磷是植物生长发育所必需的大量营养元素，植物对磷的吸收是一个跨表皮及皮层细胞质膜的逆浓度梯度主动运输过程，该过程受根系细胞膜上的磷转运蛋白调控(Scheible et al., 2015)。当介质有效磷元素较低时，植物会启动高亲和力磷转运系统以增强对无机磷的吸收，这一过程主要依靠根系细胞膜上PHT1家族的高亲和力磷转运子基因进行调节(Nussaume et al., 2011)。PHT1基因家族属于MFS超级家族(杨存义等, 2006)，是H₂PO₄^－/nH⁺共运体，为高亲和性的磷转运蛋白质(Preuss et al., 2010)。PHT1基因位于根系细胞膜上，利用质膜上的氢离子浓度梯度来驱动植物对土壤溶液中可溶性磷的吸收，可以从仅含μmol·L^-1级的磷介质中将无机磷酸盐(P_i)转运到细胞质中(Poirier et al., 2015)，具有参与植物吸收和转运磷的重要功能。

植物PHT1家族成员基因表达水平的升高是植物适应低磷胁迫的普遍机制。对拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小麦(Triticum aestivum)、水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)等植物PHT1基因的表达研究表明：在介质磷浓度满足植物生长情况下，PHT1基因表达受到抑制，少量表达或不表达；在介质磷浓度较低时，植物高亲和力转运系统启动，从而诱导PHT1基因强烈表达；对PHT1基因表达进行干扰将会导致根系吸收磷能力的降低(Yang et al., 2010)。因此，PHT1基因的高表达是植物磷高效吸收利用的重要指标之一，挖掘植物磷高效吸收利用的基因资源进行遗传改良，是缓解土壤有效磷缺乏和提高磷肥利用效率的有效途径之一。研究表明，植物PHT1家族的成员组成和表达受植物种及品种的影响，水稻、玉米(Zea mays)等植物不同品种在低磷胁迫下的PHT1基因表达具有明显差异(Ai et al., 2009; Calderon-Vazquez et al., 2008)。在水稻、大豆、欧洲油菜(Brassica napus)、烟草(Nicotiana tabacum)、油茶(Camellia oleifera)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)等农作物中都克隆得到了部分PHT1家族的磷转运蛋白基因成员，并根据PHT1基因的表达量变化来筛选和培育了一些磷高效农作物品种或无性系，为揭示植物的磷转运机制和提高磷素利用效率奠定了基础。目前，对植物PHT1基因的研究主要集中在1年生农作物上，在森林树种上的研究报道较少，仅见毛果杨(Populus trichocarpa)、橡胶树(Hevea brasiliensis)等乔木中。

杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国南方最主要的用材林造林树种之一，其面积和蓄积量均居我国人工林树种的首位(俞新妥，2006)。由于南方酸性土壤对磷具有强烈化学固定作用，土壤磷素多以Fe-P、Al-P和O-P等形态存在(贾兴永等，2011)，这使得南方林区土壤固定态磷丰富，但是有效磷极度缺乏，杉木等南方林木表现出“遗传学缺磷”现象(梁霞等，2006)。长期以来，南方森林土壤有效磷不足一直是限制杉木人工林产量最重要的因素之一。因此筛选和培育磷高效杉木基因型，提高杉木对土壤磷素的吸收和利用效率，是培育杉木速生高效人工林和缓解多代连栽下杉木人工林地力衰退的重要方向。然而目前在杉木磷转运蛋白基因方面研究报道较少，据此课题组在长期的杉木耐低磷胁迫试验研究中，选育了一些磷高效吸收利用杉木基因型，这些杉木基因型或主要通过根系皮层细胞溶解、加快体内磷素的转运来抵抗磷胁迫逆境(4号、32号家系等)；或主要通过在贫磷斑块中的根系向四周拓展增生和分泌化学物质，增强对介质中磷的吸收效率来适应环境的磷胁迫(25号、32号家系等)(汪攀，2015；吴鹏飞等，2012)。以这些磷高效利用杉木基因型为研究材料，对于发掘杉木高亲和磷转运子PHT1基因起到重要作用并具有实践意义。

本试验以磷高效利用杉木4号、15号、25号、27号、28号、32号家系为试验材料，根据植物PHT1基因的保守性氨基酸序列设计简并引物，利用RT-PCR和RACE技术对杉木PHT1基因全长进行克隆，对其序列特征、同源性和编码磷转运蛋白结构进行分析，并使用荧光定量PCR检测杉木PHT1基因在磷高效杉木基因型中的时空表达情况，以期为揭示杉木吸收磷营养的分子机制和选育磷高效利用杉木基因型奠定基础。

选取种植在福建农林大学妙峰山试验苗圃的1年生不同利用效率的磷高效杉木4号(1.14±0.08) kg·g^-1、15号(1.10±0.06) kg·g^-1、25号(1.77±0.22) kg·g^-1、27号(1.38±0.03) kg·g^-1、28号(0.73±0.06) kg·g^-1、32号(1.09±0.02) kg·g^-1(汪攀，2015)家系幼苗，根系经纯水清洗后固定于塑料小桶进行水培供磷试验。幼苗经过7天正常供磷营养液培养后，进行不同程度缺磷胁迫处理。分别在缺磷胁迫0，12，24，48 h，以及恢复正常供磷12，24，48 h时采集幼苗的根、茎和叶，液氮速冻后-80 ℃保存待用。

利用KH₂PO₄设置3个供磷水平：正常供磷(1.0 mmol·L^-1 KH₂PO₄)、中度缺磷(0.5 mmol·L^-1 KH₂PO₄，0.5 mmol·L^-1 KCl)和重度缺磷(0 mmol·L^-1 KH₂PO₄，1.0 mmol·L^-1 KCl)，胁迫中不足的K⁺用等量KCl代替。其他营养元素含量根据吴鹏飞(2009)改良的1/3Hoagland营养液配方进行补充，即5.0 mmol·L^-1 KNO₃、2.0 mmol·L^-1 MgSO₄·7H₂O、5.0 mmol·L^-1 Ca(NO₃)₂·4H₂O、l mL·L^-1 Fe-EDTA, Arnon微量元素(46.3 μmol·L^-1 H₃BO₃、0.3 μmol·L^-1 CuSO₄·5H₂O、0.8 μmol·L^-1 ZnSO₄·7H₂O、9.1 μmol·L^-1 MnC1₂·4H₂O、0.4 μmol·L^-1 H₂MoO₄·4H₂O)，调节营养液pH为5.8。

采用RNA plant plus植物总RNA提取试剂盒(天根公司)提取重度缺磷处理24 h的32号磷高效杉木根系总RNA，并使用Fermentas公司RT-PCR试剂盒合成cDNA第1条链。

根据油茶(GenBank：EU496869.1)、拟南芥(GenBank：AB005746)、玉米(GenBank：NM001111799.1) 等植物PHT1基因氨基酸序列中的保守区，利用Primer Premier 5.0软件设计简并引物ClPht1-R1: 5′-GTGCTGAATGCACTCGATGT-3′和ClPht1-F1: 5′-CCTAGCTGGGAAAATCTCAGC-3′对杉木根系cDNA进行PCR扩增，反应程序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸100 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。扩增产物经天根公司DNA凝胶回收试剂盒回收、纯化后，连接到pGEM-T Easy(TaKaRa公司)载体上进行测序，获得目的基因的核心片段。

采用Invitrogen公司5′RACE(Version2.0) 试剂盒，设计特异引物(5′-1：5′-TCGGAGGCAGAGAACC-3′；5′-2：5′-TCCCAGGAGCCTCGTCAC-3′；5′-3：5′-GCAGAAG AGGTCATACGCATC-3′)克隆目的基因的5′端序列。使用Superscript Ⅱ RT酶和引物5′-1对总RNA进行目的基因第1链cDNA的合成，使用引物5′-2和桥连铆钉引物AAP(5′-GGCCACGCGTCGACTAGT ACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′)对已经加dC尾的cDNA进行PCR第1轮扩增，使用引物5′-3和桥连通用扩增引物AUAP (5′-GGCCACGCGTC GACTAGTAC-3′)进行巢式PCR第2轮扩增，扩增产物连接载体及测序过程同上。

采用Clontech公司的SMARTer^TM RACE试剂盒，设计特异引物(3′-1：5′-ACCTGGTTTCTTCT GGACATCGCCTACT-3′；3′-2：5′-AACCTGTTTCAA AAGGACATCTTCACGG-3′)克隆目的基因的3′端序列。使用逆转录酶SmartScribe^TM Reverse Transcriptase和引物3′CDS primer A(5′-AAGCAGTGGTATC AACGCAGACTAC(T)30 V N-3′)对总RNA进行逆转录合成cDNA，并以此cDNA为模板，使用引物3′-1和UPM(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCA AGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)进行第1轮PCR扩增。扩增产物稀释50倍后，用引物3′-2和UPM进行第2轮PCR扩增，扩增产物连接载体及测序过程同上。

根据获得的目的基因核心片段、3′末端和5′末端3个序列信息，利用Vector NTI10.3.0软件进行序列拼接，获得目的全长基因的cDNA序列。设计上游引物QC288F：5′-TTGAACCATGGCGGAGAA GC-3′和下游引物QC288R：5′-CTAAGCTGGT GCGGTTCTGG-3′，采用Takara Taq polymerase对目的基因全长进行PCR扩增，反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性60 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸180 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物连接载体及测序过程同上。

通过DNAMAN软件预测测序所得目的基因编码的氨基酸序列，并使用ORF Finder预测杉木PHT1基因的最长开放阅读框。使用NCBI在线Blast检索其他植物PHT1基因编码氨基酸序列，并采用Clustal X2.1软件进行多序列比对。使用ProtParam软件和ProtScale软件预测目的基因编码蛋白质的分子量、等电点、不稳定系数、疏水性等理化性质；使用TMpredServer软件和MobylePortal软件预测目的基因编码蛋白质的跨膜结构和拓扑结构；使用SOPMA软件和Swiss-model软件预测目的基因编码蛋白质的二级和三级结构。

采用实时荧光定量PCR检测目的基因在32号磷高效杉木家系根、茎、叶中的表达情况；检测中度缺磷胁迫下目的基因在不同磷利用效率杉木4号(1.14±0.08) kg·g^-1、15号(1.10±0.06) kg·g^-1、25号(1.77±0.22) kg·g^-1、27号(1.38±0.03) kg·g^-1、28号(0.73±0.06) kg·g^-1、32号(1.09±0.02) kg·g^-1家系根系中的表达差异；检测中度、重度供磷胁迫下0，12，24，48 h，以及恢复正常供磷12，24，48 h目的基因在32号磷高效杉木家系根系中的表达量变化，以上试验均设置3次生物学重复。实时荧光定量PCR在Roch480荧光定量PCR仪上进行，荧光染料采用TakaRa公司SYBR Green PCR Master Mix，上游引物5′-GGCCATTCCGTACAACCACTG-3′，下游引物5′-AATTCTTGACCCCAATACCCT-3′。使用β-Actin基因作为内参基因，其上游引物为5′-TACATTGCCGGTGTATTGAACGTC-3′，下游引物为5′-AGTTGCTCCAGAAGAACATCC-3′。PCR反应程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45个循环；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，逐渐升温到95 ℃，速度0.11 ℃·s^-1。扩增结果采用2^-△△Ct法计算目的基因的相对表达水平。

以重度缺磷处理24 h的32号磷高效杉木根系cDNA为模板，采用设计的简并引物ClPht1-R1和ClPht1-F1进行PCR扩增测序，获得1个长度为1 004 bp的杉木PHT1基因保守片段序列(图 1A)。根据获得的杉木PHT1基因保守序列分别设计目的基因的5′和3′ RACE特异引物，5′RACE-PCR扩增得到长度为250 bp的片段(图 1B)，3′RACE-PCR扩增得到长度为1 000 bp片段(图 1C)。将目的基因保守序列、5′RACE片段和3′RACE片段拼接后获得全长为1 967 bp的基因序列。依据拼接获得的基因序列设计全长引物H1和H2，扩增目的基因全长并测序验证，在预测位置获得单一清晰的目的条带(图 1D)，测序结果与拼接的序列一致，命名为杉木高亲和磷转运蛋白基因ClPht1;1(GenBank登录号：KX302006)。

图 1 杉木PHT1基因保守片段(A)、cDNA 5′RACE(B)、cDNA 3′RACE(C)和全长基因(D) Fig.1 Cunninghamia lanceolata PHT1 gene conservative fragment (A), cDNA 5′RACE (B), cDNA 3′RACE (C) and full length gene (D)

ClPht1;1基因(GenBank登录号：KX302006) 全长序列分析表明，其长度为1 967 bp，开放阅读框为1 638 bp，编码1个含545个氨基酸的蛋白质，编码蛋白分子量为59.95 kDa，等电点为9.04。ClPht1;1基因编码多肽的原子组成为C₂₇₅₀H₄₁₉₈N₆₉₈O₇₅₁S₂₈，不稳定系数是33.44，表明其为稳定蛋白质分子。ClPht1;1基因的脂肪系数为82.57，总平均亲水性为0.226，ProtScale软件分析表明ClPht1;1基因编码蛋白含有较多的疏水区域，为疏水性蛋白(图 2)。

图 2 ClPht1;1疏水性曲线 Fig.2 ClPht; 1 hydrophobic curve

利用在线TMpred Server和Mobyle portal软件对ClPht1;1基因编码蛋白进行跨膜结构和跨膜区拓扑结构预测，结果表明ClPht1;1基因编码蛋白具有12个跨膜域(TM)，其中含1个疑似跨膜域，包括6个N端的跨膜区以及6个C端的跨膜区，中部(TM6和TM7之间)由1个中央亲水环(hydrophilic loop)分隔(图 3)。每个跨膜结构域由17~25个氨基酸残基组成的螺旋构成，跨膜蛋白的N端、C端和中间的大环都分布在细胞质中，保守序列位于第4个跨膜域，ClPht1;1基因编码蛋白的跨膜区结构与其他物种PHT1基因编码蛋白的跨膜区结构基本一致(Nussaume et al., 2011)。使用SOPMA软件和Swiss-model软件对ClPht1;1基因编码蛋白质结构进行分析，结果表明其蛋白质二级结构中41.65%为α-螺旋，26.42%为与蛋白质功能相关的无规则卷曲，21.47%为延伸链，10.46%为β-转角；三级结构中构成蛋白质的主要骨架是α-螺旋(图 4)；保守域分析表明ClPht1;1基因编码蛋白有典型的MFS结构域。

图 3 ClPht1;1蛋白跨膜拓扑结构预测 Fig.3 Prediction of ClPht1;1 protein transmembrane topology

图 4 ClPht1;1蛋白三级结构预测 Fig.4 Prediction of ClPht1;1 protein tertiary structure

使用ClustalX2.1软件对ClPht 1;1基因和Blast获得的其他植物PHT基因编码氨基酸序列进行多重比对(图 5)。结果表明，ClPht1;1基因编码产物与日本柳杉(Cryptomeria japonica)PHT基因编码氨基酸序列的相似性为87%，与其他植物PHT基因编码氨基酸序列的相似性均在70%以上。其中，与马尾松(Pinus massoniana)和可可树(Theobroma cacao)等南方乔木PHT基因编码氨基酸序列相似性达到77%，与油茶、葡萄(Vitis vinifera)、胡杨(Populus euphratica)等相似性达到76%。

图 5 ClPht1;1及部分植物PHT基因编码蛋白的氨基酸序列多重比对 Fig.5 Multiple alignments of the amino acid sequences of ClPht1;1 and some plant PHT genes encoding proteins 罗马数字Ⅰ-Ⅻ表示12个跨膜区，虚框内表示疑似跨膜区；■表示N－糖基化位点；▲表示蛋白激酶C磷酸化位点；★表示酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。 Roman numerals Ⅰ-Ⅻ represent 12 transmembrane regions, virtual boxes represent the suspected transmembrane areas; ■ represents N-glycosylation site; ▲ represents protein kinase C phosphorylation site; ★ represents casein kinase Ⅱ phosphorylation site.

采用实时荧光定量PCR检测正常供磷情况下ClPht1;1基因在32号磷高效杉木家系根、茎、叶中的表达情况，结果表明ClPht1;1基因在杉木各组织部位均有表达，但在根中的表达量要远高于茎和叶，在叶片中的表达量较低(图 6)。中度缺磷胁迫(0.5 mmol·L^-1 KH₂PO₄)下，ClPht 1;1基因在不同磷利用效率杉木4号(1.14±0.08) kg·g^-1、15号(1.10±0.06) kg·g^-1、25号(1.77±0.22) kg·g^-1、27号(1.38±0.03) kg·g^-1、28号(0.73±0.06) kg·g^-1、32号(1.09±0.02) kg·g^-1家系根系中的表达量为25号＞27号＞4号＞15号＞32号＞28号(图 7)，表明ClPht1;1基因在杉木根部的表达量随着不同家系杉木磷利用效率的增强而升高。中度、重度(0 mmol·L^-1 KH₂PO₄)缺磷胁迫下ClPht1;1基因在32号杉木家系根系中的表达量随诱导时间(0，12，24，48 h)的延长均呈现明显的上调趋势；恢复供磷12 h后ClPht1;1基因表达量明显下降，并在恢复供磷24 h和48 h后呈现与正常供磷培养相近的表达量水平。重度缺磷胁迫下，ClPht1;1基因表达量要高于其在中度缺磷胁迫下的表达量，表明ClPht1;1基因的表达明显受介质低磷胁迫诱导(图 8)。

图 6 ClPht1;1在32号杉木不同组织中的表达分析 Fig.6 Expression analysis of ClPht1;1 in different tissues of Cunninghamia lanceolata No. 32

图 7 ClPht1;1在不同家系杉木根部的表达分析 Fig.7 Expression analysis of ClPht1;1 in roots in different families of Cunninghamia lanceolata

图 8 不同磷胁迫和处理时间下ClPht1;1在32号杉木根系的表达分析 Fig.8 Expression analysis of ClPht1;1 in roots of Cunninghamia lanceolata No. 32 under different P stresses at different treatment time

土壤中的无机磷(H₂PO₄^-)主要是通过位于植物根部细胞膜上的磷转运蛋白跨膜运输到植物体内的，细胞膜上磷转运蛋白的数量及其对磷的亲和性直接决定了植物对磷的转运效率。研究发现，植物体内主要存在4个磷转运蛋白基因家族PHT1、PHT2、PHT3和PHT4，其中PHT1基因已被证实为低磷诱导表达的高亲和磷转运蛋白基因家族，可以将土壤中μmol·L^-1级的磷跨膜转运到植物根系细胞内(Mitsukawa et al., 1997)。植物生长的土壤中有效磷含量大多为1~10 μmol·L^-1，因此PHT1基因家族在植物吸收和转运土壤磷素中起到非常重要的作用。对橡胶树HbPht1(汤银辉等，2010)、毛果杨PtrPHT1(王策等，2012)、油茶CoPht1;2(周俊琴等, 2013)、欧洲油菜BhPHT1;4(赵彩芝，2014)、豆梨(Pyrus calleryana)PcPht1(李慧等，2013)、大豆GmPT1和GmPT2(Wu et al., 2011)等植物PHT1基因的序列结构分析表明，植物PHT1基因家族编码约为58 kDa的蛋白质，含520~550个氨基酸残基，由12个亲脂的跨膜域组成，保守序列GGDYPLSATIMSE位于第4个跨膜域(王萍等，2006；李立芹，2011)。同时，PHT1基因编码蛋白的二级和拓扑结构具有疏水性强、α-螺旋所占比例高等跨膜蛋白的主要特征。本研究采用RT-PCR和RACE技术从杉木中克隆得到的PHT1基因，通过生物信息学分析表明ClPht1;1基因具有以上所述的典型的PHT1基因家族结构特征，同时与日本柳杉PHT基因编码蛋白的序列相似性达87%，与其他植物的PHT基因编码蛋白的序列相似性均在70%以上。由此可以确定ClPht1;1基因为杉木的高亲和性磷转运蛋白PHT1基因家族的一个成员。

PHT1基因家族成员大多主要在植物根部表达，一些PHT1基因不仅在植物根部表达，还在植物的茎、叶、花、块茎和子叶中表达，这些PHT1基因可能涉及到植株体内的磷转运功能(Liu et al., 2005)。在拟南芥中，PHT1;1和PHT1;9均受缺磷胁迫的诱导表达，除了PHT1;6在花粉中表达外，其他成员均主要在根中表达(Bayle et al., 2011)。马铃薯(Solanum tuberosum)StPT1和番茄(Lycopersicon esculentum)LePT1(Nagy et al., 2005)在缺磷或不缺磷的根部和地上部均能大量表达，但缺磷能诱导增强其表达量；StPT2和LePT2则仅在植株的根部受缺磷环境的诱导表达(Leggewie et al., 1997；Liu et al., 1998；Gordon-Weeks et al., 2003)。油茶BhPHT 1;4基因在嫩根、老根、茎、新叶、老叶中都有表达，但表达量依次递减(赵彩芝，2014)。本试验结果表明ClPht1;1基因与大部分植物PHT1基因类似，主要在杉木根部表达，叶片中仅能检测到少量表达信号。ClPht1;1基因在杉木根、茎和叶片中均有表达，说明其不仅参与杉木对土壤磷的吸收，而且可能参与杉木体内磷素的转运。植物对磷的转运效率受细胞膜上磷转运蛋白的数量及其对磷的亲和性决定，在中度缺磷胁迫下，ClPht1;1基因在不同磷利用效率4号、15号、25号、27号、28号、32号家系杉木根系中的表达量存在差异，表达量随着不同家系杉木磷利用效率的增强而升高，这可能与不同磷利用效率杉木根部细胞膜表面ClPht1;1磷转运蛋白数量多少有关。ClPht1;1基因的表达量随根系缺磷胁迫时间的延长和胁迫程度的加重而升高，在恢复供磷培养后表达量下降逐渐至正常水平，表明ClPht1;1基因的表达受低磷胁迫的诱导。综上研究，ClPht1;1基因的时空表达情况符合PHT1家族基因的表达特性，对杉木PHT1基因的表达量分析为磷高效转运基因型的筛选提供了参考。

磷是我国杉木人工林产量和质量的主要限制因子，由于南方红壤区土壤有效磷长期不足，杉木长期处于低磷的生长环境中。本试验从32号磷高效利用杉木家系的根部克隆获得一个高亲和磷转运蛋白基因ClPht1;1，其具有植物PHT1基因家族的典型结构特点和表达模式。对于长期处于低磷环境中的杉木，ClPht1;1在杉木高亲和转运土壤低浓度有效磷中起到重要的作用。目前，杉木PHT1基因家族的成员组成和各自的磷转运功能仍有待研究，深入解析杉木高亲和磷转运蛋白基因的结构和功能，对于了解杉木磷吸收的代谢机制，培育磷高效利用杉木品种和增强林分磷素管理都具有重要意义。