2018, Vol. 54
文章信息
- 姚伍, 郑催云, 陈红梅, 刘侃诚, 韩正敏
- Yao Wu, Zheng Cuiyun, Chen Hongmei, Liu Kancheng, Han Zhengmin
- 福建三明市应用Smal-007菌剂防治松材线虫病的效果
- Control Effect of Pine Wilt Disease Using A Biological Control Agent of Smal-007 in Sanming, Fujian Province
- 林业科学, 2018, 54(1): 168-173.
- Scientia Silvae Sinicae, 2018, 54(1): 168-173.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20180119
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文章历史
- 收稿日期：2016-09-05
- 修回日期：2017-05-27
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作者相关文章
2. 南京林业大学林学院 南京 210037
2. Forestry College, Nanjing Forestry University Nanjing 210037
松材线虫病又称松树萎蔫病，俗称“松树的癌症”，是一种毁灭性的松树病害，引起松树迅速死亡，给国民经济和生态安全造成严重损失(杨宝君等，1988；2003)。该病害在东亚的中国、日本、朝鲜和韩国，北美的美国、加拿大和墨西哥，欧洲的葡萄牙和西班牙等国家均有发生(Nickle et al., 1981；Mota et al., 1999；Mamiya，1983；Abelleira et al., 2011)。我国最早于1982年在南京中山陵的黑松(Pinus thunbergii)上发现松材线虫病，因我国种植松树面积大、感病寄主多、传播媒介分布广、气候条件适宜，该病有着相当广泛的适生区(程瑚瑞等，1983；张锴等，2010)。截至2015年初，松材线虫病在我国已扩散至江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、河南、湖北、湖南、广东、广西、重庆、四川、贵州、云南和陕西16个省(区、市)的187个疫区(国家林业局2015年第3号公告)。对于该病害的防治，虽然国内外在控制天牛、杀灭线虫、抗病育种等方面进行了不少工作，但还不能有效控制该病害的流行。
美国是松材线虫病的原产地，但美国很少有松树大面积枯死。分析美国松材线虫病流行稳定下来的原因，无非从病原、传播媒介、寄主和环境等方面入手。首先应排除环境条件差异和寄主抗病性问题。美国在纬度上和我国相差无几，温湿度条件也没有明显不同，所以温湿度等环境条件不可能是主要原因。寄主方面，松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)可以侵染所有松属(Pinus)植物。在美国感病的松树种类也很多，如美国五针松(P.strobus)、北美沙松(P.clanusa)、赤松(P.sylvestris)、湿地松( P.elliottii)和短叶松(P.banksiana)等，这些松树经测定都是非常感病的(杨宝君等, 1993)，所以也同样可以排除松树的抗病性问题。还有观点认为，美国没有松墨天牛(Monochamus alternatus)，而松墨天牛在我国和日本是该病害的主要传播媒介，但美国有卡来罗纳墨天牛(M.carolinensis)，也同样可以有效传播松材线虫(宁眺等, 2004)。所以问题的焦点在于病原松材线虫方面，实际上一些人已注意到，美国的松材线虫虫株致病力的确很弱(Bergdahl，1988；Dropkin et al., 1979)，而这与其线虫体表附着的细菌有一定关系(曾腓力等，2012；贲爱玲等，2013)。
Smal-007是南京林业大学森林病理实验室从美国松材线虫体表分离筛选到的一株嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomnas maltophilia)，该菌因致病力弱、定殖和替代能力强、对环境安全无毒等特点，具有防治松材线虫病的潜能(曾腓力等，2012；贲爱玲等，2013)。在安徽安庆、怀宁和当涂等地小面积的林间防治试验，均收到满意的防治效果(刘侃诚，2013；孙京天，2014)。为进一步了解生防菌Smal-007对松材线虫病的防治作用，本研究于2014—2015年在福建省三明市林区喷洒Smal-007菌剂，进一步评估生防细菌Smal-007在我国南方林区的应用效果。
1 材料与方法 1.1 试验地概况和试验区设置试验地分布于福建省三明市的梅列区、三元区和沙县。三明市地处福建省西北部，位于116.22°—118.39°E和25.30°—27.07°N之间，年均气温19.2 ℃，年均降雨量1 700 mm，无霜期300天。该地区气候温和，雨量充沛，冬短夏长，属中亚热带气候。梅列区和三元区在三明市近郊，沙县在市区东北部，闽江支流沙溪下游。
梅列区试验地103.3 hm2，为马尾松(Pinus massoniana)纯林，共设7个试验小区，其中防治区65.1 hm2，对照区38.2 hm2。三元区试验地100.0 hm2，多为马尾松阔叶混交林，共设11个试验小区，其中防治区51.7 hm2，对照区48.3 hm2。沙县试验地分属2个村镇，即凤岗街道和青州镇：凤岗街道试验地82.4 hm2，多为马尾松纯林，共设10个小区，其中防治区56.5 hm2，对照区25.9 hm2；青州镇试验地77.9 hm2，多为马尾松阔叶混交林，共设15个试验小区，其中防治区53.6 hm2，对照区24.3 hm2。
试验地多为马尾松天然次生林，小部分为人工林。马尾松纯林(10×马尾松)，林分密度约1 000株·hm-2；马尾松混交林(5~9×马尾松)，林分密度根据其他树种比例略有变化，但以马尾松为主。试验地防治区和对照区的林分特点和发病状况尽量一致，但考虑到飞机喷洒因素，防治区布置相对集中。防治区和对照区都进行松墨天牛引诱工作，采取悬挂APF-Ⅰ型引诱器(福建农林大学生产)引诱天牛，悬挂密度一般为每6.67 hm21个。防治区和对照区每年都进行病枯死树的砍除，一般每月巡察1次，发现枯死树即进行GPS定位、记录并砍除。
1.2 供试菌株Smal-007菌株从美国松材线虫体表分离，经鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌，保存于南京林业大学森林病理实验室。
1.3 Smal-007菌剂制备将保存于NA平板(牛肉浸膏3 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、氯化钠5 g·L-1、琼脂16.0 g·L-1、pH7.0)上的Smal-007菌株划线活化，挑取单菌落接种于NB培养基中，28 ℃、180 r·min-1于恒温摇床上震荡培养36 h左右，作为种子液，将种子液倒入装有发酵培养基的发酵罐中发酵。发酵培养基和发酵主要参数参照刘侃诚(2013)方法进行。
发酵好的Smal-007菌剂，装入灭菌的25 kg塑料桶中保存运输。
1.4 菌剂喷洒及结果检查Smal-007菌剂喷洒采用2种方式，即海燕650-C型轻型飞机喷洒和小松MD6200喷雾机人工喷洒。2014年5月初进行第1次喷洒。在三元区和沙县试验地，使用轻型飞机喷洒，喷洒量为6~7 kg·hm-2；在梅列区试验地, 使用喷雾机人工喷洒，喷洒量为12~15 kg·hm-2。林间喷洒尽量均匀全面，不留死角。喷洒选择无雨的天气进行，尽量保证喷洒后48 h内无降雨。2015年5月初进行第2次喷洒，喷洒方式和喷洒量与2014年相同。各试验地分别选取立地条件和发病条件基本相同的林地作为对照区。每年6—12月，对各试验区松材线虫病枯死树进行调查统计，结合对照区病死树情况，评价Smal-007林间防治效果。
防治效果计算方法如下：
枯死株降低率(%)=(防治前平均每公顷枯死株数-防治后平均每公顷枯死株数)/防治前平均每公顷枯死株数×100%；
防治效果(%)=[(100-对照区枯死降低率)-(100-防治区枯死降低率)]/(100-对照区枯死降低率)×100%。
1.5 生防菌林间定殖跟踪采用诱捕天牛并检测其携带的松材线虫黏附细菌来跟踪生防菌林间存活情况。于喷洒Smal-007菌剂后当年和第2年7月，在林间悬挂APF-Ⅰ型引诱器诱捕松墨天牛。采用贝尔曼漏斗分离松墨天牛活体上的线虫。对分离得到的松材线虫，于显微镜下用移液枪吸取10条成虫，置于无菌研钵中研磨，加无菌水稀释后，吸取研磨液涂布于金氏培养基上，25 ℃恒温培养36 h，观察培养基上长出的菌落。根据菌落形态、大小和发荧光等现象进行初步分类。对疑似Smal-007菌株的菌落，采用酶联免疫仪抗体标记检测进行鉴别(孙京天，2014)。以没有喷洒菌剂林分诱捕的松墨天牛作为对照。
1.6 数据分析采用SPSS13.0软件进行处理间差异性检验。
2 结果与分析 2.1 菌剂林间防治效果2014年5月在梅列区和三元区试验地喷洒菌剂时，天气条件均比较好，喷洒后48 h无降雨；但在沙县凤岗和青州试验地喷洒菌剂时，喷洒后24小时开始降雨，雨量中等。2015年5月在梅列区和三元区试验地喷洒菌剂时天气条件均比较好，喷洒后48 h无雨；但在沙县试验地喷洒后3 h就开始下雨，雨量大。
分别于2013、2014和2015年12月对试验地防治区和对照区进行松材线虫病枯死树调查，结果见表 1。
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根据表 1结果计算枯死树降低率和防治效果(表 2)。由表 2可知，人工喷洒Smal-007菌剂的梅列区试验地，松树枯死株数明显减少，2014年较2013年松树枯死株率降低91.8%，2015年较2013年松树枯死株率降低100.0%，而对照区松树枯死株率仅降低9.9%；防治区与对照区相比，2014年防治效果为90.9%，2015年防治效果达100.0%。飞机喷洒Smal-007菌剂的三元区试验地，松树枯死株数也明显减少，2014年较2013年松树枯死株率降低94.1%，2015年较2013年松树枯死株率降低95.4%，对照区松树枯死株率分别降低10.1%和36.7%；防治区与对照区相比，2014年防治效果为93.4%，2015年防治效果为92.7%。飞机喷洒Smal-007菌剂的沙县凤岗试验地，松树枯死数也有所减少，2014年较2013年松树枯死株率降低30.5%，2015年较2013年松树枯死株率降低67.4%，对照区松树枯死株率2014年没有减少，2015年还有所增加；防治区与对照区相比，2014年防治效果为30.5%，2015年防治效果为69.4%。飞机喷洒Smal-007菌剂的沙县青州试验地，松树枯死株数也有所减少，2014年较2013年松树枯死株率降低38.0%，2015年较2013年松树枯死株率降低27.8%，对照区松树枯死株率分别降低15.4%和9.6%；防治区与对照区相比，总的防治效果不明显，2014年为26.7%，2015年仅为20.1%。
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2014和2015年7月，在试验地诱捕松墨天牛，检测携带生防菌的松墨天牛数量，评估生防菌在林间的存活情况。喷洒菌剂当年，诱捕到的30头松墨天牛中，仅有10头携带生防菌；连续喷洒菌剂2年后，松墨天牛携带生防菌的比例有所增加，但也仅为66.9%(表 3)。
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Smal-007菌剂的防治是通过替代松材线虫体表的产毒细菌而实现的(曾腓力等，2012)。Smal-007菌剂喷洒到林间后，细菌可在松树的针叶、树皮甚至杂草表面定殖和繁衍，当松墨天牛羽化后在林间活动或补充营养时，就可以黏附到生防菌(刘侃成，2013)。由于生防细菌更适合在松材线虫体表繁殖，因此被松墨天牛携带的松材线虫体表致病细菌就很容易被生防菌所替代。由于生防菌Smal-007的产毒能力很低，被生防菌定殖的松材线虫也就失去了对松树的致病能力。当黏附生防菌的松墨天牛取食松树嫩枝时，即便松材线虫侵入松树，但由于携带生防菌的线虫因产生毒素能力较低，不能致死松树细胞，所以取食伤口内的线虫也不能扩大繁殖并进一步扩展，伤口会慢慢愈合(刘侃诚，2013)。
根据Smal-007菌剂的防治原理，生防菌喷洒到林间后，其防治效果的显现存在一定的滞后效应。原因之一是生防菌并不能主动侵入树体，对已经被感染的松树没有治愈能力；其二是喷洒到林间的生防菌，并不能使所有的松墨天牛在短期内携带。喷洒菌剂当年林间仅有33.3%的松墨天牛携带生防菌，连续喷洒2年后有66.9%的松墨天牛携带生防菌。所以，喷洒Smal-007菌剂至少要连续进行2年。
Smal-007菌剂喷洒到林间后，能够被松墨天牛黏附和携带。携带生防菌的松墨天牛，即使传播了松材线虫，也不会使松树感病死亡，而且还可将生防菌传染到其他松墨天牛体上。随着松墨天牛在林间活动和繁殖，越来越多的松墨天牛携带生防菌。只有当松林内的松墨天牛都黏附到生防菌，整个松林才处于生态平衡状态，松树也就不会大量死亡。所以，喷洒Smal-007生防菌后，松林内有一定数量的松墨天牛对防治效果并没有大的影响。
Smal-007菌剂喷洒到林间后，需要一定的时间生长繁殖，细菌才能在针叶或树皮表面稳定定殖，而降雨等因素会对细菌定殖产生影响(乔雪娟，2012)。如果在喷菌后48 h内下雨，针叶或树皮表面没有完全定殖的细菌就很容易被雨水淋洗掉。本研究中，由于三明地区5月雨水较多，尽管在喷洒菌剂前参考了当地天气预报，但不巧的是沙县试验地的2次喷洒都遇到了降雨天气，这可能也是沙县试验地防治效果不理想的主要原因。
4 结论本研究在福建三明林区进行Smal-007生防菌喷洒试验并取得良好结果，结合已有防治试验，说明Smal-007生防菌能够在已经完成林间试验的松材线虫病疫区推广应用。虽然我国南方如福建、广东、广西、贵州、浙江和江西等大多林区也发生松材线虫病，但由于生物防治制剂的地域特殊性，建议这些地区开展类似的林间防治试验。
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