竹材是重要的森林资源，具有生长快、强度高、韧性大、刚性好、易加工等优点(Zhou et al., 2005；Jiang，2007)，在我国结构与工程材料领域被广泛应用。竹材的优良特性源自于其独特的解剖构造和精巧的化学组分分布。从宏观上看，竹材主要由维管束和基本薄壁组织构成，其中维管束是主要承载单元，也是连接微观到宏观性能的重要环节，其在竹壁中分布并不均匀，从竹青侧向竹黄侧逐渐由密集分布转向疏松排列，呈梯度变化(Amada et al., 1997；Dixon et al., 2014)。在微观层面上，竹材纤维细胞为厚薄交替的多壁层构造，这些壁层具有不同的微纤丝排列角度和不同的化学组成，是竹材具有高拉伸强度的主要原因之一(Gritsch et al., 2004)。

化学组分是所有宏观和微观结构形成的基础，因此研究竹材的化学组分分布对于认识竹材的结构和性质具有重要作用。目前，对竹材宏观层面的化学组分分布已经有了较为清楚的认识，普遍认为在宏观尺度下竹材具有梯度变化的化学组分分布。微观层面的化学组分分布以木质素分布研究居多，也有少量关于木聚糖、果胶及酚酸分布的报道(He et al., 2002；Suzuki et al., 2002；Chang et al., 2013)。对纤维素分布的研究主要是对不同竹龄竹材以及竹壁不同部位的纤维素含量进行比较分析(张齐生等，2002；江泽慧等，2006；刘力等，2006)，而关于竹材细胞壁中纤维素分布的研究则很少。木质素和纤维素是竹材细胞壁的重要组成成分，对细胞壁的性质具有重要影响。研究表明，木质素在细胞壁中的分布呈一定梯度变化，即从细胞角隅区到复合胞间层再到次生壁，木质素浓度逐渐减小(杨淑敏等，2010a；2010b；2012)，但其在单一壁层内的分布变化还不是很清楚。

拉曼光谱技术是研究植物细胞壁化学组分分布的理想技术手段，Wang等(2012)利用拉曼光谱技术同时获得了竹材细胞壁中木质素和纤维素的相关信息，但是木质素和纤维素在竹材细胞壁中的相对分布还未见报道。鉴于此，本研究利用高分辨率激光共聚焦拉曼显微镜对竹材纤维细胞进行原位光谱采集和分析，进一步研究木质素和纤维素在竹纤维多壁层结构中的分布变化，以揭示竹材细胞壁中木质素和纤维素的分布规律。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验所用材料为6年生毛竹(Phyllostachys edulis)，采自安徽黄山林场。试样取自茎杆第10竹节，新鲜试材，冷冻保存。

1.2 研究方法 1.2.1 样品制备

取竹壁中部竹材，加工成1 cm×1 cm×5 cm(T×R×L)的小竹块，用钨钢刀在滑走切片机上切取包含一个完整维管束、厚度为10 μm的竹材横切面，展平于载玻片中央，蒸馏水封片后立即进行拉曼光谱测试。为防止测试过程中因水分丧失对测试产生不利影响，盖玻片四周采取树脂涂布固封处理。

1.2.2 测试方法

采用Renishaw公司生产的inVia显微拉曼光谱仪进行光谱采集和扫描成像。该仪器配备德国Leica共聚焦显微镜和高精度三维自动平台，应用光栅尺反馈控制技术，使自动平台移动实现了较好的重复性(±0.2 nm)和较高的控制精度(X、Y轴横向扫描步长为0.1 μm，Z轴纵向扫描步长为1 μm)。采用532 nm波长激光为激发光源，100倍油镜(NA=1.4)采集拉曼信号，空间分辨率理论计算值为0.23 μm(0.61λ/NA)。

采用矩形扫描和直线扫描2种光谱采集模式。矩形扫描主要用于成像分析，采谱时采用快速扫描功能(StreamLine HR)，设置较短的曝光时间(0.66 s)，以提高扫描速度，扫描步长为0.33 μm。直线扫描主要用于组分分析，单谱曝光时间适当延长(3 s)，以提高光谱采集的信噪比。

2 结果与分析 2.1 木质素和纤维素在细胞壁中的分布

为了直观表达木质素和纤维素在细胞壁中的分布，以1 600 cm^-1作为木质素的特征峰(Agarwal et al., 1997；Gierlinger et al., 2007；Sun et al., 2010)、2 893 cm^-1作为纤维素的特征峰(Gierlinger et al., 2006)分别进行成像，结果见图 1。图 1A为被测细胞的光学形貌，可以看出竹纤维细胞壁较厚，且具有多层结构，而细胞腔较小。不同壁层之间由于折射率差异，在光学显微镜下呈现明显分层，包括最外围的复合胞间层在内，被测细胞具有7层厚度不一的壁层。图 1B和C分别为木质素和纤维素在细胞壁中的分布，图 1D为二者在细胞壁中的相对分布。从分布图来看，木质素在细胞外围(CC、CML、L2、L3)和细胞腔附近(L5、L6)的分布密度相对较高，在细胞中部(L4)的分布密度较低。纤维素在宽层(L2、L4)中的分布密度较高，在窄层(L3、L5、L6)中的分布密度较低，在细胞角隅及复合胞间层中的分布密度最小。

2.2 细胞半径方向木质素和纤维素的分布变化

为了进一步揭示木质素和纤维素在竹材纤维细胞壁中的分布细节，对竹材纤维细胞壁进行高分辨直线扫描(扫描步长为100 nm)，通过监测木质素和纤维素拉曼谱峰峰强的变化研究其在细胞壁中的分布变化，结果见图 2。图 2A为被测细胞的结构示意图，具有3个宽层(L2、L4、L6)和3个窄层(L3、L5、L7)。图 2B为木质素和纤维素的分布密度沿细胞径向方向的变化情况。从纤维素的分布来看，在细胞中部至细胞腔之间的壁层(L4、L5、L6)中，纤维素的分布密度变化不大，而在胞间层附近的壁层内(L2)，纤维素的分布密度则有明显下降趋势，在复合胞间层内的分布密度最小。在某些壁层之间的过渡处，如CML与L2、L3与L4、L6与L7层之间，纤维素分布密度有明显的波动变化。从木质素的分布来看，由细胞外围向细胞腔方向，木质素的分布密度总体呈逐渐降低趋势，且这种降低趋势在细胞外围的壁层中变化特别明显，如CML、L2、L3、L4等壁层内，分布密度曲线比较“陡峭”，在细胞中部的壁层中(L5、L6)，木质素分布密度变化变得平缓，在靠近细胞腔的区域内(L7)，木质素分布密度稍有升高。由于纤维素在细胞壁大部分区域内的分布都相对稳定，因此将木质素分布密度与纤维素分布密度相比更能反映木质素的分布变化。相比纤维素而言，木质素在细胞外围和细胞腔周围的分布更多。从复合胞间层进入次生壁后，木质素的分布急剧减少，而在次生壁的大部分区域内，木质素和纤维素的比例保持稳定。

将不同壁层内木质素和纤维素的谱峰强度进行平均，以复合胞间层的平均值为基准进行比较，获得了不同壁层之间木质素和纤维素分布密度的相对变化，结果见图 3。就木质素而言，次生壁各层的分布密度均低于复合胞间层，呈阶梯性变化，其中细胞中部(L4、L5)的分布密度最低，约为复合胞间层的0.5倍。纤维素则正好相反，次生壁各层的分布密度均高于复合胞间层，在细胞中部壁层(L4、L5)的分布密度最高，约为复合胞间层的1.7倍。由细胞中部向细胞腔及细胞外围，各壁层的平均纤维素分布密度呈逐渐降低趋势。木质素与纤维素相对分布密度的变化趋势与木质素的变化相似，但变化幅度更大。相比纤维素而言，木质素在细胞中部壁层(L4、L5)的分布最少，约为复合胞间层的0.3倍。

2.3 竹材细胞壁光谱变化

图 4为竹材细胞壁径向不同位置的拉曼光谱，其中图 4A为被测细胞的光学形貌图，光谱采集位置如图中白色三角所示。从细胞腔一侧向细胞外围沿直线进行等距离采谱，采谱点分别记为a、b …j、k，两点之间的距离为1 μm。以细胞腔边缘为起点，各测试点距离细胞腔边缘的距离分别为0.8、1.8、2.8、3.8、4.8、5.8、6.8、7.8、8.8、9.8和10.8 μm。上述不同位置的拉曼光谱见图 4B。从谱图的变化来看，距离细胞腔边缘不同位置的壁层，其化学组成存在明显差别，变化最为明显的谱峰位置反映在1 170 cm^-1和1 202 cm^-1。1 170 cm^-1为羟基肉桂酸的拉曼特征峰，1 202 cm^-1为木质素对羟苯基苯丙烷结构单元(即H型结构单元)的拉曼特征峰(Ram et al., 2003；Saariaho et al., 2003；Sun et al., 2010)。从图中看，羟基肉桂酸的特征峰在前3个采谱点(a、b、c)的光谱中未见，在距离细胞腔边缘3.8 μm的d点才开始出现，随后其谱峰强度随着距离增加而增大，在距离细胞腔边缘最远的k点约为细胞角隅位置时达到最大谱峰强度。这一变化表明，羟基肉桂酸在细胞角隅的分布密度最高，向细胞内部过渡时含量逐渐减少，在细胞腔周围含量很少，甚至没有。H型木质素结构单元的特征峰在前4个采谱点(a、b、c、d)的光谱中未见，在距离细胞腔边缘4.8 μm的e点才开始出现微弱信号，但其信号在距离更远的f、g、h位置也同样很微弱，而在细胞外缘的i、j、k 3个位置处则有明显增强，这表明H型木质素结构单元主要分布在细胞壁外缘，在细胞壁内部分布很少，甚至没有。谱峰1 268 cm^-1和1 333 cm^-1在所有采谱点的光谱中都能观察到，其分别是由木质素中的愈创木基(即G型木质素)和紫丁香基(即S型木质素)结构单元所引起的(Saariaho et al., 2003；Sun et al., 2010；2012)，表明这2种结构单元广泛分布于细胞壁中。谱峰1 600 cm^-1和1 629 cm^-1在所有的谱图中都很明显，并且从细胞腔向细胞外围，其峰形逐渐变得尖锐，表明其所代表组分的分布密度逐渐增高。

以复合胞间层的谱峰强度为基准，将不同采谱点的谱峰强度与之相比，获得不同化学组分在细胞壁不同位置处的相对分布变化，结果见图 5。1 268 cm^-1和1 333 cm^-1谱峰相对强度的变化相似，由细胞腔向细胞角隅方向均表现为先增大后减小然后再增大的变化，表明G型和S型木质素在次生壁中的分布密度均小于复合胞间层，但在局部区域有聚集，以S型木质素来看，其在距离细胞腔约4 μm的位置有大量聚集，分布密度几乎与复合胞间层相当。1 600 cm^-1和1 629 cm^-1谱峰相对强度的变化与1 268 cm^-1和1 333 cm^-1谱峰相似，但是局部升高的趋势没有后二者明显，相对分布密度整体呈现由复合胞间层向细胞腔方向降低的趋势。1 170 cm^-1和1 202 cm^-1谱峰相对强度从右向左有很明显的下降趋势，在距离细胞腔约3 μm时，相对强度下降到零点，表明由复合胞间层向细胞腔方向羟基肉桂酸及H型木质素迅速减少，在靠近细胞腔时二者基本没有分布。

3 讨论

竹纤维细胞具有独特的多壁层结构，这种结构对竹材的力学性质有重要影响。Parameswaran等(1976)在对竹材解剖构造的研究中发现，竹纤维细胞壁由数层厚薄不同的壁层交替构成，宽壁层中木质素的分布密度要比窄壁层中低。本研究所得结果也印证了这一点，如图 1B所示，那些厚度较小的壁层(L3、L5)，其木质素分布密度要比相邻厚度较大的宽壁层(L2、L4)高，形成了局部聚集分布，说明木质素集中分布在纤维细胞的窄壁层中。除了在宽窄壁层中的分布有差别外，木质素在整个纤维细胞径向方向上的分布也有差别，呈现一定的梯度变化，即从细胞角隅区到复合胞间层再到次生壁，木质素的分布密度逐渐减小，这与杨淑敏等(2010a；2010b；2012)的研究结果一致。通过木质素和纤维素的相对分布可以看出，纤维素主要分布在宽壁层中，木质素则集中分布在细胞角隅、复合胞间层、宽壁层之间以及细胞腔周围，这种分布模式是竹材细胞适应生存环境的结果。纤维细胞是竹材力学强度的主要来源，其强度主要取决于多壁层结构之间结合的强弱。木质素在纤维细胞壁中的局部聚集分布使得纤维细胞不同层次结构之间相互紧密结合，增强了细胞和组织的整体强度，可有效抵抗外部压力的破坏。值得注意的是，除了木质素总量分布不同外，竹纤维细胞壁中木质素结构单元的分布也各不相同，最为明显的是H型结构单元。与S型和G型结构单元广泛分布于细胞壁各壁层中不同，H型结构单元在纤维细胞壁中主要分布在细胞壁外缘，细胞壁内部分布很少，甚至没有。H型结构单元是竹材与木材木质素的主要差别所在，其在竹材细胞壁中的作用和积累过程还有待于进一步研究。

4 结论

通过对竹材纤维细胞横切面的拉曼光谱分析，发现细胞壁的化学组成在细胞径向方向存在明显变化。S型和G型木质素广泛分布于细胞壁各壁层中，而H型木质素主要分布在细胞壁外缘。羟基肉桂酸的分布与H型木质素类似。

纤维素均匀分布于次生壁的宽层中，在胞间层和次生壁窄层中的分布密度较小；木质素则主要分布在上述纤维素分布密度低的区域中，其中在胞间层中的分布密度最大，从细胞外围向细胞内部分布密度呈阶梯状降低；在细胞腔周围的壁层中也有相对较高的木质素分布密度。