促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用，可将细胞外的信号转入胞内，影响其下游基因的表达，从而调节生物体内各种生理反应，响应外界环境。植物中的MAPK基因最早在紫花苜蓿(Medicago sativa)中被鉴定，此后陆续在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)等植物中被发现(Duerr et al., 1993；Mizoguchi et al., 1996；Zhang et al., 1998；He et al., 2000)。随着分子生物学和基因组测序的快速发展，MAPK基因家族的鉴定和功能研究已在多种单子叶和双子叶植物中报道。前人研究表明，在拟南芥MAPK级联中的AtMPK9和AtMPK12可调控干旱诱导的气孔运动(Fabien et al., 2009；Salam et al., 2013)，MPK6在盐胁迫条件下参与调控磷脂酸的积累(Yu et al., 2010)，过表达MKK4能够降低转基因拟南芥株系的水分损失率并提高其耐旱性(Tsugama et al., 2012)。拟南芥AtMEKK1、AtMKK2和AtMPK4/MPK6被发现可调控盐胁迫(Teige et al., 2004)，主要通过直接磷酸化来激活盐胁迫响应基因(如SOS1、ZAT6、RD29A和RD29B等)，从而提高植物的抗盐能力(Yu et al., 2010；Liu et al., 2012)。植物MAPK也能够响应温度胁迫。烟草细胞中的HAMK(heat-activated MAP kinase)可促使HSP70蛋白积累，调控对高温胁迫的适应(Suri et al., 2008)。拟南芥和玉米(Zea mays)中的MAPK能够被冷胁迫诱导(Ichimura et al., 2000; Pan et al., 2011)，过表达玉米ZmMPK4提高了转基因烟草对低温胁迫的耐受性(Zhou et al., 2012)。此外，MAPK还参与了植物对氧化胁迫、机械损伤和重金属胁迫等非生物胁迫的响应(Liu et al., 2010；Lumbreras et al., 2010；Zhou et al., 2012)。尽管MAPK已在多种植物中被鉴定，但其在逆境胁迫中的功能主要在草本植物中被解析，在木本植物中还不清楚。

桑树(Morus)光合作用强、生长迅速，还具有对干旱、洪涝、盐碱害和冷害等逆境胁迫良好的抵抗能力，而对桑树的抗逆性机制的研究较少。在前期研究中鉴定了10个桑树MAPK基因，发现其能够被不同胁迫处理诱导表达，表明桑树MAPK在不同的胁迫处理中发挥着一定的作用(Wei et al., 2014)。为了探究MAPK在桑树非生物胁迫响应中的作用机制，本研究对川桑(Morus notabilis)MnMAPK5进行上游启动子活性分析，并探究其在拟南芥中过量表达对植株抗性的影响。

生态型拟南芥Columbia(西南大学罗克明教授惠赠)用于遗传转化；植物过表达载体pLGNL和pBI121由实验室保存；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404(实验室保存)用于拟南芥的遗传转化。

依据MnMAPK5(GenBank登录号：KF683080) 和EGFP 基因序列信息及pLGNL载体上的多克隆位点，找到的合适的酶切位点有Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ、Spe Ⅰ，并设计相应的引物。以川桑叶片的cDNA为模板进行PCR扩增MnMAPK5，经过T克隆验证后将MnMAPK5与EGFP一同连接到pLGNL载体上，并通过冻融法转入根癌农杆菌中。将含阳性质粒的农杆菌接种至YEB液体培养液中，培养至OD=0.8，然后用渗透培养基(MS+10 mmol·L^-1 MgC1₂+ 100 mmol·L^-1 AS+0.01% (W/V) MES)重悬菌体至OD₆₀₀=0.8。使用重悬菌液侵染洋葱(Allium cepa)表皮细胞20 min后于16 h光照/8 h暗培养16~24 h。最后取出洋葱表皮用DAPI染色4 min，压片法制片，于荧光显微镜下观察并拍照。

从川桑基因组数据库(http://morus.swu.edu.cn/morusdb/)中获取MnMAPK5的上游1 500 bp的序列作为启动子分析序列，使用PlantCARE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)在线软件预测其顺式作用元件。

根据获得的MnMAPK5启动子序列设计引物(上游引物序列：5′-CCAAGCTTCTCAACTGTGTAG-3′；下游引物序列：5′-CGGGATCCTTTCTCCGATGA CTCTTTG-3′)，并在上下游引物中分别加上酶切位点Hind Ⅲ和BamH Ⅰ，以川桑基因组为模板进行PCR扩增，采用1%的琼脂糖凝胶分离PCR产物，切下目的条带，使用胶回收试剂盒回收，最后克隆进入pMD19-T载体中并转入DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆并进行测序鉴定。将获得的含MnMAPK5启动子片段的T载体进行双酶切，并利用T4连接酶(Promega)将酶切产物连接到pBI121载体上。

将构建完毕的植物表达载体转入根癌农杆菌LBA4404中，侵染开花期的野生型拟南芥植株。用含有抗生素的MS培养基筛选收获的T0代拟南芥种子，并进行GUS染色和分子检测获得阳性植株。经过连续筛选得到的T3代种子用于后续试验。将种子在MS培养基中培养6天，再将其转入含有100 mmol·L^-1 NaCl或30%PEG的MS培养基中处理0，1，3，6，9，12，24 h。将MS培养基中培养6天的拟南芥置于40 ℃和4 ℃环境下0，1，3，6，9，12，24 h。将处理后的材料进行GUS染色，并在解剖显微镜下进行拍照和记录。

为进一步研究MnMAPK5的功能，构建了MnMAPK5过表达的载体。根据报道的川桑MnMAPK5的CDS序列设计引物(表 1)，并在上下游引物中分别加上酶切位点Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ，以川桑叶片的cDNA为模板进行PCR扩增，目的片段经T克隆验证后连接到pLGNL载体上，并按照1.3中描述的方法获得T3代转基因拟南芥种子用于胁迫处理试验。将春化2天的野生型和转基因拟南芥消毒后均匀铺到含1/2 MS的培养基上进行不同胁迫下的种子萌发试验。将在正常MS培养基中培养5天的拟南芥种子进行胁迫处理2周后，对根长进行统计。将在正常MS中培养1周的幼苗转入营养土中继续培养，培养2周后进行胁迫处理；当野生型和转基因拟南芥的表型呈现明显差异时，拍照、记录，并测定其生理指标，包括丙二醛含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、叶绿素含量、过氧化氢含量、过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性等指标。

表 1 MnMAPK5基因扩增和实时荧光定量PCR所用引物 Tab.1 The primer sequences used for amplification of MnMAPK5 and quantitative real-time PCR

表 1 MnMAPK5基因扩增和实时荧光定量PCR所用引物 Tab.1 The primer sequences used for amplification of MnMAPK5 and quantitative real-time PCR 基因Gene 上游引物Forward primer 下游引物Reverse primer MnMAPK5 5′-GGGGTACCATGGAGAGCGAGAATGAGTATTC-3′ 5′-CGGGATCCGGCTATTCCAGCATATTATCTGG-3′ AtPOD 5′-GGTTGTGACGCATCCATCTTGTT-3′ 5′-TCCACCGCAGCTTTCATTCTAT-3′ AtCAT 5′-CCCTGTATTCTTCGTCCGTGAT-3′ 5′-TTCTCCTGAATGTGAGACTTGGG-3′ AtRAB18 5′-GGTGGCCGTTAAGCTTCGA-3′ 5′-CACAATACAACGACCGAATGCG-3′ AtRD22 5′-GGTTCGGAAGAAGCGGAGAT-3′ 5′-GGAAACAGCCCTGACGTGAT-3′ AtMYB44 5′-CAAACCGTAGCCACGAGTCAAC-3′ 5′-TCCTCAATCGCACCTCTAAACC-3′ AtABF4 5′-GAGGACGAAGAAGCAATACAGGT-3′ 5′-GCAGTTCTTGATTCGTTTTCTTGAGC-3′ Atactin2 5′-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3′ 5′-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3′

参照RNA抽提试剂盒说明书(TaKaRa)提取总RNA，分别取适量RNA进行电泳检测，并用NANODROP 2000检测RNA的浓度和质量。以总RNA为模板，参照反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)说明书合成cDNA第1链，并使用以内参基因设计的引物检测是否有基因组污染。

参照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ Kits说明书进行实时荧光定量PCR分析，反应体系和运行程序参考作者此前的报道(Wei et al., 2014)。以MnRPL15为内参基因，使用2^-ΔCt法计算MnMAPK5相对于内参基因MnRPL15的表达量，其相对表达量定义为2^{-[Ct(target gene)-Ct(control gene)]}。使用Excel进行数据处理，使用SPSS16.0软件进行差异显著性分析。

使用CELLO version 2.5在线软件预测MnMAPK5定位在细胞核和细胞质中；而使用cNLS Mapper和NucPred在线软件预测却发现MnMAPK5的核定位信号很弱。为确定MnMAPK5的亚细胞定位情况，构建了35S-MnMAPK5 ∷EGFP和35S-EGFP过表达载体(图 1A)，并将其分别在洋葱表皮细胞中转染。在荧光显微镜下观察发现(图 1B)，在转化了35S-MnMAPK5 ∷EGFP的表皮细胞的细胞核和细胞质有荧光信号，与转化了35S-EGFP的表皮细胞相似，表明MnMAPK5行使功能的场所可能在细胞质和细胞核中。

图 1 MnMAPK5在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位 Fig.1 Subcellular localization of MnMAPK5 in onion epidermal cells A：35S-MnMAPK5∷EGFP和35S-EGFP的载体结构示意图；B：35S-EGFP和35S-MnMAPK5∷EGFP在洋葱表皮细胞的瞬时表达。 A: Structure diagram of the 35S-MnMAPK5∷EGFP and 35S-EGFP vectors; B: Transient expression of 35S-EGFP and 35S-MnMAPK5∷EGFP in onion epidermal cells.

为研究MnMAPK5启动子的活性，从川桑基因组数据库中获得了MnMAPK5基因上游的的启动子序列，并进行了克隆。使用PlantCARE在线软件预测出MnMAPK5启动子序列中含多种顺式作用元件，主要包括胁迫(包括生物和非生物胁迫)相关元件、植物激素响应相关元件和植物生长发育相关元件3种类型，如ARE、HSE、LTR、MBS、AuxRR-core和CGTCA-motif等(图 2)。

图 2 MnMAPK5上游启动子顺式作用元件分析 Fig.2 Analysis of cis-element in the 5′-upstream region of MnMAPK5 长方形表示光响应调控元件，椭圆表示生物和非生物胁迫响应调控元件，菱形表示激素响应调控元件，对三角表示生长发育相关调控元件。 The rectangle repesents light responsive element, the ellipse represents cis-acting element involved in stress responsiveness, the rhombus represents hormone responsive element, and the hourglass represents growth and development related cis-acting element.

构建了MnMAPK5驱动GUS基因表达的转基因载体，并将其转化到拟南芥中获得T0代的种子，经过Kan抗性筛选和分子鉴定获得了转基因系。为检测MnMAPK5启动子在不同胁迫下的活性，将表达ProMnMAPK5-GUS的T3代转基因拟南芥在100 mmol·L^-1 NaCl、40 ℃、4 ℃和30%PEG处理1，3，6，9，12，24 h后进行GUS染色，检测MnMAPK5启动子对各种胁迫的响应模式。如图 3所示，转基因幼苗经过高盐、高温、低温和干旱胁迫后呈现出GUS颜色，且在NaCl处理6 h、40 ℃处理9 h、4 ℃和30%PEG处理3 h后GUS颜色最深，说明MnMAPK5启动子能够响应不同的非生物胁迫。

图 3 MnMAPK5启动子在拟南芥中驱动的GUS基因在胁迫诱导下的表达 Fig.3 MnMAPK5 promoter drived expression partterns of GUS in Arabidopsis thaliana

为深入探究MnMAPK5在植物胁迫响应中的作用机制，将MnMAPK5基因转化进入拟南芥中，经卡那霉素筛选、GUS染色和分子检测获得5棵转基因株系，选取3株转基因株系(OE1、OE3和OE5) 研究过表达MnMAPK5对拟南芥抗性的影响(图 4)。在盐胁迫条件下，过表达MnMAPK5抑制了转基因拟南芥的萌发和生长，其叶片黄化程度比野生型拟南芥更严重。由此可见，过表达MnMAPK5降低了转基因拟南芥对盐胁迫的抗性。对NaCl胁迫后的生理指标测定发现，与野生型拟南芥相比，过表达MnMAPK5降低了转基因拟南芥中的H₂O₂含量、可溶性糖含量和CAT活性，提高了MDA含量和POD活性，脯氨酸含量与野生型拟南芥相比没有显著变化。此外，AtCAT和AtRD22基因在正常情况下表达无差异，经盐胁迫处理后在转基因拟南芥中的表达量显著低于野生型(图 5)。

图 4 转基因拟南芥阳性检测 Fig.4 Determination of the transgenic Arabidopsis thaliana A：基因组PCR鉴定；B：GUS染色鉴定；C：实时荧光定量-PCR鉴定。WT:野生型拟南芥; OE:超表达株系。 A: PCR analysis using genomic DNA as the template; B: Histochemical GUS staining of transgenic lines; C: Quantitative real-time PCR analysis using cDNA as the template. WT: The wild A.thaliana plants; OE: The overexpressed transgenic plants.

图 5 转基因拟南芥的抗盐性分析 Fig.5 Salt tolerance analysis of transgenic Arabidopsis thaliana C：盐胁迫下的生长状况；J：盐胁迫下胁迫相关基因的表达分析。WT：野生型拟南芥；OE：超表达株系。误差线表示标准偏差(SDs)。柱形图上的字母不同表示同一处理下不同株系有显著性差异(P < 0.05)。下同。 C: Growth under salt condition; J: The expression level of stress-related genes under salt stress. WT: The wild A.thaliana plants; OE: The overexpressed transgenic plants. Error bars on each column indicate SDs. Different letters above the bars indicate the significant difference of different lines under the same treatments at P < 0.05. The same below.

使用PEG6000模拟干旱胁迫处理后发现，野生型拟南芥表现出优于转基因拟南芥的萌发率和生长情况。在营养生长阶段，相较于野生型拟南芥，转基因拟南芥经干旱处理后出现更为严重的萎蔫和干枯死亡现象。该结果表明过表达MnMAPK5提高了转基因拟南芥对干旱的敏感性。通过测定干旱胁迫后植株的生理指标发现，过表达MnMAPK5提高了转基因拟南芥中的H₂O₂含量、MDA含量，降低了脯氨酸含量、可溶性糖含量、POD活性和CAT活性。此外，AtPOD、AtCAT和AtMYB44基因的表达量在正常情况下无显著差异，经盐胁迫处理后在转基因拟南芥中的表达量显著低于野生型(图 6)。

图 6 转基因拟南芥的抗旱性分析 Fig.6 Drought tolerance analysis of transgenic Arabidopsis thaliana C：干旱胁迫下的生长状况；J：干旱胁迫下胁迫相关基因的表达分析。 C: Growth under drought condition; J: The expression level of stress-related genes under drought stress.

由于在4 ℃条件下，拟南芥种子不能在MS培养基中萌发，选择12 ℃作为低温胁迫检测种子的萌发率。12 ℃条件下，幼苗萌发后3天并未出现显著差异。此外，营养生长阶段的拟南芥在4 ℃胁迫处理下，转基因拟南芥出现更严重的萎蔫和死亡现象，叶绿素含量显著降低，表明过表达MnMAPK5提高了转基因拟南芥对冷胁迫的敏感性。通过测定冷胁迫下的生理指标及胁迫相关基因表达发现，过表达MnMAPK5降低了转基因拟南芥中的脯氨酸含量、可溶性糖含量、POD活性和CAT活性，AtPOD、AtCAT和AtRD22等胁迫相关基因的表达量都显著低于野生型拟南芥(图 7)。

图 7 转基因拟南芥的抗冷胁迫分析 Fig.7 Cold tolerance analysis of transgenic Arabidopsis thaliana B：4 ℃下的生长状况；I：4 ℃下胁迫相关基因的表达分析。 B: Growth under 4 ℃ condition; I: The expression level of stress-related genes under 4 ℃ condition.

氧化环境胁迫下，转基因拟南芥在H₂O₂处理后其萌发率和长势不如野生型拟南芥。对H₂O₂处理下的生理指标及胁迫相关基因表达测定发现，过表达MnMAPK5提高了转基因拟南芥的MDA含量，降低了脯氨酸含量和可溶性糖含量，AtPOD、AtCAT和AtABF4的表达量显著低于野生型拟南芥(图 8)。

图 8 转基因拟南芥的抗H2O2胁迫分析 Fig.8 H2O2 tolerance analysis of transgenic Arabidopsis thaliana B：H2O2胁迫下的生长状况；G：H2O2胁迫下胁迫相关基因的表达分析。 B: Growth under drought condition; G: The expression level of stress-related genes under H2O2stress.

MAPK作为MAPK级联途径中最下游的蛋白激酶，在植物适应逆境胁迫中发挥了极其重要的作用。根据植物MAPK的蛋白结构域特点和功能差异，可分为A、B、C和D等4个亚家族。目前对植物中MAPK的相关研究主要集中于A家族MAPK(Ichimura et al., 2002)，拟南芥中该家族的MPK3和MPK6已被证明是介导植物防卫反应和非生物胁迫响应重要的调节元件(Beckers et al., 2009)。B家族MAPK在生物及非生物胁迫应答中也起着重要的作用。研究表明，过表达烟草NtMPK4可提高植株对ROS的抵抗能力(Kenji et al., 2005)，AtMPK4可响应低温、干旱、机械损伤和渗透胁迫(Tomoyuki et al., 2014)，过表达ZmSIMK1能够提高植物的抗旱性和系统获得抗病性(Wang et al., 2014)。但对B家族MAPK的功能还有待深入研究。本研究基于前期对川桑MAPK基因家族的分析，对MnMAPK5基因的功能进行进一步研究。通过对MnMAPK5的启动子序列预测发现其含有多种参与胁迫响应的顺式作用元件，MnMAPK5启动子驱动的GUS基因在拟南芥中的表达能够响应多种非生物胁迫处理，暗示MnMAPK5可能在非生物胁迫响应中发挥着一定的作用。

为研究MnMAPK5在植物抗逆境胁迫中的作用，将该基因转入拟南芥中进行了过表达分析。在盐胁迫、干旱、低温和H₂O₂处理条件下，转基因拟南芥的萌发和生长相比野生型受到了更严重的抑制，表明过表达MnMAPK5提高了转基因植株对非生物胁迫的敏感性，暗示该基因在植物抗逆中可能是一个负调控因子。通过对拟南芥的生理指标分析发现，在正常生长条件下，野生型和转基因拟南芥的MDA含量、脯氨酸含量和POD活性等指标没有显著差异，但在干旱胁迫下，过表达MnMAPK5提高了转基因拟南芥中的MDA含量和H₂O₂含量，而降低了CAT和POD活性，表明过表达MnMAPK5可能导致了CAT和POD酶活性的降低，无法清除大量的H₂O₂，进而诱发细胞的膜脂过氧化物作用导致细胞膜的结构被破坏。在低温下，过表达MnMAPK5降低了CAT活性、POD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量，表明植物在遭受冷胁迫时，使得膜系统既可从液晶态变成凝胶态进而发生相变，降低生物膜上的酶的活性(马媛媛等，2012)，导致植物不能进行正常的抗性反应，而MnMAPK5促进了这一过程的发生。在盐胁迫下，过表达MnMAPK5提高了转基因植株中的MDA含量和POD活性，降低了CAT活性和可溶性糖含量，但H₂O₂含量也被降低，推测MnMAPK5可能通过影响其他途径降低植株的抗盐性。在氧化环境胁迫下，过表达MnMAPK5提高了转基因拟南芥的MDA含量，降低了脯氨酸含量和可溶性糖含量，这表明在氧化胁迫下过表达MnMAPK5抑制了脯氨酸和可溶性糖合成，从而降低转基因植株的抗氧化胁迫能力。此外，在各个胁迫环境条件下，胁迫相关基因在转基因植株中的表达量都要低于野生型拟南芥，这表明MnMAPK5可能通过负调控胁迫应答相关基因的表达降低植物的抗逆性。此前的诸多报道显示MAPK在植物抵抗逆境胁迫中扮演着正调控的角色(Suri et al., 2008；Liu et al., 2012；Tsugama et al., 2012；Yu et al., 2010；Zhou et al., 2012)，而MnMAPK5具有负调控作用，丰富了对MAPK在抗逆境胁迫中的功能的认识，也为今后通过基因工程改良植物的抗逆性提供了新的视野。

桑树MnMAPK5基因的编码蛋白定位于细胞质和细胞核中；MnMAPK5启动子活性受到了高温、低温、高盐和干旱胁迫的诱导；过表达MnMAPK5降低了转基因拟南芥对高盐、干旱、低温和H₂O₂的抵抗能力。