牡丹(Paeonia Sect. Moutan)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)落叶亚灌木，是我国特有的名贵观赏兼药用植物，至今已有1 600余年的栽培历史(Cheng，2007)。近年来，牡丹籽的油用价值逐渐被发掘，国务院于2014年颁发了《关于加快木本油料产业发展的意见》，首次把油用牡丹列为国家重点发展的木本油料作物，自此，牡丹成为了一种集观赏、药用和食用保健于一身的重要经济植物，拥有巨大市场需求。

目前，远缘杂交是牡丹育种的主要方式，然而杂交获得的种子极易败育，且1个牡丹新品种从授粉、采种、播种、开花、性状稳定、筛选、定名、申报到最终推广需要经历约10余年的时间，因此，杂交败育和育种周期长是牡丹育种的主要难题(Cheng，2007)。分株和嫁接是商业化繁殖牡丹的主要途径，但分株法的繁殖系数低、周期长，每3~4年才能分株1次(李嘉珏等，2011)；嫁接法繁琐耗时，需要耗费大量砧木，且受时间限制，最佳嫁接时机为8月末—10月初，此时嫁接成活率高达80%~90%，其余时间嫁接成活率极低(≤50%)(王世端，1966)。综上，牡丹的传统繁殖方法繁殖效率低、周期长，这严重限制了牡丹的育种和繁殖工作的开展。

组织培养技术因其微型繁殖系数高、周期短、可保持母株优良性状等优势，近几十年来迅速发展，己被广泛应用于植物快速繁殖、植株脱毒、新品种选育、人工种子和药用成分生产中，并为植物基因工程创造了前提条件。牡丹组织培养技术研究始于1965年(Partanen，1965)，虽然李萍等(2007)、Qin等(2012a)、Da Silva等(2012)曾分别对牡丹组织培养研究进展进行过综述，但近年来，随着油用牡丹产业价值逐渐被发掘，牡丹组织培养迎来了一股研究热，在涉及技术领域的广度和深度方面都取得了诸多新进展。鉴于此，本文围绕器官组织培养再生、胚珠和胚离体培养成苗以及花药(花粉)离体培养成苗这3个方面，全面综述了自1965年至今约半个世纪的牡丹组织培养技术研究进展，并分析了该技术存在的主要问题及今后的研究方向，以期为牡丹组织培养技术的系统建立提供参考和借鉴，为加速其育种和繁殖进程奠定基础。

植物组织培养再生途径主要有3种：器官发生、体细胞胚发生和无菌短枝扦插途径(罗士韦等，1988)，本文从这3个方面对牡丹的器官组织培养再生研究展开综述。

利用牡丹的各种繁殖器官(花瓣、花丝、花药、子叶等)和营养器官(叶片、叶柄、茎段等)为外植体皆可诱导得到愈伤组织(表 1)。Demoise等(1969)以牡丹(P. suffruticosa)合子胚为外植体，首次诱导得到愈伤组织，但未能实现器官发生。张健欣(2015)以紫斑牡丹(P. rockii)为研究对象，发现牡丹繁殖器官愈伤组织诱导能力由高到低依次为胚轴>子叶>花瓣>雄蕊>心皮>柱头>花丝>花药，牡丹营养器官愈伤组织诱导能力由高到低依次为无菌苗叶柄>无菌苗叶片>大田叶柄>大田叶片。虽然大量牡丹品种已实现愈伤组织诱导，但由愈伤组织再生完整植株难度较大，例如Beruto等(2004)和王军娥等(2008)成功地由愈伤组织诱导获得不定芽，但诱导率较低，分别为30.5%和50.0%，且未获得再生植株；李玉龙等(1984)和朱向涛等(2015)由愈伤组织诱导获得不定芽，不定芽分化率为20%~40%，并且将不定芽诱导生根得到再生植株，但生根率仅为10%。

表 1 牡丹器官组织培养再生研究 Tab.1 Tree peony regeneration through organ and tissue culture

表 1 牡丹器官组织培养再生研究 Tab.1 Tree peony regeneration through organ and tissue culture 种及品种 Species or cultivar 外植体 Explant 培养基和植物生长调节剂 Medium and plant growth regulators/(mg·L-1) 培养结果 Result 参考文献 Reference 1.器官发生途径：Ⅰ.愈伤组织诱导；Ⅱ.愈伤组织增殖；Ⅲ.不定芽分化；Ⅳ.不定芽生根 1. Organogenesis: Ⅰ. Callus induction；Ⅱ. Callus proliferation；Ⅲ. Adventitious shoot induction；Ⅳ. in vitro rooting 牡丹 Paeonia. suffruticosa 胚 Embryo 基本培养基Basal medium(Steeves et al., 1955) +2, 4-D 0.2 愈伤组织 Callus Demoise et al., 1969 牡丹‘青龙卧墨池’ P. suffruticosa‘Qinglong Womochi’ 叶片、叶柄 Leaves，petiole Ⅰ, Ⅱ. MS+BA 2+NAA 0.1~0.5 Ⅲ. MS+BA 2+IAA 0.2~0.5 不定芽丛 Adventitious shoot clusters 李玉龙等，1984 (Li et al., 1984) 凤丹牡丹‘凤丹白’，牡丹‘白珍珠’ P. ostii‘Fengdan Bai’; P. suffruticosa‘White Pearl’ 花丝、花瓣 Filament，petal Ⅰ.花丝Filament：MS+2iP 24.60； 花瓣Petal：MS+TDZ 2.27+2, 4-D 9.05 Ⅱ. MS+TDZ 0.5 叶状体 Thallus Beruto et al., 2004 凤丹牡丹 P. ostii 子叶、胚轴 Cotyledon，hypocotyl Ⅰ. 1/2 Improved WPM+2, 4-D 1 + 6-BA 1.0 愈伤组织 Callus 郎玉涛等，2007 (Lang et al., 2007) 法国牡丹‘金阁’ P. × lemoinei ‘Souvenir de Maxime Comu’ 叶柄 Petiole Ⅰ, Ⅱ. 2, 4-D 2.0+6-BA 1.0+NAA 1 +TDZ 0.5 Ⅲ. WPM+2, 4-D 0.25+TDZ 0.5 Ⅳ. 1/2MS+6-BA 2+NAA 0.5 生根苗 Rooted shoots 王军娥等，2008 (Wang et al., 2008) 凤丹牡丹 P. ostii 花药 Anther Ⅰ. MS+2, 4-D 2+6-BA 1.5+NAA 1 愈伤组织 Callus 朱向涛等，2010 (Zhu et al., 2010) 凤丹牡丹 P. ostii 茎段 Stem segment Ⅰ, Ⅱ. 1/2MS+2, 4-D 0.2+6-BA 2 +NAA 0.3 Ⅲ. MS +KT 0.2+ BA 0.3+ NAA 0.1 Ⅳ. 1 /2MS+IBA 0.2 完整植株 Plants 朱向涛等，2015 (Zhu et al., 2015) 牡丹 P. suffruticosa 茎段 Stem segment Ⅰ. SH-M+2, 4-D 0.1 分生结节的诱导Meristematic nodules induction：SH/1/2SH/2SH/ SH-M+2, 4-D 0.2+KT 0.1 分生结节分化Meristematic nodules differentiation：SH/1/2SH/2SH/SH-M 分生结节分化不定根 Meristematic nodules differentiated adventitious roots Gildow et al., 2006 紫斑牡丹‘高原圣火’、‘桃花镶玉’ P. rockii ‘Gaoyuan Shenghuo’, ‘Taohua Xiangyu’ 叶片、叶柄 Leaves，petiole Ⅰ. SH+2, 4-D 0.1~0.5 分生结节的诱导Meristematic nodules induction：SH+2, 4-D 0.1~ 2.0，再转Transferred to SH+2, 4-D 0.5+BA 4 分生结节 Meristematic nodules 钟原，2011 (Zhong, 2011) 牡丹‘洛阳红’、‘乌龙捧盛’，凤丹牡丹‘凤丹白’，紫斑牡丹‘红莲’，美国牡丹‘正午’、‘Golden Era’，伊藤杂种‘Bartzella’ P. suffruticosa‘Luoyang Hong’, ‘Wulong Pengsheng’; P. ostii‘Fengdan Bai’; P. rockii ‘Honglian’; P.×lemoinei‘High Noon’, ‘Golden Era’; P. itoh ‘Bartzella’ 叶柄 Petiole Ⅰ. SH+2, 4-D 1 分生结节的诱导Meristematic nodules induction：SH+2, 4-D 0.2~ 0.5+BA 2~6 分生结节分化Meristematic nodules differentiation：SH+TDZ 0.5+NAA 0.25 ‘Bartzella’的分生结节分化出不定芽，其余品种仅诱导获得分生结节 Meristematic nodules of ‘Bartzella’differentiated adventitious shoots，while the other cultivars didn’t Qin et al., 2012b 2.体细胞胚发生途径：Ⅰ.体细胞胚诱导；Ⅱ.体细胞胚增殖；Ⅲ.体细胞胚萌发成苗 2. Somatic embryogenesis: Ⅰ. Somatic embryo induction；Ⅱ. Somatic embryo proliferation；Ⅲ. Somatic embryo germination 紫斑牡丹‘书生捧墨’，凤丹牡丹‘凤丹白’，日本牡丹‘岛锦’、‘连鹤’ P. rockii ‘Shusheng Pengmo’; P. ostii‘Fengdan Bai’; P. ×suffruticosa‘Daojin’, ‘Lianhe’ 胚珠、胚 Ovule，embryo Ⅰ. 1/2MS+BA 0.5 Ⅱ. 1/2MS +IBA 0.1~0.4 Ⅲ. 1/2MS 完整植株 Plants 何桂梅，2006 (He et al., 2006) 紫斑牡丹‘书生捧墨’ P. rockii‘Shusheng Pengmo’ 胚 Embryo Ⅰ. Improved MS+BA 0.5 Ⅱ. Improved MS+BA 0.5 Ⅲ. Improved MS+活性炭Activated carbon 100 完整植株 Plants 周秀梅，2008 (Zhou et al., 2008) 凤丹牡丹 P. ostii 胚、胚轴、子叶 Embryo，hypocotyl，cotyledons Ⅰ. MS+2, 4-D 2+BA 2 体细胞胚 Somatic embryos 朱向涛等，2012 (Zhu et al., 2012) 凤丹牡丹 P. ostii 胚、叶柄、根 Embryo，petiole，root 愈伤组织的诱导和增殖Callus induction and proliferation：Improved MS+BA 0.5 Ⅰ, Ⅱ. Improved MS+BA 0.5 Ⅲ. Improved MS+BA 0.5+NAA 0.1 胚培养获得完整植株，叶柄和根培养获得愈伤组织 Plants were obtained from embryo culture，but only callus were obtained from petiole and root culture 殷丽青等，2013 (Yin et al., 2013) 紫斑牡丹‘美髯公’、‘粉荷’、‘粉冠彩’ P. rockii ‘Mei Rangong’, ‘Fenhe’, ‘Fenguan Cai’ 叶柄、叶片 Petiole，leaves 愈伤组织的诱导Callus induction：MS+BA 2+NAA 0.4 愈伤组织的增殖Callus proliferation：MS+2, 4-D 0.5+NAA 1.5 Ⅰ. MS+BA 4+2, 4-D 0.4 体细胞胚 Somatic embryos 张健欣，2015 (Zhang, 2015) 3.无菌短枝扦插途径：Ⅰ.启动培养；Ⅱ.增殖培养；Ⅲ.生根培养；Ⅳ.驯化移栽 3. In vitro shoot proliferation: Ⅰ. Initiation；Ⅱ. Multiplication；Ⅲ. in vitro rooting；Ⅳ. Acclimatization and transplanting 牡丹‘青龙卧墨池’，日本牡丹‘18号’ P. suffruticosa‘Qinglong Womochi’; P. ×suffruticosa ‘18th’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ, Ⅱ. 1/2MS+KT 0.2~1+BA 0.5~1+GA3 0.1~0.5 Ⅲ. IBA 50~100处理2~3 h，再转入1/2MS The shoots were treated with IBA 50~100 for 2~3 h，then transferred to 1/2MS Ⅳ.移栽基质采用中性土壤 The rooted shoots were transplanted to neutral soil 完整植株 Plants 李玉龙等，1984 (Li et al., 1984) 牡丹 P. suffruticosa 茎段 Stem segment Ⅰ, Ⅱ. Lepoivre+BA 1+GA3 0.1 Ⅲ. Lepoivre 4 ℃暗培养4周，再转入Lepoivre+IBA 0.1 The shoots were cultured on Lepoivre for 4 weeks in the dark，then transferred to Lepoivre+IBA 0.1 Ⅳ.移栽基质为草炭和珍珠岩等体积混合 The rooted shoots were transplanted to peat/perlite(1/1，V/V) 完整植株 Plants Kunneman et al., 1989；Albers et al., 1991 紫斑牡丹 P. rockii 茎段 Stem segment Ⅰ, Ⅱ. MS+BA 1+2ip 1 Ⅲ. MS+IBA 1 生根苗 Rooted shoots Harris et al., 1991 牡丹‘Madame de Vatry’ P. suffruticosa‘Madame de Vatry’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ, Ⅱ. MS+BA 1 Ⅲ.根诱导Root induction：MS+IBA 15 根形成Root development：MS+活性炭Activated carbon 3 000 生根苗 Rooted shoots Bouza et al., 1992 牡丹‘Madame de Vatry’ P. suffruticosa‘Madame de Vatry’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ, Ⅱ. MS(CaCl2 880)+BA 1 丛生芽 Shoot clusters Bouza et al., 1993 牡丹‘Madame de Vatry’ P. suffruticosa‘Madame de Vatry’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ, Ⅱ. MS(CaCl2 880)+BA 1+GA3 0.5 丛生芽 Shoot clusters Bouza et al., 1994a 牡丹‘Madame de Vatry’ P. suffruticosa‘Madame de Vatry’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ, Ⅱ. MS(CaCl2 880)+BA 1+GA3 0.5~1 Ⅲ.根诱导Root induction：1/2MS+IBA 15 根形成Root development：MS+活性炭Activated carbon 3 000 提出两步生根法，并获得生根苗 Two-step rooting protocol was established，and rooted shoots were obtained Bouza et al., 1994b；1994c；1994d 牡丹 P. suffruticosa 组培苗 In vitro shoot Ⅱ. MS+ BA 1 + NAA 1 丛生芽 Shoot clusters 储成才等，1993 (Chu et al., 1993) 牡丹‘姚黄’、‘胭脂红’、‘夜光白’、‘洛阳红’ P. suffruticosa‘Yaohuang’, ‘Yanzhi Hong’, ‘Yeguang Bai’, ‘Luoyang Hong’ 休眠芽 Dormant bud Ⅰ, Ⅱ.改良MS+BA 1+GA3 0.5 Ⅲ. 1/2MS+IBA 1 完整植株 Plants 孔祥生等，1998 (Kong et al., 1998) 牡丹‘Comtesse de Tuder’ P. suffruticosa‘Comtesse de Tuder’ 茎段 Stem Ⅰ, Ⅱ. MS+BA 1+NAA 0.2 丛生芽 Shoot clusters Černá et al., 2001 牡丹‘黑花魁’、‘豆绿’、‘金星雪浪’、‘大胡红’ P. suffruticosa‘Hei Huakui’, ‘Dou Lv’, ‘Jinxing Xuelang’, ‘Da Huhong’ 腋芽、顶芽 Axillary bud，terminal bud Ⅰ, Ⅱ. MS+BA 0.5~1+NAA 0.1~0.2 丛生芽 Shoot clusters 张桂花等，2001 (Zhang et al., 2001) 紫斑牡丹 P. rockii 休眠芽 Dormant bud Ⅰ, Ⅱ. MS+BA 1+NAA 0.5+2, 4-D 0.5 丛生芽 Shoot clusters 陈怡平等，2003 (Chen et al., 2003) 牡丹‘白玉’、‘石元白’、‘白珍珠’、‘姚黄’、‘Huang Hu’、‘Orange Yellow’、‘金殿’、‘胡红’、‘大金凤’、‘Fish Scale Pink’、‘状元红’、‘紫二乔’、‘First Red’、‘Red Diamond’、‘珠沙垒’、‘Old Pink’，日本牡丹‘Orange’、‘Red’，紫斑牡丹‘雪莲’，凤丹牡丹‘凤丹白’ P. suffruticosa ‘Baiyu’, ‘Shiyuan Bai’, ‘White Pearl’, ‘Yaohuang’, ‘Huang Hu’, ‘Orange Yellow’, ‘Golden Palace’, ‘Huhong’, ‘Da Jinfeng’, ‘Fish Scale Pink’, ‘Zhuangyuan Hong’, ‘Zi Erqiao’, ‘First Red’, ‘Red Diamond’, ‘Zhusha Lei’, ‘Old Pink’; P. ×suffruticosa ‘Orange’, ‘Red’; P. rockii ‘Xue Lian’; P. ostii‘Fengdan Bai’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ, Ⅱ. Improved WPM+柠檬酸Citric acid 75+Vc 50 +BA 1 Ⅲ.冷处理：改良WPM，2 ℃暗处理7 d Cold treatment：The shoots were cultured on improved WPM at 2 ℃ for 7 days in the dark 根诱导Root induction：Improved WPM+柠檬酸Citric acid 75+ Vc 50 +IBA 1 根形成Root development：WPM+活性炭Activated carbon 3 000 Ⅳ.两步驯化法Two-step acclimatization 开花植株 Flowering plants Beruto et al., 2007；2004 牡丹‘青龙卧墨池’ P. suffruticosa‘Qinglong Womochi’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ, Ⅱ. MS+BA 0.5~1 Ⅲ. MS+IBA 2 生根苗 Rooted shoots 张俊琦等，2006 (Zhang et al., 2006) 牡丹‘乌龙捧圣’、‘迎日红’ P. suffruticosa‘Wulong Pengsheng’, ‘Yingri Hong’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ. Improved MS+BA 1+GA3 0.2~0.5 Ⅰ, Ⅱ. Improved MS+BA 1+GA3 0.2~0.5 丛生芽 Shoot clusters Li et al., 2008 牡丹‘乌龙捧盛’、‘肉芙蓉’、‘鲁荷红’、‘洛阳红’、‘赵粉’、‘胡红’，凤丹牡丹‘凤丹白’ P. suffruticosa‘Wulong Pengsheng’, ‘Rou Furong’, ‘Lu Hehong’, ‘Luoyang Hong’, ‘Zhaofen’, ‘Huhong’; P. ostii ‘Fengdan Bai’ 腋芽、顶芽 Axillary bud，terminal bud Ⅰ, Ⅱ. MS(WPM Ca2+)+BA 2+IAA 0.3 生根苗 Rooted shoots 何松林等，2009 (He et al., 2009) 牡丹‘乌龙捧盛’ P. suffruticosa‘Wulong Pengsheng’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ, Ⅱ. MS+BA 0.3+NAA 0.3 丛生芽 Shoot clusters Ding et al., 2010 牡丹‘乌龙捧盛’ P. suffruticosa‘Wulong Pengsheng’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ, Ⅱ. WPM+BA 3+IAA 0.2 Ⅲ. Improved 1/2MS+IBA 4+NAA 1 生根苗 Rooted shoots 刘会超等，2010a (Liu et al., 2010a) 牡丹‘乌龙捧盛’ P. suffruticosa‘Wulong Pengsheng’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ, Ⅱ. MS+BA 2+NAA 0.5+PVP 1 000 Ⅲ. WPM+IBA 4 生根苗 Rooted shoots Wang et al., 2012 牡丹‘乌龙捧盛’ P. suffruticosa‘Wulong Pengsheng’ 组培苗 In vitro shoot Ⅲ.根诱导Root induction：1/2MS + IBA 3+ NAA 0.6 根形成Root development：1/2MS 生根苗 Rooted shoots 贾文庆等，2013 (Jia et al., 2013) 牡丹‘乌龙捧盛’、‘锦袍红’；美国牡丹‘正午’ P. suffruticosa‘Wulong Pengsheng’，‘Jinpao Hong’; P. ×lemoinei ‘High Noon’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ. WPM(CaCl2 290)+BA 1 Ⅱ. WPM(CaCl2 290)+BA 1+GA3 0.5 Ⅲ.根诱导Root induction：1 /2MS +IBA1+PUT(腐胺, putrescine)1~5 根形成Root development：1/2MS+活性炭Activated carbon 4 000 Ⅳ.试管苗以4 ℃暗处理30 d解除休眠，再移栽到草炭、珍珠岩和蛭石等体积混合基质，并接种丛枝菌根摩西球囊霉1 g·株-1 The shoots were cultured at 4 ℃ in dark for 30 days to release the dormancy，then rooted shoots were transplanted to vermiculite/peat/ perlite(1/1/1，V/V/V) and inoculated with Glomus mosseae 1 g for each plant 完整植株 Plants Wen et al., 2016a 美国牡丹‘正午’ P. ×lemoinei ‘High Noon’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ. WPM(CaCl2 290)+ BA 0.5+GA3 0.2 Ⅱ. WPM [Ca(NO3)2·4H2O 1 668] +BA 0.5+GA3 0.2 Ⅲ.复壮培养Rejuvenation culture：1/2MS(CaCl2 296)+活性炭 Activated carbon 0.5，20 d 根诱导Root induction：1/2MS(CaCl2 296)+IBA 1+PUT 1 根形成Root development：1/2MS(CaCl2 296)+活性炭Activated carbon 4 000 开花植株 Flowering plants 文书生等，2016 (Wen et al., 2016) Ⅳ.试管苗以4 ℃暗处理30 d解除休眠，再移栽到草炭、珍珠岩和蛭石等体积混合基质 The shoots were cultured at 4 ℃ in the dark for 30 days to release the dormancy，then the rooted shoots were transplanted to vermiculite/peat/perlite(1/1/1，V/V/V) 美国牡丹‘正午’ P. × lemoinei ‘High Noon’ 腋芽 Axillary bud Ⅰ. WPM [Ca(NO3)2·4H2O 1 112]+ BA 1 Ⅱ. WPM [Ca(NO3)2·4H2O 1 112]+mT(meta-Topolin)1+ GA3 0.5 Ⅲ.冷处理Cold treatment：4 ℃暗处理8 d Cold treatment：The shoots were cultured at 4 ℃ in the dark for 8 days 根诱导Root induction：1 /2MS(CaCl2 296)+IBA 2+PUT 1 根形成Root development：1/2MS(CaCl2 296)+活性炭Activated carbon 4 000 Ⅳ.移栽基质为草炭、珍珠岩和蛭石等体积混合 The rooted shoots were transplanted to vermiculite/peat/perlite (1/1/1，V/V/V) 完整植株 Plants Wen et al., 2016b 凤丹牡丹 P. ostii 腋芽 Axillary bud Ⅰ. WPM+ BA 1 Ⅱ. WPM [Ca(NO3)2 ·4H2O 1 668]+BA 0.5+GA3 0.2 Ⅲ.根诱导Root induction：1/2MS + IBA1+PUT 1 根形成Root development：1/2MS+活性炭Activated carbon 4 000 Ⅳ.移栽基质为草炭、珍珠岩和蛭石等体积混合 The rooted shoots were transplanted to vermiculite/peat/perlite (1/1/1，V/V/V) 完整植株 Plants 王新等，2016 (Wang et al., 2016)

离体培养的植物组织有时会进入一种特殊而稳定的状态，从外部形态上，它是一种质地紧实的细胞团结构；从内部结构上，它包括分生细胞、薄壁细胞和维管单元这3种细胞类型，并包含皮层和表皮2层组织(Mccown et al., 1988)。分生结节是一种不同于体细胞胚，但与植物体细胞胚具有等同价值的又一种植物体外再生方式，并在植物微繁殖和次生代谢产物的生产方面具有重要价值(Mccown et al., 1988)。牡丹分生结节培养研究起步较晚，且现有研究较少(表 1)。Gildow等(2006)首次以牡丹黄化嫩茎为外植体，诱导获得分生结节，但仅分化出不定根。钟原(2011)以紫斑牡丹的叶柄薄层为外植体诱导获得愈伤组织，然后由愈伤组织诱导发生分生结节，初步建立了牡丹分生结节增殖培养体系，并测定了分生结节中的芍药苷和丹皮酚含量，证实了分生结节培养在牡丹药用成分生产中的应用潜力。随后，Qin等(2012b)进一步优化了牡丹分生结节的发生体系，并对其分生结节的发生发育过程进行了组织切片观察和阶段划分，实现了‘Golden Era’(P. × lemoinei ‘Golden Era’)和伊藤杂种‘Barzella’(P. itoh‘Barzella’)分生结节的诱导和增殖，且‘Golden Era’的分生结节进一步分化不定芽，分化率为16%，但未能获得再生植株。

牡丹体细胞胚发生主要以胚为外植体，营养器官(叶柄、叶片和根等)也可用于诱导体细胞胚，但难度较大且尚未获得再生植株(表 1)。何桂梅(2006)以牡丹合子胚为外植体，研究发现基因型、诱导培养基和发育时期是影响体细胞胚发生的重要因素：紫斑牡丹比杨山牡丹(P. ostii)更容易诱导体细胞胚；成熟胚的诱导多表现为直接器官分化，幼胚和近成熟胚诱导体细胞胚效果较佳，可直接由胚轴分化体细胞胚，但只有紫斑牡丹的体细胞胚再生成苗，但成苗率较低，仅为5.8%。随后，周秀梅(2008)进一步优化了紫斑牡丹体细胞胚的诱导培养基，其诱导率高达63.3%，并获得了体细胞胚再生植株。朱向涛等(2012)以凤丹牡丹的胚、胚轴和子叶为外植体诱导体细胞胚，发现花后100天的胚诱导效果最佳，并进一步筛选出适宜其体细胞胚诱导的培养基，诱导率高达38.3%。殷丽青等(2013)研究发现，在培养基中添加4.0 mg·L^-1毒莠定可显著提高牡丹胚性愈伤组织和体细胞胚的诱导率。

目前在牡丹组织培养技术中，以鳞芽为外植体的无菌短枝扦插技术自李玉龙等(1984)首次报道以来获得了最广泛深入的研究，其在外植体、启动和增殖培养、生根培养和驯化移栽这4个方面都取得了较大进展。

基因型、外植体类型和取材时期是决定启动培养的关键因素(表 1)。在相同的环境条件下，早花品种萌动早，芽的诱导表现良好，中花次之，晚花品种萌动最晚(刘磊等，2008)。前人比较了不同类型外植体(顶芽、腋芽、萌蘖芽、萌生条)的启动培养效果，发现萌蘖芽的培养效果最好，萌发率最高(孔祥生等，1998；张桂花等，2001；Beruto et al., 2004)。早春2月为最佳取材时间，此时的芽刚经过低温休眠，芽体充分分化，营养物质累积充分，鳞片紧密，从而接种污染率低，成活率高，萌发快且生长健壮(孔祥生等，1998；张桂花等，2001)。鳞芽作为无菌短枝扦插的主要外植体，鳞芽的表面灭菌是该技术的首要步骤。前人从灭菌剂的种类和灭菌时间这2方面对牡丹鳞芽表面灭菌技术进行了研究，发现75%酒精灭菌25~30 s，再以0.1%升汞灭菌8~10 min效果最佳，此时外植体存活率高达100%(邱金梅，2010)。

WPM是牡丹增殖培养最常用的基本培养基，调节其中Ca²⁺浓度、NO₃^--N/NH₄⁺-N以及植物生长调节剂浓度是促进试管苗增殖和生长的有效手段(表 1)。提高WPM培养基中的Ca²⁺浓度不仅能有效防止继代芽的茎尖坏死，还能促进试管苗的增殖和生长(Bouza et al., 1994a；Li et al., 2008；文书生等，2016)。提高培养基中NO₃^--N/NH₄⁺-N的比值可促进牡丹试管苗的增殖和生长(Li et al., 2008；文书生等，2016)。Bouza等(1994a)比较了5种传统细胞分裂素[玉米素(Zt)、异戊烯基腺嘌呤(2iP)、激动素(KT)、异戊烯腺苷(iPA)和BA]对丛生芽诱导的影响，发现BA效果最佳。BA通常与GA₃配合使用以进一步提高增殖率，并促进茎段伸长(李玉龙等，1984；孔祥生等，1998；Wen et al., 2016a；王新等，2016)，但同时需提高培养基中Ca²⁺浓度以防止GA₃引发茎尖坏死(Bouza et al., 1994a；Li et al., 2008)。最新研究发现，在‘正午’牡丹(P.×leimonei ‘High Noon’)无菌短枝扦插的增殖阶段以新型细胞分裂素meta-Topolin(mT)替代BA，mT-GA₃与BA-GA₃组合对试管苗的增殖和生长具有基本等同的促进作用(Wen et al., 2016b)。综上，WPM[Ca(NO₃)₂ 1 544~ 1 668 mg·L^-1]+BA/mT+GA₃是牡丹增殖培养阶段最常用的培养基，但培养过程中需根据品种筛选最佳BA/mT和GA₃浓度配比。

牡丹试管苗生根的影响因素较为复杂，而培养基和生根方式是决定生根效果的关键(表 1)。牡丹试管苗生根最常用的基本培养基为1/2MS(Bouza et al., 1994b；1994c；孔祥生等，1998；Wen et al., 2016a；2016b；王新等，2016)。牡丹试管苗茎内不存在潜伏根原基(贺丹等，2011；贾文庆等，2013)，IBA是诱导其不定根发生的最有效生长素，采用速蘸生根法，试管苗生根率较高，且根系良好(李玉龙等，1984)。随后，Bouza等(1994c)比较了3种生根方式(一步生根法、速蘸生根法、两步生根法)的生根效果，发现两步生根法效果最佳，即先将试管苗于含高浓度IBA(15 mg·L^-1)的培养基上暗培养10天以诱导根原基，然后转至含活性炭、无植物生长调节剂的培养基培养以促进根的伸长。Beruto等(2007)进一步改良了两步生根法，即在生根前先将无根苗进行冷处理(2 ℃，7天)以促进生根。目前，改良的两步生根法是牡丹试管苗生根的最常用方法，但不同品种根诱导适宜的IBA浓度和诱导时间差异较大，例如牡丹‘Mme de Vatry’(P. suffruticosa‘Mme de Vatry’)为15 mg·L^-1 IBA暗培养10天(Bouza et al., 1994b)，‘正午’为1 mg·L^-1 IBA暗培养30天(文书生等，2016)，‘凤丹白’(P. ostii ‘Fengdan Bai’)为2 mg·L^-1 IBA暗培养30天(王新等，2016)。在上述改良的两步生根法基础上，Wen等(2016a)发现于含IBA的根诱导培养基中再添加腐胺(PUT)可有效促进牡丹试管苗生根，5.0、1.0和1.0 mg·L^-1 PUT可分别将‘乌龙捧盛’(P. suffruticosa‘Wulong Pengsheng’)、‘锦袍红’(P. suffruticosa‘Jinpao Hong’)和‘正午’的生根率由30%~50%提高到80%~100%。综上，诱导牡丹试管苗生根的常用方法为：先以1/2MS+IBA+PUT诱导不定根发生，再转入1/2MS+活性炭以促进不定根的伸长，但需根据品种来筛选最佳的IBA浓度、PUT浓度和根诱导时间。

此外，最新研究还发现在牡丹无菌短枝扦插的增殖阶段以mT替代BA，mT处理的试管苗生根率和移栽成活率更高，这表明在增殖阶段以新型细胞分裂素mT替代BA是提高生根率和移栽成活率的有效途径(Wen et al., 2016b)，但mT的有效性仍有待在更多牡丹品种中验证，且mT在牡丹无菌短枝扦插中的作用机理也值得深入研究。

Bouza等(1992)首次提出在牡丹无菌短枝扦插的根诱导阶段产生了顶芽休眠，未解除休眠的试管苗移栽后不生长，并逐渐死亡。前人尝试以冷处理解除牡丹试管苗的顶芽休眠，却发现冷处理无法彻底解除休眠，移栽60天后试管苗再次进入休眠状态，生长停滞，并逐渐死亡(Bouza et al., 1994d)，近期，在牡丹‘乌龙捧盛’、‘锦袍红’、‘正午’和‘凤丹白’试管苗的顶芽休眠研究中也得出了类似结论(Wen et al., 2016a；2016b；王新等，2016；文书生等，2016)。牡丹试管苗移栽最佳基质为珍珠岩、蛭石和草炭土等比混合(王新等，2016)，且于移栽过程中接种适宜的丛枝菌根真菌可大幅提高移栽成活率，并促进其后期生长(Wen et al., 2016a)。

胚珠和胚培养可使牡丹种胚快速萌发成苗，提高其种子萌发率，缩短萌发时间，从而加速育种进程。何桂梅等(2006)首次对紫斑牡丹和杨山牡丹胚珠培养进行了报道，发现发育早期的胚珠(花后48天以内)极难培养成功，而完成器官分化的胚珠(花后60天)可培养成苗，但成苗率极低(≤21.4%)。胚培养是指将种胚接种在无菌条件下培养使之直接发育成幼苗的技术，成熟胚(花后90天)的培养效果优于幼胚(花后65天内)，紫斑牡丹和杨山牡丹成熟胚的成苗率分别为71.6%和63.6%(何桂梅等，2006)。如何协调上、下胚轴的生长是牡丹胚培养的关键，其中植物生长调节剂发挥重要作用：BA可促进上胚轴伸长，但对下胚轴伸长有抑制作用；赤霉素(GA₃)可打破上胚轴休眠，促进上胚轴伸长，并促进胚根萌动，但导致弱苗现象(徐莉等，2017)；吲哚乙酸(IAA)促使种胚膨大，但仅上胚轴生长，不利于直接成苗(何桂梅，2006)；IBA可诱导促进牡丹不定根发生(Bouza et al., 1994c)。为了提高牡丹胚培养效率，刘会超等(2010b)在牡丹胚培养过程中，首先利用BA诱导丛生芽提高繁殖系数，再将丛生芽切分成单芽利用IBA诱导生根，这种两步培养方式可分别促进牡丹上下胚轴伸长，但操作复杂、生根率较低。最新研究发现，单独利用GA₃打破牡丹上胚轴休眠，同时在培养基中添加活性炭吸附抑制生长的有害物质，并将MS的大量元素加倍是实现牡丹胚培养的有效途径，该方法可有效促进上胚轴伸长，并利用活性炭的吸附作用和培养基大量元素加倍避免发生弱苗现象(徐莉等，2017)。

花药培养再生单倍体植株，然后经加倍获得纯合二倍体是花卉、林木染色体倍性创新的重要途径。早期关于牡丹花药(花粉)培养的研究主要由Sunderland工作组完成，他们发现处于第1次分裂期的花粉是最好的外植体，此时的花芽处于闭合状态，易于灭菌、消毒，且褐化程度最轻(Roberts et al., 1977)。组织培养过程中，花粉胚发育存在2种形式：1)花粉胚聚集成簇，即使在继代时将其分离培养，生长一段时间后还会聚集成团，偶尔会出现子叶体积大，但都没有形成正常的叶或枝。2)花粉胚独立生长，分化形成根和茎的两端，但进一步培养只形成根系，上部生长停滞，并最终死亡，对其幼苗采用根尖切片法检测染色体发现其为单倍体(Sunderland et al., 1975)。植物生长调节剂不是决定花粉胚诱导的关键因素，Sunderland等(1975)以不含植物生长调节剂的MS液体培养基培养，成功获得了四川牡丹(P. decomposita)的花粉胚。后期，关于牡丹花药(花粉)培养的研究未能取得新的突破性进展，Zenkteler等(1975)获得了牡丹多核花粉胚，其余研究仅获得了愈伤组织(Shoyama et al., 1990；陈怡平等，2001；朱向涛等，2010)。

牡丹组织培养技术历经约半个世纪的研究，在器官组织培养再生、胚珠和胚离体培养成苗以及花药(花粉)离体培养成苗这3个方面都取得了较大进展，但器官发生和花药(花粉)培养途径尚未获得完整植株，无菌短枝扦插途径以及胚珠和胚离体培养虽已获得完整植株，但离产业化以及育种的实践应用还有很大差距(图 1)，后期需围绕以下几个问题展开重点研究。

图 1 牡丹组织培养研究进展 Figure 1 Advances of tree peony tissue culture

1) 褐化：牡丹组培褐化严重，这对外植体的脱分化和再分化具有严重抑制作用。前人通过外植体预处理、调整培养基、控制培养条件、添加防褐剂等措施只能在一定程度上减轻褐化，建议后期研究在优化牡丹防褐技术的同时，进一步探究褐化发生机理从而为防褐技术的优化提供理论支撑。

2) 器官间接发生困难：在牡丹的器官发生途径研究中，前人围绕培养基、植物生长调节剂、培养条件等方面展开了大量研究，然而愈伤组织和分生结节再生成芽的比率仍然极低，后期研究宜重点关注抑制牡丹器官分化的内在因素及其作用机理，例如内源激素水平、内源抑制物、DNA甲基化水平等，深入探究上述问题对揭示牡丹器官发生的调控机制、构建促进牡丹器官发生的新方法皆具有重要意义。

3) 生根和移栽问题：目前牡丹无菌短枝扦插技术已初步形成体系，后期研究建议着力于采取措施打破试管苗的顶芽休眠，简化生根流程，缩减生根和移栽成本，以推进牡丹无菌短枝扦插技术实现产业化应用。尤其，顶芽休眠作为牡丹试管苗移栽成活率低的主导因素，其诱导因素且如何作用，冷处理为何无法打破试管苗的顶芽休眠，都是值得深入研究的科学问题。

总之，牡丹组织培养研究目前仍处于应用基础研究的初级阶段，尽管由于一系列问题限制了其在牡丹的繁殖和育种实践中的应用，但其离体快繁的理论可行性已被证实，且已有部分研究获得了移栽成活的组培苗。随着相关基础理论研究的深入，牡丹组织培养的关键问题会不断得到解决，高效且稳定的植株再生及离体快繁技术体系将会建立，继而大幅提高牡丹的繁殖和育种工作效率。