木麻黄科(Casuarinaceae)植物包含了4个属96个种(Wilson et al., 1989)，为常绿乔木或灌木，该科植物常被统称为木麻黄，天然分布于东南亚地区、太平洋西南群岛和澳大利亚地区。我国自20世纪50年代从国外引进木麻黄，目前已拥有人工林30万hm²(仲崇禄等，2005)。短枝木麻黄(Casuarina equisetifolia)、细枝木麻黄(C. cunninghamiana)、粗枝木麻黄(C. glauca)和山地木麻黄(C. junghuhniana)是我国人工栽培面积最广泛的4个种(Zhong et al., 2010)。木麻黄植物对我国沿海陆地生态系统的恢复、沿海自然灾害的防御、贫瘠沿海沙地和严重退化的南方山区丘陵地区的土壤改良等均有重要作用，特别在沿海前沿沙质地带仍是无可替代的树种(陈彦等，2005；张云生等，2002；仲崇禄等，2005)。浙江省自20世纪60年代开始向台州、宁波、舟山沿海地区引种，短枝木麻黄已经成为浙江省海岸线的重要防护林树种(何贵平等，2011；张昕等，2011)。然而，木麻黄生长适温在22.1~26.9 ℃，耐寒性较差(Duke, 1983)。引种的木麻黄常遭受较严重冻害，给沿海防护林建设造成较大损失。低温冻害已成为了扩大木麻黄种植范围和推进沿海防护林建设的主要制约因素。因此，研究木麻黄的耐寒机制和性能，提高木麻黄的耐寒适应性，推进木麻黄耐寒品种的选育，是当前沿海防护林工程建设中迫切需要解决的瓶颈问题。

迄今为止，国内外对木麻黄树种耐寒性的研究基本上还停留在抗性生理指标的测定分析以及对耐寒无性系或实生苗田间选育的阶段，从分子水平上对木麻黄耐寒机制的研究非常匮乏(仲崇禄等，1998；柯玉铸等，2000；叶功富等，2004；2008；王泳等，2005；薛扬等，2008；2012；何贵平等，2011；张勇等，2011；武冲等，2012；邬金等，2013)。第2代高通量测序技术研究转录组具有快速得到基因表达谱变化、精确分析转录本的SSR、SNP位点和可变剪接变异，以及发现低丰度转录本和新转录本的独特优势，被广泛应用于植物冷适应和低温响应机制的研究(Marioni et al., 2008；Li et al., 2012；Torales et al., 2013；Tian et al., 2013；Wang et al., 2014)。鉴于这一优势，为了从低温应答基因的表达水平上全面解析木麻黄的耐寒机制，在前期研究中对从浙江省舟山选育出的短枝木麻黄耐寒无性系(ZS7) 在低温胁迫过程中的转录组测序，鉴定出了一批与信号转导、碳水化合物合成、次生代谢以及抗氧化酶等代谢途径相关的差异表达基因，其中包括64个与耐寒相关的转录因子家族基因、20个与耐寒相关的ROS家族基因成员和24个在低温胁迫下的ROS应答基因(Li et al., 2017)。为了进一步了解这些差异表达基因在低温胁迫过程中的精细表达规律，在本研究中，选用短枝木麻黄耐寒无性系ZS7和不耐寒无性系HN1为种质材料，通过电导率和致死温度来反映不同耐寒种质在生理水平上的差异，并进一步从分子水平上，利用实时荧光定量PCR(quantitative Real-Time PCR，qPCR)研究不同耐寒种质在低温胁迫过程中的基因表达规律及表达差异，以期为深入解析木麻黄的耐寒机制提供参考，为推进木麻黄耐寒品种分子选育提供有价值的候选基因。

以来自舟山的短枝木麻黄耐寒无性系ZS7和海南的不耐寒无性系HN1为供试材料。用于生理测试的供试材料种植于浙江省林业科学研究院苗圃，各取5株1年生无性系正常生长的枝条(包括叶和小枝)用于低温梯度胁迫试验(王泳等，2005；何贵平等，2011)。低温胁迫试验模拟自然界降温过程，先将供试材料在低温人工气候箱(PRXD-300，上海乔跃)中从常温(RT)预冷至10 ℃左右，之后逐步降温至-2，-5，-8，-11 ℃，在降至每个低温节点持续2 h后，各取出12个枝条测定电导率和致死温度。12个枝条等分为3份作为3个重复。

用于分子试验的供试材料采用盆栽方式，在浙江省林业科学研究院温室进行扦插繁殖。塑料盆尺寸为13 cm(高)×20 cm(直径)。盆栽基质为泥炭和蛭石混合物(4:1)，装盆前进行灭菌处理。培养条件为：光照16 h，温度25 ℃，光强180 μmoL·m^-2s^-1，相对湿度60%~70%。在温室中培养2个月后，扦插苗高度达到15~20 cm时，选取生长良好、长势较一致的植株，开始低温处理。Ⅰ)低温梯度处理设计：参照上述用于电导率测定的低温梯度胁迫试验。将ZS7和HN1无性系置于低温人工气候箱中，从常温(RT)预冷至10 ℃左右，之后逐步降温至-2，-5，-8 ℃，在降至每个低温节点持续2 h后，各取出5株，取幼嫩枝条用锡箔纸包裹后迅速放入液氮中，置于-80 ℃超低温冰箱中保存、备用。以在常温25 ℃下同步培养的ZS7和HN1无性系作为2种低温处理的对照，取样方法同上。将每次取样的5株幼嫩枝条剪碎后混合，等分为3份作为3个重复，用于RNA的提取、qPCR试验。Ⅱ)连续低温处理设计：将ZS7和HN1无性系各40株移入低温人工气候箱内，在-5 ℃下连续处理1，2，5，8，16，24，48，72 h，并于每个时间点分别取ZS7和HN1的5株幼嫩枝条，用锡箔纸包裹后迅速放入液氮中，置于-80 ℃超低温冰箱中保存、备用。

细胞膜透性测定采用电导法(刘会超等，2008；李迎春等，2012)。应用Logistic方程y=k/(1+ae^－bx)对处理温度和对应的相对电导率进行拟合，并得出低温半致死温度LT₅₀(朱根海等，1986)。式中：y为低温处理下的相对电导率；x为处理温度；k、a和b均为方程的参数，k为y的最大极限值，b反映了x和y之间的对应关系，a表示曲线对原点的相对位置。推导Logistic方程的二阶导数并令其为零，计算方程的拐点温度LT₅₀。

采用离心柱型RNA Prep Pure Plant Kit试剂盒(TIANGE，北京天根)提取短枝木麻黄幼嫩枝条的总RNA，提取方法参照试剂盒的操作说明。总RNA样品经NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo Scientific，美国热电)测定浓度及纯度。将质量检测合格的总RNA样品用于qPCR反应合成cDNA。cDNA合成采用进行qPCR反应的专用逆转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(TAKARA，大连宝生)，逆转录方法参照试剂盒的操作说明。

用于qPCR分析的6个差异表达基因及特异引物见表 1。选择组成型表达的UBCE(ubiquitin-conjugating enzyme)作为内参基因。特异引物的设计利用Oligo 6.54软件(MBI，USA)。引物合成由北京擎科新业生物技术(TSINGKE)有限公司完成。

表 1 用于本研究的短枝木麻黄候选基因及qPCR引物^① Tab.1 Candidate genes in Casuarina equisetifolia and primers used for qPCR in this study

表 1 用于本研究的短枝木麻黄候选基因及qPCR引物① Tab.1 Candidate genes in Casuarina equisetifolia and primers used for qPCR in this study 候选基因编号 Candidate gene ID 基因名/拟南芥中的功能描述 Gene name/Functional description in Arabidopsis qPCR引物序列 qPCR primer sequence (5′—3′) 目标条带扩增大小 Expected amplicon size/bp qPCR扩增效率 qPCR efficiency(%) R2 Unigene045012 RAP2.7/AP2家族转录因子基因Related to AP2.7 F:TGCAAGACAAGTTCGCCAT R:TCATCCAGAGGACGAAAAGCA 140 100.28 0.996 Unigene033270 AtbZIP44/碱性亮氨酸拉链转录因子基因Basic leucine-zipper 44 F:AAAGAAAACAACGCCCACCCTC R:CTCCAAGTCGATTTATGGCTCT 111 99.56 0.991 Unigene036872 AtHSFA6B/热激转录因子基因Heat shock transcription factor A6B F:CTACTTCTCCTGTTCTGCCTGT R:ATTGCTCGATGACCTTTCCCTT 115 107.35 0.994 Unigene017982 GRXC6/硫氧还蛋白基因Thioredoxin superfamily protein F:CCCGCCGACGCAGGTGCCACCA R:CCTCTTGCTGCATGTGCCACGTCA 185 98.80 0.996 Unigene016385 HSP18.2/热激蛋白基因Heat shock protein 18.2 F:GATCCCTTTGCTCTCGACGTCT R:TTCACAAAAGCCGAAGTCTCCC 107 105.51 0.990 Unigene069935 ABR1/ERF家族转录因子基因Integrase-type DNA-binding superfamily protein F:AAGTTCCATGCATTGGCTCTCG R:ACTTCATACCAAAGTACAGCGACT 100 97.27 0.993 Unigene030219 UBCE/泛素接合酶基因Ubiquitin-conjugating enzyme (Reference gene) F:CCAAGGTGCTGTTGTCCATA R:CGAGCAGTGGCTTCATACTT 118 108.05 0.998 ① R2表示标准曲线(cDNA模板浓度与CT值)的相关系数。R2 represent the correlation coefficient of standard curve (cDNA templet concentration and circulated threshold).

qPCR分析在ABI ViiA7实时荧光定量PCR仪(ABI ViiA 7 Real Time PCR System，Applied Biosystems，USA)上进行，采用ABI SYBR^® Select Master Mix试剂盒，方法参照试剂盒的操作说明。具体为，在20 μL的反应体系中，包含2×SYBR^® Select Master Mix 10 μL、Forward Primer (10 pmol·μL^-1) 1 μL、Reverse Primer (10 pmol·μL^-1) 1 μL、cDNA模板1 μL、RNase Free ddH₂O 7 μL。扩增程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸各40 s，共50个循环。每个扩增反应重复3次。扩增反应结束后利用熔解曲线检测产物特异性：将该反应体系从60 ℃缓慢升温至95 ℃，每升高1 ℃采集5次荧光信号。

采用2^-ΔΔC_T法计算qPCR试验中的基因相对表达量，计算公式为：基因相对表达量=2^-ΔΔC_T。其中，ΔΔC_T计算公式为：ΔΔC_T=ΔC_T(试验组)－ΔC_T(对照组)；试验组或对照组的ΔC_T计算公式为：ΔC_T=C_T(目的基因)－ C_T(内参基因)。为了验证qPCR反应的扩增效率，将cDNA模板浓度经5倍梯度稀释，用目的基因与内参基因的qPCR引物进行扩增得到C_T值，每个模板重复3次，得到标准曲线。根据标准曲线的相关系数(R²)和斜率(slope)，计算得到扩增效率E=10^-1-slope-1。利用Excel 2010、Origin 7.5和SPSS 18.0统计分析软件进行数据分析。

低温引起的细胞膜结构破坏是导致植物低温损伤和死亡的根本原因。相对电导率可作为鉴定植物耐寒性的指标。在低温胁迫下，2种供试材料的相对电导率变化见图 1。短枝木麻黄耐寒无性系ZS7和不耐寒无性系HN1叶片的相对电导率均随温度的降低而升高，总体呈S型曲线的变化趋势。在每个胁迫温度下，ZS7和HN1的相对电导率均存在极显著差异(P＜0.01)。在-2 ℃到-8 ℃胁迫期间，耐寒ZS7的相对电导率上升幅度较大，在-8 ℃到-11 ℃趋于缓慢。不耐寒HN1在-2 ℃到-5 ℃相对电导率迅速升高，在-5 ℃到-11 ℃趋于缓慢。该结果表明，HN1在-5 ℃下细胞膜透性已经遭到破坏，呈不可逆的状态，而耐寒ZS7相对电导率的变化从-8 ℃才开始趋缓，表明耐寒ZS7叶片的质膜稳定性比不耐寒HN1高，受低温伤害程度较轻，体现出了较强的耐寒性。

图 1 低温胁迫下2种短枝木麻黄无性系叶片的相对电导率变化 Fig.1 Changes of relative electric conductivity in leaves of two Casuarina equisetifolia clones under low temperature stress 同一曲线不同小写字母和大写字母分别表示该无性系叶片在不同温度下相对电导率之间差异显著(P＜0.05)、极显著(P＜0.01)。 Different small and capital letters in the same curve represent significant (P < 0.05) and highly significant (P < 0.01) difference between relative electric conductivity in leaves of the clone at various temperatures, respectively.

低温半致死温度(half-lethal temperature，LT₅₀)是指电解质渗出率达到50%时的温度，可用于评价一个物种的耐寒性强弱。表 2所示为2种短枝木麻黄无性系的Logistic方程及低温半致死温度。耐寒无性系ZS7和不耐寒无性系HN1的拟合度分别为0.998和0.997，都达到极显著水平(P < 0.01)，说明拟合的Logistic方程可靠性强。根据Logistic方程进一步计算得到ZS7和HN1的低温半致死温度(LT₅₀)分别为-5.92 ℃和-2.87 ℃，由此进一步证明了ZS7比HN1具有更强的耐寒能力，也为后续进一步开展耐寒相关调控基因的表达模式分析提供了参考温度。

表 2 低温胁迫下2种短枝木麻黄无性系相对电导率回归方程及半致死温度^① Tab.2 Logistic equation of the relative electric conductivity and the half-lethal temperature (LT₅₀) under low temperature stress of two Casuarina equisetifolia clones

表 2 低温胁迫下2种短枝木麻黄无性系相对电导率回归方程及半致死温度① Tab.2 Logistic equation of the relative electric conductivity and the half-lethal temperature (LT50) under low temperature stress of two Casuarina equisetifolia clones 编号No. 拟合方程Fitting equation LT50 拟合度Fitting degree(R2) ZS7 y=75.07/(1+7.09e0.33x) -5.92 0.998** HN1 y=89.67/(1+5.64e0.57x) -2.87 0.997** ①**:极显著差异Highly significant (P＜0.01).

为了进一步了解木麻黄应答低温胁迫的分子机制，选取了在前期转录组研究中鉴定出的6个耐寒相关调控基因(Li et al., 2017)，分别代表了转录因子(transcription factor)家族基因成员(包括RAP2.7，ABR1，AtHSFA6B，AtbZIP44)、ROS家族基因成员(GRXC6)和ROS应答基因(HSP18.2)，基于qPCR分析耐寒相关基因的精细表达规律(表 1)。本研究以ZS7和HN1的LT₅₀(-5.92 ℃和-2.87 ℃)为参考，设置在达到LT₅₀前的-2 ℃、-5 ℃以及降至LT₅₀后的-8 ℃共3个低温梯度来分析各个基因表达模式。

在qPCR试验中，6个耐寒相关调控基因和1个内参基因的溶解曲线均呈单一峰值扩增。根据浓度梯度稀释扩增得出的标准曲线相关系数(R²)均大于0.99，扩增效率介于97.27%~108.05%，表明所有qPCR引物的扩增具有高特异性，且扩增效率一致，满足利用2^-ΔΔCt法进行相对定量分析。

图 2所示为在常温下和连续低温梯度-2，-5，-8 ℃胁迫下，6个耐寒相关基因RAP2.7，ABR1，GRXC6，AtbZIP44，AtHSFA6B和HSP18.2在耐寒无性系ZS7和不耐寒无性系HN1中的表达情况。从总体上来看，耐寒无性系ZS7中各基因(除RAP2.7基因外)在低温梯度胁迫下的表达呈现先升高后下降的变化趋势，而不耐寒无性系HN1的表达呈下降趋势。在常温条件下，这6个基因在ZS7和HN1无性系中的相对表达量皆无明显差异。在降至-2 ℃后，5个基因(ABR1，AtHSFA6B，AtbZIP44，GRXC6，HSP18.2)在ZS7中的表达量均极显著高于常温，而RAP2.7基因的表达显著降低；6个基因在HN1的表达量均极显著低于常温；各基因的表达量在ZS7中均极显著高于在HN1中。这表明在HN1临近半致死状态下，这6个耐寒相关基因在不耐寒种质HN1中的表达被强烈抑制，而在耐寒种质ZS7中的表达被激活，说明当外界环境从常温降到-2 ℃时，短枝木麻黄为了抵御和适应低温胁迫造成的伤害，快速启动低温应答机制，激活了耐寒相关基因的增强表达。

图 2 短枝木麻黄耐寒相关基因在常温(RT)和低温梯度胁迫下的表达 Fig.2 The expression of cold resistance related genes in Casuarina equisetifolia under normal(RT) and successive low temperatures **代表基因的表达在无性系ZS7和HN1之间达极显著差异(P＜0.01)。 ** represent highly significant (P < 0.01) difference between genes in two clones.

在降至-5 ℃后，各基因在2种无性系中的表达均被抑制，且除RAP2.7和AtbZIP44基因在ZS7和HN1中的表达量无明显差异外，其余4个基因在ZS7中的表达量均极显著高于HN1。这表明当降至临近ZS7的半致死温度下，不耐寒种质HN1中的各基因被进一步抑制，同时在耐寒种质ZS7中的表达亦被强烈抑制，这也许表明当温度继续下降至临近LT₅₀的-5 ℃时，即短枝木麻黄处于组织所受伤害不可逆转的温度节点，低温胁迫导致细胞质膜的结构和功能受到破坏，细胞内电解质的外渗量增多，相对电导率迅速升高(图 1)，使其对低温胁迫的应答调控机制受到影响，导致短时间内耐寒调控基因的表达受到抑制，因而有必要对在该温度胁迫下的精细表达模式进一步研究。在降至低于半致死温度的-8 ℃后，伴随着明显冻害症状的出现，叶片严重萎蔫，各基因的表达继续受到抑制。

为了进一步明确短枝木麻黄在临近半致死温度时6个耐寒相关基因的精细表达模式，对2种无性系在-5 ℃低温胁迫下持续1，2，5，8，16，24，48，72 h的表达进行比较分析。图 3所示为在连续-5 ℃低温胁迫下，RAP2.7，ABR1，AtHSFA6B，AtbZIP44，GRXC6和HSP18.2基因在耐寒无性系ZS7和不耐寒无性系HN1中的表达模式。在常温条件下，各基因在ZS7和HN1无性系中的相对表达量皆无明显差异，但在-5 ℃低温胁迫下存在显著不同。在ZS7中，6个基因的表达在1~5 h内与常温没有明显差异，8 h后开始呈现极显著上调，表达量最高值集中在低温胁迫后的第8，24，48 h(图 3)。而在HN1中，6个基因的表达在1~16 h内皆呈现极显著下调，表达量最低值集中在1~5 h内(图 3)。就6个基因在ZS7与HN1无性系间的表达量差异而言，ABR1，GRXC6，AtHSFA6B和HSP18.2这4个基因在2 h内出现，而RAP2.7和AtbZIP44这2个基因在8 h出现。此外，6个基因的表达量最高值依次ABR1(168)> AtbZIP44(57)> GRXC6(56)> HSP18.2(54)> AtHSFA6B(33)> RAP2.7(7)，可见，ABR1基因的表达量最高，是AtbZIP44，GRXC6，HSP18.2，AtHSFA6B基因的3~5倍，RAP2.7基因的24倍(图 3)。这一表达模式表明对于耐寒种质，一定时间的半致死温度胁迫激活了耐寒相关调控基因的增强表达以应对逆境；但对于不耐寒种质，低温胁迫短时间内即抑制了耐寒相关调控基因的表达，导致其耐寒性显著降低。

图 3 短枝木麻黄耐寒相关基因在常温(RT)和连续低温(-5 ℃)胁迫下的表达模式 Fig.3 The expression of cold resistance related genes in Casuarina equisetifolia under normal(RT) and low temperature (-5 ℃) conditions for 1~72 h

低温半致死温度(LT₅₀)能较准确地反映植物所能耐受的最低温度，在植物抗寒研究领域得到了广泛应用(许瑛等，2008；孙海伟等，2012；任俊杰等，2014；Su et al., 2015)。当温度继续下降至低于LT₅₀时，组织中液态水将迅速结冰，导致冻害发生(Rajashekar et al., 1979)，植物组织所受的伤害也将不能恢复(任俊杰等，2014)。因此LT₅₀可以认为是植物组织所受伤害不可逆转时的转折温度，研究在LT₅₀温度前后耐寒相关基因的表达对于探究木麻黄应对低温胁迫的分子机制具有重要意义。本研究基于LT₅₀反映了2种不同短枝木麻黄种质在耐受低温程度上的差异，并进一步从分子水平上研究了在LT₅₀温度胁迫前后，2种耐寒性不同的种质在6个耐寒相关基因表达上差异。在2种低温胁迫方式下，耐寒和不耐寒种质对低温的应答机制明显不同，在LT₅₀前后，6个耐寒相关基因在不耐寒短枝木麻黄种质中的表达一直被强烈抑制，而在耐寒种质中，5个基因(除RAP2.7外)的表达都呈现先升高后下降的变化趋势。此外，当临近LT₅₀的-5 ℃时，尽管短时间的低温胁迫暂时抑制了耐寒种质中5个基因(除RAP2.7外)的表达，但在胁迫达到8 h后再次增强表达，并一直持续至48 h。这表明未经过耐寒锻炼的短枝木麻黄种质，缺乏抵御低温胁迫的内在调控机制，而耐寒短枝木麻黄种质经过长期的低温适应，形成了一系列由调控基因介导的耐寒调节机制，尤其在组织受到不可逆转伤害的温度节点，该机制被充分调动，以提高自身的抗逆性。

为了适应各种生物与非生物逆境胁迫，植物启动了多种防御性机制。由转录因子介导的信号传导是最为快速有效的防御应答反应之一，构成了植物复杂调控网络的重要组成部分(Lee et al., 2005；Ashraf, 2010)。在本研究中，-5 ℃持续低温胁迫显著诱导了耐寒短枝木麻黄ZS7中ABR1、AtbZIP44和AtHSFA6B这3个转录因子基因的增强表达，其中AtHSFA6B基因的表达量在8 h达到最高，ABR1和AtbZIP44基因则在24 h之后。这表明不同转录因子响应低温的速度与强度不同，且发挥最大调节作用的时间也不一致。此外，这3个基因的表达量均呈现先升高后下降的变化规律，这可能是由于它们被诱导表达后激活了下游一系列抗逆相关基因的表达，调节植物体内各种生理生化反应，从而提高木麻黄对低温胁迫的抗性。而后期表达量下降的原因，可能与已经对胁迫环境适应有关，也可能体现了转录因子基因的诱导受胁迫时间的限制，超过一定的时间，表达逐渐受到抑制，对低温的耐受能力也逐渐降低(杨帆等，2010)。这种随逆境胁迫时间的持续，转录因子基因先升高后下降的表达模式也在对构树(Broussonetia papyrifera)耐盐(杨帆等，2010)、水稻(Oryza sativa)耐低温(Liu et al., 2012)和胡杨(Populus euphratica)耐盐(Shen et al., 2013)等的研究上得到了相似结果。

AP2/ERF家族的转录因子处于调控网络的节点(Xu et al., 2011；Zhuang et al., 2011)，主要通过激活冷诱导基因(cold regulated，COR)、应答脱水基因(responsive to dehydration，RD)等一系列下游冷调节基因的表达来增强对低温逆境的适应。不同于AP2/ERF家族中的大多数成员，AP2型基因RAP2.7隶属该家族中DREB亚家族转录因子A-5亚组基因，为EAR(ERF-associated amphiphilic repression)型转录抑制子(Dong et al., 2010)，其过量表达会导致植物耐受性降低，而缺失突变体植株则会对逆境的耐受性增强(Tsutsui et al., 2009；Yaish et al., 2009)。在本研究中，-2 ℃的低温对耐寒相关基因RAP2.7具有负调控作用，在-5 ℃持续低温胁迫下，其表达量也远远低于其他5个基因。RAP2.7基因在耐寒短枝木麻黄中的这一低温应答模式表明，在低温逆境的应答上，一些AP2型基因成员的转录调控机制不同于ABR1、AtHSFA6B和AtbZIP44，耐寒短枝木麻黄是通过这些AP2型转录因子在低温胁迫下的负调控作用来增强其对低温的耐受性。AP2/ERF类转录因子基因家族成员在不同植物中存在的数量及类型不同(Velasco et al., 2010)。在前期对耐寒型短枝木麻黄的转录组研究中，初步鉴定出了18个在低温胁迫下差异表达的AP2/ERF类转录因子成员，其中11个上调、7个下调(Li et al., 2017)。因此为了全面了解AP2型转录因子在低温逆境下的转录调控机制，有必要对这些AP2型成员的精细表达模式进一步研究。

低温诱导了植物体内活性氧(reactive oxygen species, ROS)的大量产生，进而从根本上导致氧化胁迫，对植物组织内的蛋白、脂类、碳水化合物和核酸造成巨大伤害。在氧化胁迫下，植物细胞的抗氧化防御系统随之被激活，通过清除ROS以抵御氧化胁迫导致的伤害(Gill et al., 2010)。硫氧还蛋白GRXC6属于抗氧化酶类ROS家族的成员，热激蛋白基因HSP18.2是ROS应答基因(Li et al., 2017)。本研究显示在-5 ℃的低温诱导下，GRXC6在48 h达到最高表达量，HSP18.2在8~48 h一直维持较高的表达量，这表明在低温胁迫下，耐寒短枝木麻黄种质通过诱导ROS家族基因和ROS应答基因的上调表达来调整增强ROS清除能力，进而减轻氧化胁迫导致的伤害，提高其抗氧化能力以适应逆境。植物参与不同逆境胁迫响应的基因之间存在复杂的互作关系(Huang et al., 2012)。热激转录因子HSF是植物热激响应的主要控调因子，在逆境胁迫下与热激元件(heat shock element，HSE)识别并特异结合，从而激活下游基因HSP的转录和表达(Pelham, 1982)，对植物抵抗逆境伤害和其他生命活动具有关键作用(Baniwal et al., 2004)。在本研究中，HSP18.2和AtHSFA6B具有同步一致的表达模式，均在8~48 h持续高表达，这可能预示了在低温胁迫早期，AtHSFA6B基因的高表达迅速启动了对下游HSP18.2的调控机制，以增强短枝木麻黄低温逆境的耐受能力。

在耐寒相关调控基因的表达水平上，耐寒和不耐寒短枝木麻黄种质对低温的应答机制明显不同。低温激活了耐寒种质中转录因子、ROS家族基因、ROS应答因子等调控基因的增强表达以抵御和适应逆境胁迫，但抑制了在不耐寒种质中的表达，显著降低了不耐寒种质对低温逆境的耐受能力。这在一定程度上对于丰富木麻黄适应低温的分子机制，以及耐寒无性系的分子选育都具有一定的参考价值。显然，要全面深入解析木麻黄耐寒的分子机制，还需要增加更多耐寒相关候选基因的表达模式研究，并进一步开展功能分析研究。为此，克隆基因全长、构建木麻黄功能基因超表达载体、建立遗传转化体系等，将是在本研究基础上继续跟进的工作。