文章信息
- 陈盼飞, 左力辉, 王桂英, 王进茂, 任亚超, 杨敏生
- Chen Panfei, Zuo Lihui, Wang Guiying, Wang Jinmao, Ren Yachao, Yang Minsheng
- 盐胁迫下转复合多基因欧美杨107杨幼苗生长及生理响应
- Growth and Physiological Responses of Transgenic Populus×euramericana cv. '4/76' with Multiple Genes Under Salt Stress
- 林业科学, 2017, 53(7): 45-53.
- Scientia Silvae Sinicae, 2017, 53(7): 45-53.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20170705
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文章历史
- 收稿日期:2016-04-22
- 修回日期:2017-02-21
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作者相关文章
2. 廊坊市农林科学院 廊坊 065000
2. Langfang Academy of Agricultural and Forestry Sciences Langfang 065000
杨树(Populus)是世界中纬度地区广泛栽培的主要树种之一。杨树在我国北方地区生态建设和林业生产中占有不可替代的地位,我国杨树种植面积远远超过世界所有其他国家杨树人工林面积之和(卢孟柱等,2006)。然而随着杨树栽培面积的不断扩大,虫害现象日趋严重,给生态环境和林业生产带来前所未有的毁灭性灾难;另一方面,随着土壤盐渍化问题的日益加剧,可利用土地资源逐年减少,严重影响农林业生产和可持续发展。
目前,基因工程技术在杨树抗虫、耐盐和耐旱等抗性遗传改良方面取得了很多研究成果,在不同程度上提高了杨树的抗虫、耐盐以及耐旱能力(Klocko et al., 2014;Du et al., 2012;Han et al., 2013)。综合来看,依靠单基因转化对杨树进行遗传改良获得的效果有限,多基因导入或聚合育种可以作为培育杨树新品种的一条可选途径。前人在基因的修饰和改造、多基因表达载体的构建、转基因植物的筛选和培育等方面进行了大量研究。王建革等(2006)通过基因枪法将双价抗蛀干害虫基因(BtCry3A+OC-I)、透明颤菌血红蛋白基因(vgb)、枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因(SacB)、报告基因nptⅡ以及调节基因JERF36等外源基因导入到库安托杨(Populus×euramericana ‘Guariento’)基因组,共获得25株抗性植株,经过southern杂交和PCR检测,外源基因成功整合到库安托杨基因组中,其中7株含有上述全部5个外源基因。ELISA试验表明,BtCry3A基因在7株库安托杨中已得到表达,并且转基因植株在滨海盐碱地中生长良好。朱永兴等(2015)以‘宁杨1号’(P.tomentosa cv.Niyang-1) 为转化受体材料,建立杨树多基因遗传转化体系,并对三价质粒MT(SOS1-SOS2-SOS3) 进行了共转化并建立了最佳的‘宁杨1号’多基因遗传转化体系,获得14株PCR阳性株系。
本研究利用转复合多基因(BtCry1Ac+BtCry3A+BADH)欧美杨107杨(Populus × euramericana cv. ‘74/76’)为试验材料,以未转基因欧美杨107杨为对照,在人工气候室控制环境下,通过浇施不同浓度的NaCl水溶液进行盐胁迫处理,观测2个杨树株系幼苗的株高、节间距等生长指标,电导率、光合相关参数等生理变化,以及转基因株系外源Bt基因、BADH基因表达产物积累量的变化。通过综合分析比较,探究转多基因107杨在盐胁迫下的生长和生理响应,为多元复合基因转化及转基因新品种培育提供借鉴和理论基础。
1 材料与方法 1.1 供试材料供试材料为欧美杨107杨与转复合多基因(BtCry1Ac+BtCry3A+BADH)欧美杨107杨(转基因107杨)高抗株系1号,由河北农业大学遗传育种实验室提供。转基因107杨是将3个目的基因构建在同一转化载体上,采用农杆菌介导法,将外源基因整合到欧美杨107杨基因组中,获得转基因组培苗,经分子检测、Bt毒蛋白检测及初步抗性试验,证明外源基因已整合到107杨基因组中,并进行了转录和表达,初步证明转基因株系具有抗虫性和耐盐能力(王奥璇,2015)。
1.2 试验设计对2个107杨株系进行组培扩繁,组培苗生根后,移入内径5 cm、高8 cm的盆中,每个株系栽植50株。栽培用土壤为园土:基质土=1:3。盆栽苗置于人工气候室中培养,条件为日温26~28 ℃,夜温18 ℃;光周期:14 h·d-1 (光强10 000 Lx)。培养40天后,幼苗株高约10 cm时,选取生长一致的幼苗,定植在内径18 cm、高20 cm的盆中,每盆2株,分别为对照107杨与转基因107杨,共27盆。
定植2天后,分别用NaCl浓度为0、3、6 g·L-1的盐溶液进行胁迫处理。每个处理设置9盆幼苗,3次重复。每隔4天浇1次盐溶液,每次150 mL。盐胁迫25天后,每株选取顶端第1片完全展开的成熟叶片,进行光合色素含量、光合作用指标和叶绿素荧光参数的测定。
1.3 测定项目与方法 1.3.1 生长指标的测定在盐处理前和第25天时,分别用不锈钢刻度尺、千分尺测量盐胁迫前后的株高、地径。每个处理9次重复。
1.3.2 质膜透性的测定在盐处理第25天时,分别取2个杨树株系幼苗相同部位叶片,用去离子水冲洗2遍,用滤纸吸干叶面浮水后用打孔器打孔取样,在电子天平称量后放入50 mL三角瓶中,按200 mL·g-1加入去离子水,抽真空20 min,静置2 h,用DDS-11A型电导仪测定电导值,然后将样品在97 ℃中水浴30 min,静置2 h,测定电导值,以相对电导率表示细胞原生质膜透性的大小。每个处理4次重复。
1.3.3 光合色素的测定叶绿素a、叶绿素b含量的测定按照李合生(2000)方法,用上海精工722 s分光光度计进行测定,含量以mg·g-1FW表示。每个处理6次重复。
1.3.4 光合作用指标的测定上午9:00—10:00在人工气候室条件下采用Li-6400XT便携式光合仪(美国拉格公司生产)进行光合速率有关指标的测定,其中包括:净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)以及气孔限制值(Ls)。每个处理6次重复。
1.3.5 叶绿素荧光参数的测定测定前用暗处理夹片对杨树幼苗的叶片进行20 min的暗处理。然后采用Porket PEA高速连续击发式荧光仪(英国Bioscientific有限公司生产)测定幼苗光化学活性、光能吸收和转化效率。叶绿素荧光参数的测定和光合作用指标的测定同时进行。每个处理4次重复。
1.3.6 转基因株系叶片外源Bt毒蛋白含量的测定采用美国Agdia公司Bt-Cry1Ab/1Ac及Bt-Cry3A ELISA试剂盒进行Bt毒蛋白含量的测定。称取0.1 g左右(记录实际质量)新鲜叶片,在液氮中研磨至粉末状,加入1 mL 1× PBST提取缓冲液,研磨呈匀浆状,10 000 r·min-1离心10 min取上清液用于Bt毒蛋白含量的检测。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。每个处理6次重复。
1.3.7 叶片甜菜碱含量的测定采用北京冬歌生物科技有限公司植物甜菜碱(Betaine)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒进行甜菜碱的测定。称取0.1 g左右(记录实际质量)新鲜叶片,液氮中研磨至粉末,加入0.9 mL PBS(浓度为0.01 mol·L-1,pH为7.4) 提取缓冲液,匀浆充分,2 000~3 000 r·min-1离心20 min取上清液用于甜菜碱含量的检测,具体操作步骤参照试剂盒说明书。每个处理3次重复。
1.4 数据分析采用DPS v 7.05数据处理系统对各项参数进行方差分析和多重比较。
2 结果与分析 2.1 盐胁迫下生长指标变化由表 1可知,转基因107杨在3 g·L-1低浓度盐处理下株高增长量小幅升高,但未达到显著水平,且显著高于相同浓度盐处理下的对照107杨。在6 g·L-1高浓度盐处理下,转基因107杨株高增长量显著降低,且与相同浓度盐处理下的对照无显著差异。对照107杨株系在不同NaCl浓度处理下,株高增长量均受到明显抑制。在不同浓度盐处理下,2个株系幼苗地径均呈现逐渐降低的趋势,在3 g·L-1低盐浓度处理下,转基因107杨地径增长量比对照107杨高,但2个株系间差异不显著。在6 g·L-1高盐浓度处理下,2个株系地径增长量均显著降低且株系之间无显著差异。可见在低浓度盐胁迫下转基因107杨具有良好的适应能力,而在高浓度盐胁迫下,2个株系幼苗均受到较大的盐害影响。
大量研究报道,在盐分胁迫下植物细胞质膜首先受到伤害,导致质膜透性增大,细胞内无机离子大量外渗,外界盐离子大量进入,破坏细胞内离子平衡,致使细胞代谢失调,影响植物正常的生长发育。而植物则可以通过吸收并积累从外界环境进入的K+、Cl-等无机离子,或自身合成小分子有机类调节剂,如氨基酸类、糖类、多元醇和生物碱等调节渗透势,抵御盐胁迫对质膜的伤害,从而提高胁迫环境下的适应能力。图 1结果显示,在3 g·L-1盐浓度处理下,107杨相对电导率显著增加41.23%,转基因株系呈现小幅度降低,降低5.11%,显著低于相同浓度处理107杨。在6 g·L-1盐浓度处理下,2个株系相对电导率均显著增大,且转基因株系增幅高于107杨。在低盐浓度处理下,转基因株系相对电导率略微降低表明细胞可能通过外源BADH基因的表达,促使细胞内甜菜碱含量增加,避免了盐胁迫对细胞质膜的伤害。而107杨电导率显著增加,其质膜受到伤害。高盐浓度下,转基因株系质膜透性变化较大,2个株系质膜透性均受到显著伤害。
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素。盐胁迫会对植物细胞产生一定的破坏性,破坏叶绿体结构,造成叶绿素含量降低从而影响植物的光合能力。研究植物盐胁迫下的响应机制,叶片光合色素的含量可作为植物耐盐生理研究的重要指标。盐胁迫下2个株系叶片叶绿素含量测定结果见表 2。在3 g·L-1盐浓度处理下,2个株系叶绿素a、b和叶绿素总量均表现为不同程度增加,相同盐浓度处理下转基因株系增幅更大。在6 g·L-1盐浓度处理下,叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量均呈现较大幅度降低,转基因株系降幅较对照小。表明在盐胁迫处理下转基因株系耐受性较强。高浓度盐处理对2个杨树株系幼苗均产生了较大伤害。
不同浓度盐处理下2个株系光合参数的测定结果见图 2。随着NaCl浓度增加,107杨叶片净光合速率Pn呈降低趋势(图 2A),3 g·L-1浓度盐处理下光合速率下降22.6%,但未达到显著水平,6 g·L-1浓度盐处理下该数值显著降低;转基因株系叶片净光合速率呈先升高后降低,在3 g·L-1盐浓度处理下净光合速率升高18%,显著高于相同盐浓度处理107杨。在6 g·L-1盐浓度处理下降低显著,与相同盐浓度处理107杨无显著差异。说明低盐浓度下转基因植株可以通过提高光合速率来适应盐胁迫条件。
不同浓度盐处理下2个株系气孔限制值(Ls)与胞间CO2浓度(Ci)变化见图 2B、2C。低盐浓度下,107杨叶片Ci降低,但未达到显著水平,而气孔限制值Ls大幅度增加,净光合速率下降,表现为气孔限制。转基因株系气孔限制值小幅度降低,胞间CO2浓度降低,但未达到显著水平,净光合速率增加,表明低盐浓度下转基因株系可以通过降低气孔限制以适当提高光合速率,表现出较好的适应性。在高盐浓度下,2个株系幼苗气孔限制值显著增加,Pn下降且Ci升高,这可能是由于高浓度盐胁迫导致大量盐离子在细胞中累积,破坏了叶绿体结构,造成叶绿素含量降低、叶片光合器官损伤,从而导致叶肉细胞光合活性下降,说明此时非气孔限制已成为促使光合速率降低的主要因子。
盐胁迫处理下2个株系幼苗蒸腾速率Tr(图 2D)变化趋势与Pn相同。随盐浓度增加,对照107杨Tr逐渐降低,转基因株系呈先升高后降低。在低盐浓度下转基因株系Tr显著高于107杨,高盐浓度处理下差异不显著。植物在盐胁迫下叶片气孔限制值增大,导致水分蒸发和CO2传输受阻,从而抑制叶片的蒸腾作用和光合作用,而转基因株系在低盐浓度下气孔限制值小幅度降低,气孔导度增加,Ci升高,其Pn与Tr表现出一定程度的增大且显著高于107杨。说明在低盐浓度下转基因株系可以通过降低气孔限制以增强光合速率和蒸腾速率,提高转基因株系的耐盐性。
2.5 盐胁迫处理对叶绿素荧光诱导动力学的影响最大光量子产量Fv/Fm反映PSⅡ初始最大光能利用效率。Fv/Fm下降越多,代表PSⅡ受到的损伤程度越大。由图 3A可知,2个株系幼苗Fv/Fm均呈现先升高后降低的趋势。在3 g·L-1盐浓度胁迫下,转基因107杨Fv/Fm增幅较大,说明转基因杨树具有较大光合作用潜力。6 g·L-1盐浓度处理下2个株系Fv/Fm均下降明显,说明该盐浓度下2个株系均受到较大影响。
初始荧光Fo(图 3B)和最大荧光Fm(图 3C)分别表示PSII反应中心处于完全开放和关闭时的荧光产量。2个株系均表现出在低盐浓度下Fo小幅度降低、高盐浓度下升高的趋势,对照107杨升幅较大。对照107杨最大荧光Fm随盐浓度增加逐渐降低,转基因株系在低盐浓度下无变化,在高盐浓度下急剧下降。
Y(Ⅱ)反映光系统Ⅱ实际光合效率。PSⅡ反应中心在部分关闭状态下,实际光能转换效率可作为光合电子传递速率快慢的评测指标。从图 3D可知,无盐胁迫和低盐浓度下转基因株系均保持较高的电子传递速率。低盐浓度下107杨和转基因株系Y(Ⅱ)分别降低7.41%、4.62%,转基因株系显著高于107杨,高盐浓度下两者均降低且无显著差异。证明在低盐浓度下转基因杨树光系统Ⅱ能够保持较高的电子传递速率,且受盐害影响较小。高盐浓度下2个株系电子传递速率均降到较低水平,受伤害程度较大。
2.6 盐胁迫下转基因株系外源Bt毒蛋白含量的变化外源Bt基因的导入可以使目标植物表达抗性蛋白从而获得对靶标害虫的抗性,但环境因素会对外源基因表达产生影响。盐胁迫下转基因株系外源Bt毒蛋白含量如表 3所示。随着NaCl浓度增大,Bt毒蛋白含量呈现增加趋势。在3 g·L-1盐浓度处理下,Cry1Ac、Cry3A毒蛋白含量分别增加40.15%、50.49%;在6 g·L-1处理浓度下,Cry1Ac、Cry3A毒蛋白含量分别增加158.84%、144.04%。结果表明,盐胁迫对外源Bt基因的表达起到促进作用,随盐浓度增加,毒蛋白含量增幅变大。
甜菜碱是一种天然无毒的小分子有机化合物。在植物受到环境胁迫时作为渗透调节物质在植物叶片中大量积累以降低渗透势,维持细胞水分平衡,保护一些关键酶类,维持生物大分子的结构和完整性,维持植物正常的生理功能。不同浓度盐处理下转基因107杨幼苗叶片甜菜碱含量如图 4所示,随盐浓度增加,叶片甜菜碱含量逐渐增大,转基因株系叶片甜菜碱含量显著高于107杨。在无盐处理条件下,转基因株系叶片甜菜碱含量为107杨的2.97倍,6 g·L-1盐浓度处理下上升到6.22倍,表明BADH基因的导入导致转基因株系叶片甜菜碱含量大幅增加。随盐浓度增加,2个株系叶片的甜菜碱含量在3 g·L-1盐浓度处理下增幅较大。在6 g·L-1盐浓度处理下含量最高,2个株系甜菜碱含量分别为无盐处理条件下的1.3倍与2.8倍。结果证明,低盐浓度胁迫下,甜菜碱的积累量迅速上升,随着盐浓度增加,甜菜碱积累量增幅减缓,盐胁迫在一定程度上可以诱导外源BADH基因表达加强。
本研究中,转复合多基因(BtCry1Ac+BtCry3A+BADH)107杨中的耐盐基因为BADH基因。BADH基因是合成甜菜碱醛脱氢酶的基因,而甜菜碱醛脱氢酶则是合成甜菜碱的关键酶。大量研究表明,甜菜碱的积累可以提高植物对环境胁迫的耐受性。李敏等(2013)研究指出耐盐柳树(Salix)L0911 BADH基因的表达受盐胁迫条件的诱导,说明盐胁迫与BADH基因存在着紧密关联。王亮(2006)在利用BADH基因转化107杨的研究中,BADH基因的导入使得相同盐胁迫条件下转基因植株的相对电导率降低,转基因植株受到伤害较小。此外,在盐胁迫条件下部分转基因株系叶绿素含量显著高于对照株系,表明转基因株系能够更好地抵御盐害影响。本研究中,在低盐胁迫下转基因株系相对电导率小幅度降低且显著低于对照,而叶绿素含量均高于对照,表明导入BADH基因的株系受盐害影响程度较小,这与前人研究结果相同。张士功等(1999)研究表明盐胁迫下一定浓度的甜菜碱可以增加叶绿素含量,提高叶绿体对光能的吸收利用,从而降低盐胁迫对光合作用的影响。另外,甜菜碱的积累还可以保护多种抗氧化酶的活性,降低活性氧的积累,维持膜的有序性和完整性,保护类囊体膜上蛋白复合体的功能,减轻胁迫对类囊体膜的破坏,维持较高水平的PSII活性及CO2同化速率,提高光合活性(梁超等,2007),最终提高转基因植物的耐盐性。本研究中,转复合多基因107杨株系在无盐胁迫条件下,甜菜碱积累量较低,此时BADH表达量较低,转基因株系与对照生长及生理指标无显著差异,而盐胁迫处理可以诱导外源BADH基因加强表达,使转基因株系叶片中甜菜碱获得大量积累。在3 g·L-1低盐浓度下甜菜碱含量迅速积累,并通过渗透调节维持细胞膜良好的稳定性,可以增加叶绿素含量,且能够维持较高的PSII活性,增大气孔导度、蒸腾速率,提高转基因株系盐胁迫下的净光合速率,因此盐胁迫下转基因株系保持了相对较高的生长量。BADH基因的导入提高了转基因株系对盐胁迫适应能力。
许多研究表明:在高盐、干旱、低温等胁迫诱导下,BADH基因表达量的增加在不同植物之间存在显著差异(Nakamura et al., 2001;刘佳琪等,2012)。在非胁迫条件下,基因工程使得转基因植株在体内积累甜菜碱的含量为0.05~5 μmol·g-1FW(段晓光等,2004),耐盐性强的胡杨(Populus euphratica)受到盐胁迫后甜菜碱含量显著提高,特别是叶中甜菜碱含量达到1.90 μmol·g-1,提高约243倍(陈少良等,2001)。本研究中转基因株系在6 g·L-1盐浓度胁迫下甜菜碱积累量最大,但仅相当于0.02 μmol·g-1,约为对照处理2.8倍,表明该基因的表达效果不强。在盐胁迫下对各项生长指标与生理参数综合性分析表明,转基因株系3 g·L-1较低浓度盐胁迫下,表现出良好的适应性,耐盐能力强于非转基因对照,然而在6 g·L-1较高盐浓度胁迫下,虽然甜菜碱与Bt毒蛋白积累量继续增加,但转基因株系与107杨的各项生理指标对比并没有表现出明显差异,受盐害程度较大。从而进一步证明,BADH基因表达能力较弱,在6 g·L-1较高盐浓度胁迫下,同时超出转基因株系幼苗对盐害的耐受能力。当然,本研究仅为人工气候室条件下盆栽幼苗试验结果,转基因株系在田间条件下的耐盐性表现还需作进一步研究。
Ren等(2015)将多基因表达载体BtCry1Ac+BtCry3A+BADH转化烟草(Nicotiana tabacum),每个外源基因均为CaMV35S启动子,结果显示BADH基因表达水平较低。本研究中转基因株系所用植物表达载体与之相同,而外源BADH基因表达效果同样较差,分析其原因可能是多基因排列顺序或者多基因间由于启动子相同而相互作用,导致多个外源基因不能同时高效表达。多基因表达载体的构建和转化仍面临一系列技术难题(袁飞荣等,2011;Untergasser et al., 2012)。在今后研究中,应考虑从以下几方面进行改善,以期达到多个外源基因在转基因植株中同时高效地表达:首先,在构建转化载体时,根据不同外源基因使用不同特异性启动子,降低序列的重复性;其次,构建载体时在外源基因两侧添加增强序列或者核基质结合区MAR,促使外源基因稳定高效地表达;第三,可以通过优化起始密码周边序列,对基因编码区进行修饰改造等方式增强翻译效率,例如对基因进行修饰,使其更接近植物中GC含量,以提高其表达量。
有研究提出,盐胁迫条件可以抑制或诱导多种cDNA克隆子、mRNA和特异蛋白质的合成,通过代谢产物的诱导或阻遏作用,影响相关基因表达,以适应胁迫条件下细胞内的特殊代谢反应(孙静等,2006;赵凤云等,2007)。韩会景等(2007)将发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri质粒T-DNA转入双抗虫基因‘741杨’[Populus alba×(P. davidiana+P. simonii)× P. tomentosa]株系Pb29后,生长素(IAA)和赤霉素(GA)含量升高,Bt毒蛋白表达受抑制,提出可能是发根基因促使激素含量提高,导致代谢发生变化,促进植物发根,但抑制了某些结构蛋白质的表达,从而使Bt毒蛋白的表达也受到抑制。经过盐胁迫处理后,激素含量呈降低趋势,Bt毒蛋白的表达上升。这可能是由于盐胁迫使转基因杨树生长素和细胞分裂素类物质表达受到抑制,而诱导产生一些特异抗盐蛋白,从而缓解对Bt毒蛋白的表达抑制。本研究中Bt毒蛋白的含量随盐处理浓度增加呈现升高趋势,其原因可能是正常条件下外源基因表达受到植物的某种抑制,但随着盐处理浓度的增大,细胞内代谢发生变化,某类代谢产物的积累或者减少缓解了Bt基因的表达抑制。
4 结论在人工气候室控制条件下,通过盆栽浇施不同浓度NaCl溶液进行盐胁迫处理,25天时对转多基因107杨及未转基因对照107杨生长性状、生理指标的测定结果表明,盐胁迫下转基因107杨幼苗生长受盐害影响较小;在3 g·L-1低盐浓度处理下,转基因株系质膜透性显著低于107杨,叶绿素含量升高幅度较大,蒸腾速率与净光合速率增加且显著高于107杨;Y(Ⅱ)小幅度降低但显著高于对照,光系统Ⅱ能够保持较高的电子传递速率;Fv/Fm上升幅度较大,表明转基因株系具有较大光合作用潜力。在6 g·L-1高盐浓度处理下,转基因株系叶绿素含量降低,而质膜透性、净光合速率均显著降低,Fv/Fm、Y(Ⅱ)均呈现较大幅度下降,光系统Ⅱ电子传递受到较大影响,光合能力下降,变化趋势与对照无显著差异,2个株系幼苗均受到较大程度的伤害。转多基因107杨在3 g·L-1低盐浓度处理下表现出良好的适应性,耐盐性优于107杨;在6 g·L-1高盐浓度处理下转基因株系与对照107杨均受到较大影响,转基因株系并未显示其优势。对转基因株系中外源基因表达产物积累量的研究结果表明,随盐浓度的增加,Cry1Ac毒蛋白、Cry3A毒蛋白及甜菜碱的含量逐渐增加,在高盐浓度胁迫下积累量显著增加,盐胁迫在一定程度上可以诱导外源Bt基因、BADH基因表达加强。
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