文章信息
- 张芹, 徐宗大, 赵凯, 李晓伟, 张罗沙, 张启翔.
- Zhang Qin, Xu Zongda, Zhao Kai, Li Xiaowei, Zhang Luosha, Zhang Qixiang
- 梅花花青素苷调控基因PmMYB1的分离及功能分析
- Isolation and Biological Function Analysis of Anthocyanin Regulatory Gene PmMYB1 from Prunus mume
- 林业科学, 2018, 54(10): 64-72.
- Scientia Silvae Sinicae, 2018, 54(10): 64-72.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20181008
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文章历史
- 收稿日期:2017-02-20
- 修回日期:2018-07-09
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作者相关文章
2. 河北农业大学园林与旅游学院 保定 071000
2. College of Landscape and Travel, Hebei Agricultural University Baoding 071000
花青素苷是植物体内类黄酮类次生代谢产物, 在花和果实颜色的形成及提高植物抗逆性方面发挥着重要作用(Winkel-Shirley, 2001)。前人对于花青素苷的代谢途径及其合成调控进行了大量的研究, 花青素苷代谢通路包括上游结构基因(CHS、CHI和F3H)、下游结构基因(DFR、ANS和UFGT)及F3′H和F3′5′H等重要结构基因(Petroni et al., 2011), 这些结构基因的表达通常受R2R3-MYB、bHLH和WD40等转录因子调控(Xu et al., 2015), 通常情况下, 这些转录因子形成复合蛋白MBW结合到花青素苷合成基因的启动子上, 激活靶基因使其表达, 从而起到调控作用(Ramsay et al., 2005), 在MBW复合物中, R2R3-MYB转录因子被证明可以直接结合到靶基因上起调控作用(Hichri et al., 2011)。目前, 已经从拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、矮牵牛(Petunia × hybrida)、葡萄(Vitis vinifera)、苹果(Malus domestica)、沙梨(Pyrus pyrifolia)、金鱼草(Antirrhinum majus)、非洲菊(Gerbera hybrida)、花烛(Anthurium andraeanum)等多种植物中分离鉴定了调控花青素苷合成的R2R3-MYB转录因子(Lai et al., 2013; Li et al., 2016)。不同植物中的R2R3-MYB转录因子表现出不同的转录调控模式, 而且对花青素苷合成通路结构基因的调控能力也有很大差异。例如, 拟南芥的AtPAP1转录因子可以激活所有的结构基因合成花青素苷(Tohge et al., 2005), 而AtMYB4则抑制花青素苷合成(Jin et al., 2000);葡萄的VvMYBA转录因子在葡萄着色成熟阶段才开始表达, 仅对VvUFGT表达起调控作用, 而不调控其他结构基因的表达(Walker et al., 2007)。由此可见, 不同物种中R2R3-MYB转录因子调控花青素苷合成的机制是复杂多样的, 因此, 分离和鉴定特定物种中的R2R3-MYB调控基因是研究其花青素苷合成机制的重要环节。
梅花(Prunus mume)是中国传统名花, 在中国有3 000多年的栽培历史(陈俊愉, 1996), 由于具有很高的观赏价值, 常作为园林绿化树种、盆景、切花应用。花色是梅花重要的观赏性状, 花色育种是梅花品种改良的重要目标之一。前人研究报道花青素苷是梅花花色形成的重要色素, 可以根据花青素苷的有无将梅花花色分为2大类, 一类是含花青素苷的粉色到红色系, 另一类是不含花青素苷的白色和黄色系, 并报道了梅花品种‘南京红’和‘南京红须’中的主要花青素苷成分(赵昶灵等, 2004; 2006)。但有关梅花花青素苷合成分子机制的研究几乎为空白, 到目前为止, 梅花花青素苷生物合成调控基因还没有被分离。梅花基因组的发布(Zhang et al., 2012)为研究梅花花色形成的分子机制奠定了基础。本研究从梅花花瓣中分离花青素苷调控基因PmMYB1, 在系统分析其序列特征的基础上进行功能预测, 通过构建表达载体在烟草(Nicotiana tabacum)中表达鉴定其功能, 这将为进一步解析梅花花青素苷的分子调控机制及梅花花色分子育种奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料2014年2月于北京鹫峰梅花种质资源圃采集梅花‘红须朱砂’(P. mume ‘Hongxu Zhusha’)初花期的花瓣, 液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。烟草品种‘W38’(Nicotiana tabacum ‘W38’)用于转基因试验。所有用于试验分析的转基因烟草苗均在温室中盆栽培养, 栽培基质为草炭土:珍珠岩(体积比3:1), 温度25 ℃, 光强150~250 μmol·m-2 s-1, 光周期为光照16 h/黑暗8 h。
1.2 总RNA提取与PmMYB1基因克隆用EASYspin Plus植物RNA提取试剂盒(北京艾德莱公司)提取梅花花瓣及转基因烟草T2的花和叶片的总RNA, 通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法检测总RNA质量和浓度后, 取2 μg RNA作为模板, 用TIANScript cDNA第1链合成试剂盒反转录成cDNA, 操作方法按照说明书进行。根据梅花基因组数据设计该基因核苷酸序列的特异引物PmMYB1-F:ATGGAGGGTTATAACTTGGGT; PmMYB1-R:TTATTGTTTTGAATGATTCCAAAGG。以梅花的cDNA为模板进行PCR扩增, 反应程序:94 ℃预变性2 min; 98 ℃变性10 s, 58 ℃退火5 s, 72 ℃延伸1 min, 35个循环; 72 ℃延伸10 min。PCR产物纯化回收后连接到Topo载体上, 转化大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞DH5α, 挑选阳性克隆经PCR验证后, 送中美泰和生物技术有限公司测序。
1.3 PmMYB1生物信息学分析利用DNAMAN软件对测序后的PmMYB1的核苷酸序列进行蛋白质预测, 将推定的氨基酸序列提交到NCBI上进行BLAST同源序列比对, 用ClustalW 2.0 (Larkin et al., 2007)和MEGA6.0软件(Tamura et al., 2013)对PmMYB1及其同源基因编码的蛋白进行多序列比对, 分析保守结构域及其他保守基序, 并采用邻接法(neighbor-joining)构建系统进化树, bootstrap检验设为1 000次。所有用于多序列比对和进化分析的R2R3-MYB蛋白序列(表 1)来自于GenBank数据库。
将PmMYB1基因的全长编码区序列通过NcoⅠ和BstEⅡ2个酶切位点克隆到含有CaMV 35S启动子的pCAMBIA1304载体上, 采用冻融法将含有目的基因的表达载体转入土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105, 参照Horsch等(1985)报道的叶盘法转化烟草‘W38’。用50 mg·L-1的潮霉素筛选抗性植株, 最后将生根的烟草幼苗移栽到花盆中置于温室培养, 以转空载体的烟草植株作对照, 用于表型比较及分子检测。选择表型变化明显的3个株系培养至T2代检测遗传的稳定性并用于基因表达分析试验。
1.5 转基因烟草的分子检测及总花青素苷含量测定以转基因烟草的DNA为模板, 利用PmMYB1的检测引物PmMYB1-F和PmMYB1-R对转基因烟草进行PCR检测, 分别以含PmMYB1基因的质粒和转空载体的野生型烟草为阳性和阴性对照。
取新鲜的转基因烟草叶片和花冠各0.3 g分别在液氮中研磨成粉末, 用含1%浓盐酸的甲醇溶液(浓盐酸:甲醇体积比1:99)在4 ℃黑暗条件下提取24 h, 12 000 r·min-1 (4 ℃)离心10 min取上清液, 过滤后用紫外分光光度法测定530 nm和657 nm的吸光度, 根据Mehrtens等(2005)的方法计算总花青素苷含量, 数据取3次重复的平均值。
1.6 基因表达分析分别以转基因烟草及对照植株花和叶片的cDNA为模板, 利用实时荧光定量RT-PCR的方法进行PmMYB1及烟草内源花青素苷合成及调控基因表达量检测。试验在IQ5 Real-Time PCR检测系统(BIO-RAD, USA)上进行, 用于qRT-PCR试验的所有引物见表 2, 内参选用NtTubA1基因。反应体系(20 μL)按TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂要求配制, qRT-PCR反应程序:95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s, 60 ℃延伸30 s, 40个循环。试验设3次重复, 用2-ΔΔCt方法计算相对表达量(Schmittgen et al., 2008)。
以梅花花瓣的cDNA为模板, 用PmMYB1基因的特异性引物进行PCR扩增, 电泳检测条带大小与预测基本相符, 经回收、连接、转化、测序后, 获得全长为729 bp的CDS序列(GenBank序列号为MH625917), 该序列编码242个氨基酸的蛋白, 通过NCBI-Blast比对结果表明, 该蛋白与其他物种花青素苷调控R2R3-MYB蛋白有较高的同源性, 其中与同属樱桃李(Prunus cerasifera)的PcMYB10和欧洲甜樱桃(Prunus avium)的PaMYB10蛋白的一致性分别达到92%和91%。另外, 进一步多序列比对可以看出, 该蛋白与其他R2R3-MYB蛋白结构相似, N端具有保守的R2和R3 MYB蛋白结构域, 并且有1个长的多变的C末端(图 1), 属于MYB蛋白家族。从图中还可以看出, 在R3保守域内, 含有与bHLH转录因子相互作用的基序[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R (Zimmermann et al., 2004), 在C端含有调控花青素苷MYB蛋白特有的保守基序[R/K]Px[P/A/R]xx [F/Y] (Stracke et al., 2001), 因此, 初步推测PmMYB1可能具有花青素苷合成调控功能。
为了分析PmMYB1与其他物种花青素苷调控相关MYB转录因子的进化关系, 构建了包括单子叶和双子叶植物共16个物种的系统进化树(图 2)。从进化树可以看出, 16个物种首先聚成单子叶植物和双子叶植物2个大的进化枝, 在双子叶植物进化枝中, 又分成了2个组, 其中蔷薇科(Rosaceae)的7种植物聚在一组(组Ⅰ), 其他物种聚在另一组(组Ⅱ)。在组Ⅰ中梅花首先与同属的桃(prunus persica)和欧洲甜樱桃聚在一起, 表明其进化关系最近, 然后与苹果属(Malus)的苹果和梨属(Pyrus)的沙梨聚在一起, 说明李属(Prunus)与上述2属有很近的进化关系。这为探索这些属不同物种间的花青素苷调控机制奠定了基础。MdMYB10和PyMYB10分别调控苹果和梨果皮中花青素苷的合成(Espley et al., 2007;Feng et al., 2010), 本研究中PmMYB1与这2个转录因子在进化树上聚在同一分支, 也说明PmMYB1可能与MdMYB10和PyMYB10具有相似的生物功能。
为了验证PmMYB1基因的功能, 通过农杆菌转化将该基因转入烟草, 共获得25个转基因株系, 对这些转基因烟草进行了PCR检测, 结果显示转基因植株中均能扩增出与阳性对照同样大小的目的片段, 而野生型烟草和水对照中均未扩增出该片段(图 3), 说明PmMYB1基因已经导入烟草植株。对部分转基因T1和T2代植株进行PCR检测仍能扩增出该目的条带, 说明PmMYB1能够遗传到转基因烟草的后代中。以野生型烟草为对照, 对T2代转基因植株进行了表型分析, 结果显示转基因植株花冠的颜色明显加深, 并且从蕾期到盛开期持续表现为深玫红色, 而对照花冠则持续表现为浅粉色(图 4), 其他器官未表现出明显的颜色变化。花青素苷含量测定结果也表明转基因植株花冠中的花青素苷含量显著高于对照(P < 0.05)(图 5), 3个转基因株系花冠中花青素苷平均含量是对照的6.2倍, 这些结果表明PmMYB1显著促进了烟草花中花青素苷的积累。
花青素苷合成通路结构基因及调控基因的表达对花青素苷的合成和积累起重要作用。在烟草中, NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtF3′H、NtDFR、NtANS、NtUFGT是花青素苷合成通路上的关键结构基因, NtAn1a和NtAn1b被证明是参与花青素苷合成调控的重要bHLH转录因子(Bai et al., 2011), 能与MYB转录因子协同调控花青素苷合成通路结构基因的表达, 从而影响花青素苷的合成。本研究为了进一步明确梅花PmMYB1基因转入烟草后对上述重要内源基因的影响, 并探讨转基因烟草不同器官中色素变化的表型差异, 通过实时荧光定量RT-PCR的方法分析了该基因及烟草内源花青素苷合成相关基因在转基因烟草T2代叶和花中的表达情况(图 6、图 7)。从图 6可以看出, PmMYB1基因在3个烟草转基因株系的叶和花中均表达, 但野生型植株中未检测到该基因表达, 进一步证明该基因已转入烟草并遗传到后代中。该基因在转基因烟草不同器官表达量上有明显差异, 在花中表达量明显高于叶中, 3个株系的平均表达量为叶中的16.4倍。从图 7可以看出, 与对照相比, 过表达PmMYB1基因的3个株系花中7个关键内源花青素苷结构基因NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtF3′H、NtDFR、NtANS、NtUFGT及2个调控基因NtAn1a和NtAn1b均呈现不同程度的上调表达, 尤其是2个下游基因NtDFR和NtANS上调幅度最大, 分别比对照提高49.3倍和38.3倍(图 7 D, E, F)。然而在叶中, 除NtCHS、NtCHI和NtF3H在3个转基因株系中小幅度稳定上调表达外, 超表达PmMYB1基因没有引起内源调控基因NtAn1a和NtAn1b及其他结构基因的稳定上调表达(图 7 A, B, C)。总体来看, 所有内源花青素苷合成基因在转基因植株花中的表达量均明显高于叶中。
本研究从梅花品种‘红须朱砂’中分离了PmMYB1基因, 通过与其他物种的R2R3-MYB进行序列比对表明PmMYB1具有保守的MYB结构域, 属于MYB转录因子家族(Dubos et al., 2010);并且PmMYB1的C端含有花青素苷调控MYB蛋白的特有基序[R/K]Px[P/A/R]xx[F/Y], 该基序最早在拟南芥的AtPAP1和AtPAP2中被发现(Stracke et al., 2001), 后来在许多其他物种具有花青素苷合成调控功能的R2R3-MYB中也证明该基序具有保守性(Lin-Wang et al., 2010)。构建的进化树表明该基因与蔷薇科的苹果、沙梨、欧洲甜樱桃和桃等物种中调控花青素苷合成的MYB转录因子有很近的进化关系。据此, 推测PmMYB1基因可能具有花青素苷调控功能, 为进一步明确该基因的功能进行了转基因功能验证试验。
在转基因功能验证试验中, 烟草常被用作基因异源表达的受体材料, 前人研究表明在烟草中过表达MYB基因NtAn2(Pattanaik et al., 2010)导致转基因植株中花青素苷的积累, 并且引起花青素苷合成通路基因的上调表达, 从而证明该基因具有花青苷合成调控功能。梅花PmMYB1与烟草的NtAn2基因具有很高的同源性, 并且都含有花青素苷合成调控MYB蛋白的特有基序(Motif 6)(图 1), 推测二者可能具有相似的功能; 将PmMYB1基因导入烟草后导致转基因植株花冠颜色加深, 花青素苷含量显著增加; 通过实时荧光定量RT-PCR试验检测到该基因在转基因株系后代中稳定表达, 并且引起花中内源花青素苷合成通路关键基因的上调表达, 因此证明PmMYB1基因在烟草花的花青素苷积累过程中起了关键调控作用。但PmMYB1和NtAn2在花青素苷合成调控的表达模式上有差异, 主要表现在花青素苷积累部位的不同, 过表达PmMYB1显著提高了转基因烟草花中花青素苷的含量, 其他器官中花青素苷含量没有明显变化, 而过表达NtAn2则诱导整个转基因植株积累了花青素苷(Pattanaik et al., 2010)。这种调控的差异性也表现在其他花青素苷合成调控MYB转录因子上, 例如, 过表达苹果的MdMYBA或MdMYB3基因仅在转基因烟草的生殖器官中积累了大量花青素苷, 营养器官中没有积累花青素苷(Ban et al., 2007;Vimolmangkang et al., 2013);而过表达拟南芥的AtPAP1 (Borevitz et al., 2000)或巨峰葡萄(Vitis labruscana)的VlMybA1-1(Kobayashi et al., 2002)则诱导整个转基因植株积累了花青素苷。因此, 进一步分析花青素苷积累差异的原因有助于深入解析PmMYB1基因的生物学功能及调控机制。
转基因植株不同器官花青素苷积累的差异与花青素苷合成调控及结构基因的表达有关。前人研究表明同源或异源表达花青素苷调控MYB转录因子, 可以引起全部或部分花青素苷合成通路结构基因表达的变化, 例如, 在烟草或拟南芥中过表达AtPAP1、AtPAP2、PhAN2、GMYB10、MdMYB3、NtAn2等MYB类基因可激活转基因植物内源花青素苷合成基因的表达(Quattrocchio et al., 1999;Borevitz et al., 2000;Elomaa et al., 2003;Pattanaik et al., 2010), 但是不同MYB基因对不同靶基因的激活能力有差异。例如, 在烟草中过表达MdMYB3时, 检测到转基因植株花器官中部分花青素苷合成基因NtCHS、NtCHI和NtUFGT的上调表达(Vimolmangkang et al., 2013);在烟草和拟南芥中过表达NtAn2则引起3个上游基因NtCHS、NtCHI、NtF3H和2个下游基因NtDFR和NtANS的上调表达。本研究中过表达PmMYB1基因引起花中几乎所有关键结构基因的显著上调表达, 而叶中仅有部分结构基因上调表达。另外, 研究表明MYB和bHLH转录因子通常相互作用形成复合蛋白共同调控花青素苷的合成(Grotewold et al., 2000;Ramsay et al., 2005)。在烟草中, 2个bHLH转录因子NtAn1a和NtAn1b与NtAn2相互作用形成复合物共同调控花青素苷的合成, 当缺乏bHLH时不能合成花青素(Pattanaik et al., 2010)。本研究通过序列分析显示PmMYB1蛋白中存在与bHLH蛋白互作的保守基序[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R (Yamagishi et al., 2010), 推测PmMYB1可能需要bHLH蛋白参与共同完成花青素苷的合成调控。实时荧光定量RT-PCR试验表明转基因烟草花器官中所有被测内源基因的表达量均明显高于叶中, 可能是在花中高表达的PmMYB1基因激活了烟草内源NtAn1a和NtAn1b转录因子从而形成转录复合物, 共同激活上下游结构基因促使其显著上调表达; 而在叶中可能由于PmMYB1表达量较低, 而且缺乏内源调控基因NtAn1a和NtAn1b的表达, 不能形成转录复合物, 因此仅引起部分结构基因小幅度上调表达, 而中下游几个关键结构基因NtF3′H、NtDFR和NtUFGT没有明显上调表达, 这可能是叶中不能积累花青素苷的重要原因。这些结果也进一步证明PmMYB1基因的调控机制可能与之前报道的苹果的MdMYB10和杨梅的MrMYB1等转录因子(Espley et al., 2007;Huang et al., 2013)相似, 需要bHLH转录因子协同表达共同促进花青素苷的合成, 在缺乏bHLH转录因子协同表达时几乎不能合成花青素苷。
4 结论本研究从梅花花瓣中分离出花青素苷合成调控基因PmMYB1的CDS全长序列, 该序列具有保守的MYB结构域及花青素苷调控MYB蛋白的特有基序, 与已鉴定功能的花青素苷调控R2R3-MYB转录因子有高度的同源性。在烟草中过表达PmMYB1基因能够明显上调烟草花中内源花青素苷合成通路结构基因和调控基因的表达, 显著提高转基因植株花中的花青素苷含量, 使其花色明显加深, 这些结果证明PmMYB1基因在花青素苷合成过程中起重要调控作用。
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