复合剂Mixed pesiticide 1.15±1.1b 高浓度High concentration 阿维菌素单剂Single abamectin 0±0b 杀铃脲单剂Single triflumuron 0±0b 阿维菌素·杀铃脲复合剂Mixed pesiticide 4.11±0.88a 对照CK 溶剂对照Solvent control 0±0b

由图 1(A)可知，药剂处理的舞毒蛾幼虫CarE活力均高于对照组，但单剂处理CarE活力相比对照组显著提高，而复合剂处理与对照组无显著差异。对于低浓度处理组，复合剂处理CarE活力比阿维菌素处理下降30.78%，比杀铃脲处理下降29.68%；对于高浓度处理组，复合剂处理CarE活力比阿维菌素处理下降27.97%，比杀铃脲处理下降9.28%。相比单剂处理，阿维菌素和杀铃脲联合作用抑制了舞毒蛾幼虫CarE活力。

图 1 舞毒蛾解毒酶活力 Fig. 1 Detoxification enzyme activities of Lyamntria dispar

由图 1(B)可知，药剂处理的舞毒蛾幼虫GST活力均高于对照组，但单剂处理的舞毒蛾幼虫GST活力相比对照组显著提高，而复合剂处理GST活力与对照组无显著差异。对于低浓度处理组，复合剂处理GST活力比阿维菌素处理下降24.24%，比杀铃脲处理下降15.81%；对于高浓度处理组，复合剂处理CarE活力比阿维菌素处理下降20.52%，比杀铃脲处理下降23.77%。相比单剂处理，阿维菌素和杀铃脲联合作用抑制了舞毒蛾幼虫GST活力。

由图 2(A)可知，药剂处理的舞毒蛾幼虫SOD活力均高于对照组，但阿维菌素处理与对照组无显著差异，杀铃脲处理和复合剂处理与对照组有显著差异，对于低浓度处理组，复合剂处理SOD活力比阿维菌素处理提高27.43%，比杀铃脲处理下降16.79%；在高浓度处理组，复合剂处理SOD活力比阿维菌素处理提高9.43%，比杀铃脲处理提高5.42%。相比单剂处理，阿维菌素和杀铃脲联合作用提高了舞毒蛾幼虫SOD活力。

图 2 舞毒蛾保护酶活力 Fig. 2 Protective enzyme activities of Lyamntria dispar

由图 2(B)可知，药剂处理的舞毒蛾幼虫POD活力均低于对照组，但除了高浓度组中阿维菌素处理组外，均与对照组无显著差异。在低浓度处理组，复合剂处理POD活力比阿维菌素处理提高2.43%，比杀铃脲处理提高0.59%；在高浓度处理组，复合剂处理POD活力比阿维菌素处理提高7.06%，比杀铃脲处理提高0.61%。相比单剂处理，阿维菌素和杀铃脲联合作用提高了舞毒蛾幼虫POD活力。

由图 2(C)可知，药剂处理的舞毒蛾幼虫CAT活力均高于对照组，但低浓度处理组与对照组有显著差异，而高浓度处理组与对照组无显著差异。对于低浓度处理组，复合剂处理CAT活力比阿维菌素处理提高5.88%，比杀铃脲处理提高17.42%；对于高浓度处理组，复合剂处理CAT活力比阿维菌素处理提高8.11%，比杀铃脲处理提高11.08%。相比单剂处理，阿维菌素和杀铃脲联合作用提高了舞毒蛾幼虫CAT活力。

由图 2(D)可知，药剂处理的舞毒蛾幼虫PPO活力均高于对照组。对于低浓度处理组，复合剂处理PPO活力比阿维菌素处理下降42.26%，比杀铃脲处理下降25.06%；对于高浓度处理组，复合剂处理PPO活力比阿维菌素处理下降7.50%，比杀铃脲处理下降3.24%。相比单剂处理，阿维菌素和杀铃脲联合作用抑制了舞毒蛾幼虫PPO活力。

农药混用是指将2种或2种以上农药混合使用进行病虫害防治的方法，是生产实践中常用的一种用药方式，也是一种增强防治效果、延缓害虫抗药性产生的有效途径。比如阿维菌素与Monepantel混用可以有效地增加捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)对药剂的敏感性，降低其抗药性(Kotze et al.，2018)。同时通过农药混用还可以降低药剂费用、提高经济效益。但是并非任意农药均可以进行混合使用。在进行农药混用时，需要综合考虑农药混配后对彼此的理化性质、对病虫害的药效和对保护植株的影响情况。不科学的农药混用可能产生拮抗作用，甚至对保护植株造成负面影响。比如有机磷酸酯类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类杀虫剂在碱性条件下会分解失效，因此不能与碱性农药进行混用；石硫合剂和波尔多液2种碱性杀菌剂如果混用也会因为复分解反应产生多硫化铜，不仅失去药效，同时容易产生药害(张国财, 2013)；杀铃脲与嘧菌酯、环丙唑醇、氧化锌、硫酸锰混用，不仅对草地贪夜蛾防治效果无益，还对植株的呼吸作用和光合作用有着显著的抑制作用(Zandonadi et al.，2017)。在不产生负作用的条件下，农药混用多选用作用机制不同、作用速度不同或杀虫谱不同的药剂进行混用，以达到提高防治效果的目的。在农药混用水平成为一个国家农药加工和使用水平高低标志之一的时代，农药混用吸引了广大科研工作者的研究兴趣，但绝大多数关于农药混用的研究都只关注农药混用剂型的开发(庾琴等, 2013; 杨超, 2016; 崔博等, 2017)和农药混用的防治效果(Wanna et al.，2012; 沈登荣等, 2017)，而对农药混用的联合作用机制关注较少。

阿维菌素属神经性毒剂，作用效果相对迅速。杀铃脲属于昆虫生长调节剂，作用时间相对缓慢。阿维菌素和杀铃脲混用是典型的作用机制不同且作用速度不同的2种农药混用。本文采用阿维菌素和杀铃脲对舞毒蛾幼虫进行联合处理，研究了阿维菌素和杀铃脲对舞毒蛾幼虫的联合作用机制，结果表明：阿维菌素和杀铃脲单剂处理、复合剂处理的舞毒蛾幼虫CarE和GST活力均高于对照组，说明CarE和GST是舞毒蛾幼虫体内应对阿维菌素和杀铃脲胁迫的重要解毒酶。但单剂处理CarE和GST活力显著高于对照组，而复合剂处理与对照组无显著差异，说明阿维菌素和杀铃脲联合作用可以抑制舞毒蛾幼虫CarE和GST活力。阿维菌素和杀铃脲单剂处理及复合剂处理的舞毒蛾幼虫SOD、CAT和PPO活力均高于对照组，而POD活力均低于对照组，说明SOD、CAT和PPO是舞毒蛾幼虫体内应对阿维菌素和杀铃脲胁迫的重要保护酶。但复合剂处理SOD、POD和CAT活力均高于单剂处理，而复合剂处理PPO活力则均低于单剂处理。说明阿维菌素和杀铃脲复合剂处理可以抑制舞毒蛾幼虫PPO活力。另外研究发现SOD作为保护酶，在应对阿维菌素、杀铃脲单剂处理和复合剂处理胁迫中表现了比POD、CAT更强的保护作用，笔者计划在下一步的研究中，从舞毒蛾SOD分型功能、SOD基因时空表达和SOD对不同胁迫环境的应答的角度，对舞毒蛾SOD在胁迫应答过程中扮演的角色进行深入研究。

阿维菌素和杀铃脲联合作用主要是通过抑制舞毒蛾幼虫解毒酶CarE和GST活力，再辅以抑制保护酶PPO活力，从而提高阿维菌素和杀铃脲对舞毒蛾幼虫的毒杀效果。