各种各样恶劣的环境条件影响着植物的生长、代谢、生产力等，其中，干旱是限制植物生长和产量的主要因素之一(Araus et al., 2002; Reddy et al., 2004)，它对农作物和林木造成的损失仅次于病虫害类生物胁迫，在所有的非生物限制因子中占首要地位(马耀光等, 2003)。叶片是植物进行光合作用的主要器官，也是植物对干旱胁迫最敏感的部位之一(李欢等, 2013; 燕玲等，2002)，在干旱环境中生长的植物，往往会形成多种抗旱性的形态结构，其中叶片结构最能反映植物对干旱生境的适应性(Zhao et al., 1981; 李芳兰等，2005)。此外，植物叶片抗旱性生理可塑性强，因此叶片形态结构和生理变化可用来反映植物对干旱的适应性强弱(Rubio de Casas et al., 2007)。

银中杨(Populus alba × P. berolinensis)是以银白杨(Populus alba)为母本、中东杨(Populus berolinensis)为父本，经人工杂交选育而成，具有速生、树形优美等特点，但耐盐能力较差，影响了其推广应用。隶属于ERF类的转录因子JERFs来源于番茄(Lycopersicon esculentum)，它能专一结合GCC-box，激活植物下游抗逆相关基因的表达，提高植物耐盐、抗旱、抗寒性(李文正等, 2006; Zhang et al., 2010; Wu et al., 2008)，在烟草(Nicotiana tabacum)中表达的JERF3还能激活光合碳同化相关基因(Wu et al., 2008)。中国林业科学研究院林业研究所于2000年通过农杆菌介导法将JERF36基因导入银中杨(苏晓华等, 2009)。经分子生物学检测、温室盐胁迫和大田盐碱地试验，证明目的基因成功导入并稳定表达，转JERF36银中杨的耐盐性得到显著提高(李义良, 2008; Li et al., 2009)，然而，前期研究并未对转基因银中杨的抗旱性进行相关评价。本研究以转JERF36银中杨(ABJ01) 和非转基因银中杨(9#)为试验材料，从叶片形态、解剖结构和光合生理特性角度探索转JERF36基因银中杨对干旱胁迫的响应，研究JERF36基因的导入对银中杨抗旱性的影响，以期为转基因杨树的抗旱性评价提供参考，并为转基因杨树的推广应用提供科学依据。

试验材料为中国林业科学研究院林业研究所2000年通过农杆菌介导法成功转化获得的转JERF36基因银中杨(ABJ01) 和非转基因银中杨(9#)。2015年4月10日将ABJ01和9#的1年生植株，截成15 cm左右的硬枝插穗，扦插于塑料小盆中(10 cm × 10 cm)，基质为草炭土和珍珠岩，每盆1株，在温室正常供水条件下培养。2015年5月20日将生长良好且一致的植株移栽至高度21 cm、直径19 cm的塑料大盆中，基质由黄土、沙土和草炭土按10:2:1的比例混合配制而成，每盆基质质量5.5 kg，正常供水条件下培养。

待苗高达到45 cm左右时(6月底)，每个株系选择大小一致、生长健壮的苗木18株(盆)，进行干旱胁迫处理。试验采用完全随机区组设计，共3个水分处理：正常供水、中度胁迫、重度胁迫，土壤含水量分别控制在田间持水量的60~80%，40~60%，20~40%，每个处理重复3次。每天17：00时称取各盆质量，补充水分，使各盆土壤含水量保持在试验控制范围之内。干旱胁迫处理30天后(7月底)测定各项指标。

在中国林业科学研究院温室内进行试验，温室内6—9月平均温度控制在25~30 ℃，平均相对湿度为55%；温室透光性良好，晴天9:00—11:00室内光合有效辐射PAR约为800 μmol·m^-2s^-1，室内CO₂浓度约为380 μmol·mol^-1。

苗高指从苗木土痕处到苗木最高点；叶片数量是指从顶端第1片完全展开叶到苗木下端最后1片存在生理活性的叶片总数。

采用CI-203激光叶面积仪活体测量植株叶面积，测量叶片均为植株顶端向下第5，6，7片功能叶，每个处理重复3次。

在苗木中部偏上选取干旱胁迫后新形成的、大小基本一致的叶片，靠近其中脉位置处切取0.3 cm × 0.3 cm的小片，立即放入FAA溶液中固定24 h以上。采用半薄切片技术，经脱水和透明，置换和浸透，Spurr树脂包埋和聚合，制成包埋样品；使用半薄切片机(Leica EMUC7切片机, Germany)进行切片，薄切片厚度为3 μm，制片后采用0.5%的甲苯胺蓝(toluidine blue O，TBO)染色，随后在显微镜下观察照相(Zeiss Axioskop2 plus；AxioVisionRel.4.4)，并用软件(AxioVisionRel.4.4) 测量各指标值：叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、叶片组织紧密度(CTR)、叶片组织疏松度(SR)。每个处理重复3次，每个株系8~10个切片，每个切片每个指标记录3个数据。CTR和SR的计算公式如下(潘存娥, 2011)：

CTR(%)=栅栏组织厚度/叶片厚度× 100,

SR(%)=海绵组织厚度/叶片厚度× 100。

采用美国Li-COR公司生产的LI-6400XT便携式光合测定仪，于9:00—11:00进行P_n、G_s、C_i、Tr等气体交换参数测定。LI-6400XT的光合有效辐射(PAR)设定为800 μmol·m^-2s^-1，CO₂浓度控制为400 μmol·mol^-1。测量叶片均为植株顶端向下第5，6，7片功能叶，每片叶重复测量3次，每个处理3次重复。

采用德国WALZ公司的Mini-PAM超便携式调制叶绿素荧光仪，于23:00—24:00时测定暗适应后的各株系中部叶片最大荧光产量(F_m)和可变荧光(F_v)，计算F_v/F_m。每个处理重复3次，每个株系记录5片叶数据。

叶绿素含量测定参考《植物生理学实验指导》(高俊凤, 2006)。称取植物新鲜叶片0.1 g于25 mL容量瓶中，加入0.5 mL纯丙酮和15 mL 80%丙酮，盖上瓶盖室温下暗处浸提过夜(期间摇动3~4次)，直至样品全部变白为止，用80%丙酮定容浸提液至25 mL。5 000 r·min^-1下离心5 min，以80%丙酮为空白对照，用分光光度计在645, 663 nm波长下测定浸提液的吸光度，计算组织中叶绿素含量。测定的叶片为从植株顶端向下第5, 6, 7片功能叶，每个处理重复3次。

采用Excel 2013进行数据处理，并通过SPSS17.0统计软件进行多重比较(采用Duncan新复极差法)。

正常供水条件下，ABJ01和9#的苗高、叶片数量及单叶面积差异均不显著。干旱胁迫下，ABJ01和9#的苗高生长均受到一定程度的抑制，随着胁迫程度的加剧，受抑制程度增大，但ABJ01受抑制程度较低，在中度和重度干旱胁迫下苗高比9#分别高5.39%和9.38%，重度干旱胁迫下二者差异达到显著水平。与正常供水相比，2个株系的叶片数量在干旱胁迫下均显著减少，但ABJ01叶片数量略高于9#。干旱胁迫下，2个株系的叶面积生长均受到显著抑制，ABJ01和9#分别比正常供水低3.50%~27.39%和15.19%~32.86%。中度和重度干旱胁迫下，9#的叶面积比ABJ01分别显著低10.82%和13.79%，说明ABJ01叶片生长优于9#。以上结果说明，转基因银中杨在干旱胁迫下具有更强的生长能力，其抗旱能力可能得到增强。

研究表明，干旱胁迫下，2个株系的叶片厚度、上表皮厚度、海绵组织厚度、下表皮厚度与正常供水条件相比显著降低。9#栅栏组织厚度干旱胁迫时比正常供水显著低5.96%~8.32%，而ABJ01则干旱胁迫时比正常供水显著高7.36%~9.55%。中度胁迫下，ABJ01的叶片上、下表皮厚度比9#分别显著高5.55%和4.70%，栅栏组织厚度比9#显著高6.17%，表明ABJ01具有更发达的栅栏组织，但海绵组织厚度和SR则分别比9#显著低12.35%和12.38%；重度胁迫下，ABJ01的叶片上、下表皮厚度分别比9#显著高16.27%和10.05%，海绵组织厚度和SR则分别比9#显著低11.71%和11.58%。以上结果说明，ABJ01叶片结构可能更有利于提高其在干旱胁迫时的适应能力。

正常供水下，ABJ01与9#的净光合速率(P_n)差异不显著，随着干旱胁迫程度的加剧，2个株系的P_n均逐渐降低。中度和重度胁迫下，ABJ01的P_n分别比9#降低10.50%和18.97%，重度胁迫时二者达显著水平(图 2A)。结果说明ABJ01在干旱胁迫下具有更强的光合能力，这可能与ABJ01具有发达的栅栏组织有关(表 2)。

图 1 叶片解剖结构组成 Fig.1 Leaf anatomical structures 图中大写字母A、B、C分别表示9#在正常供水、中度胁迫、重度胁迫下的叶片结构组成；D、E、F分别表示ABJ01在正常供水、中度胁迫、重度胁迫下的叶片结构组成。Capital letters A, B, C respectively represent leaf anatomical structures of 9# at control, moderate drought stress and severe drought stress; D, E, F respectively represent leaf anatomical structures of ABJ01 at control, moderate drought stress and severe drought stress.

图 2 干旱胁迫下杨树气体交换参数变化 Fig.2 Changes of gas exchange parameters in poplar under drought stresses 小写字母表示相同株系不同干旱处理间差异显著, *表示相同处理下不同系号间差异显著，显著性水平均为0.05。Lowercase letters represent significant differences result of same poplar lines at different treatments; * represent significant difference test result of different poplar lines at same treatment; Significant level is at 0.05.

表 2 干旱胁迫下各株系叶片解剖结构变化 Tab.2 Changes of leaf anatomical structure in different poplar lines under drought stress

表 2 干旱胁迫下各株系叶片解剖结构变化 Tab.2 Changes of leaf anatomical structure in different poplar lines under drought stress

正常供水下，ABJ01与9#的气孔导度(G_s)、胞间CO₂浓度(C_i)和蒸腾速率(Tr)差异均不显著，随着干旱胁迫程度的加剧，2个株系的G_s、C_i和Tr均逐渐降低(图 2B，C，D)，变化趋势与P_n一致。与正常供水相比，重度胁迫下2个株系的G_s显著降低，且在重度胁迫时ABJ01的G_s比9#高17.80%(图 2B)，说明ABJ01可能具有更强的气体交换能力。中度干旱胁迫下，ABJ01的C_i比9#显著低1.67%(图 2C)，这与其具有较高的P_n有关。重度胁迫时ABJ01的Tr比9#显著低8.29%(图 2D)，说明干旱胁迫下，ABJ01的保水能力较强。

F_v/F_m变化干旱胁迫下，2个株系的PSⅡ最大光化学效率(F_v/F_m)变化如图 3。正常供水下，2个株系的F_v/F_m差异不显著。干旱胁迫下2个株系的F_v/F_m显著降低，中度胁迫下，9#和ABJ01分别比正常供水降低2.82%和1.35%，重度胁迫下，则达到5.70%和5.20%。另外，在干旱胁迫时ABJ01的F_v/F_m高于9#，说明干旱胁迫处理后，ABJ01的光系统受损程度较9#小，这与其具有较高的P_n有关(图 2A)，ABJ01的抗旱能力可能得到增强。

图 3 干旱胁迫下转基因银中杨Fv/Fm变化 Fig.3 Changes of Fv/Fm in transgenic poplar under drought stress

干旱胁迫下，2个株系的叶绿素含量变化如图 4。正常供水下，ABJ01与9#的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量差异均不显著。干旱胁迫下，2个株系的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素的含量较正常供水均呈降低趋势(ABJ01在重度胁迫下叶绿素b含量例外)，但ABJ01的降低幅度较9#小。重度干旱胁迫下，ABJ01的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量分别比9#显著高18.50%，29.13%和21.28%。说明干旱胁迫下转基因株系维持叶绿素含量稳定的能力较非转基因株系强。

图 4 干旱胁迫下杨树叶片叶绿素含量差异比较 Fig.4 Differences of leaf chlorophyll content in poplar under drought stress

植物生长量的降低是对干旱胁迫的一种响应(Boughalleb et al., 2011)，树木一般通过减小叶面积、降低蒸腾来适应干旱胁迫(叶龙华等, 2014)。本研究表明，干旱胁迫下，2个株系的苗高生长均受到一定程度的抑制，但ABJ01苗高比9#分别高5.39%和9.38%，其中重度胁迫下二者差异达到显著水平；2个株系的单叶面积均显著降低，但9#的单叶面积显著低于ABJ01，表明ABJ01的苗高和单叶面积生长受干旱胁迫程度较9#小(表 1)。干旱胁迫下，转基因株系具有更强的生长能力，其抗旱能力可能得到提高。

表 1 干旱胁迫下苗木生长及叶片形态差异^① Tab.1 Differences of seedling growth and leaf phenotype under drought stress

表 1 干旱胁迫下苗木生长及叶片形态差异① Tab.1 Differences of seedling growth and leaf phenotype under drought stress

干旱胁迫通常会引起植物形态、叶片水势、光合碳同化等生理生化进程发生改变(Wang et al., 2003)，进而影响植物的生长发育。植物叶片形态解剖学特征和光合生理特征等指标比较容易观察和测量，可用来反映植物对干旱胁迫的适应性(Boughalleb et al., 2011; Ennajeh et al., 2010; 陈昕等, 2012; 潘存娥等, 2011; 李欢等, 2013)。本研究表明，干旱胁迫下，2个株系的叶片表皮细胞厚度和海绵组织厚度显著降低，ABJ01的栅栏组织厚度呈增加趋势，9#的栅栏组织厚度呈减少趋势(表 2)，这与Chartzoulakis等(2002)研究干旱胁迫对鳄梨(Persea americana)叶片解剖结构影响的研究结果类似。与9#相比，在干旱胁迫下，ABJ01的叶片表皮厚度较大，具有发达的栅栏组织，而海绵组织厚度和叶片组织疏松度则较小(表 2)，表现出较强的干旱适应能力。较厚的表皮细胞和发达的栅栏组织有利于植物保持水分以及更好地保护内部组织，从而提高植物的存活率并有助于植物生长(Bacelar et al., 2004)。此外，叶肉栅栏组织发达、海绵组织厚度相对减少及叶片组织紧密度增大等特征，有助于CO₂从孔下室传导至光合作用场所，在气孔导度较低的情况下维持植物较高的光合速率，提高植物的保水能力和抗旱能力(Chartzoulakis et al., 2002; Evans et al., 2000)。本研究显示，中度和重度干旱胁迫下，ABJ01的P_n分别比9#高10.50%和18.97%，重度干旱胁迫下达显著水平(图 2A)，在重度胁迫时ABJ01的Tr比9#显著低8.29%(图 2D)；重度干旱胁迫下，ABJ01的G_s较9#高17.80%(图 2B)，说明干旱胁迫下转基因银中杨的叶片保水能力和CO₂交换能力更强，能在较低的G_s下维持较高的P_n。研究表明，干旱胁迫导致植物叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量显著降低(王林龙等, 2015; 井大炜等, 2014)，本研究结果与之相似，这可能是由于叶绿体膜受到破坏，造成叶肉细胞水分缺失所致(Anjum et al., 2011)。干旱胁迫导致F_v/F_m显著降低，表明植物光系统受损严重(井大炜等, 2013)，本研究结果与之相似。与9#相比，重度干旱胁迫时ABJ01的叶片叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量(图 4)及F_v/F_m较9#高(图 3)，表明转基因银中杨叶肉细胞维持叶绿素含量稳定的能力较强，保水能力更强，且光系统受损程度更小，其抗旱能力得到提高。另外，有研究表明转录因子JERFs的导入可激活转基因烟草中与光合碳同化相关基因(Wu et al., 2008)，维持植物在干旱胁迫时较高的光合速率。下一步可通过研究干旱胁迫下转基因银中杨中JERF36的表达与光合碳同化相关基因的关系，阐明转基因杨树在干旱胁迫下维持较高的P_n的机制，为进一步研究转基因银中杨的抗旱性机制奠定基础。

属于ERF类的转录因子JERF36可能通过影响转基因银中杨叶片结构发育提高转基因银中杨在干旱胁迫下的气体交换能力和保水能力，增强转基因银中杨的抗旱能力。