文章信息
- 卢万鸿, 杨桂丽, 林彦, 王楚彪, 罗建中
- Lu Wanhong, Yang Guili, Lin Yan, Wang Chubiao, Luo Jianzhong
- 桉树叶片水分状态的近红外光谱检测
- Assessing Leaf Water Status of Eucalyptus Using NIRS
- 林业科学, 2017, 53(5): 16-22.
- Scientia Silvae Sinicae, 2017, 53(5): 16-22.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20170503
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文章历史
- 收稿日期:2016-08-05
- 修回日期:2017-02-21
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作者相关文章
桉属(Eucalyptus)树种是中国南方最重要的速生高产人工林树种之一。作为纸浆材和原木的重要原料,桉树为木材工业提供了坚实的保障,并创造了大量的就业机会。赤桉(Eucalyptus camaldulensis)和细叶桉(E. tereticornis)作为优良的杂交亲本,因其具抗风、易于无性繁殖和耐旱等特性,对桉树种植者具有重要的经济意义。其杂交子代已在国内普遍种植(Luo et al., 2014)。在南非、印度、巴西和澳大利亚等国家,赤桉和细叶桉也因其耐旱性而作为优良的杂交亲本(Little et al., 2003; Barbour, 2004)。对于桉树人工林的可持续发展来说,耐旱性是影响其产量的关键因子之一,尤其是在降雨量和土壤含水量有限的时期。
在与林木生长和水分状态相关的生理指标中通常采用叶片相对含水量(RWC)和水势(Ψw)来研究和评价林木的抗旱性(White et al., 2016),同时这些生理指标也用于森林生态、森林水文及树木生理状况的评估和研究。然而,这类性状的传统测量方法一般都耗时、耗财且具有破坏性,给林木群体水分性状的研究改良带来限制(Warburton et al., 2014)。在林木改良中,为了评估这类性状的遗传变异水平,选择并改良这些性状,通常需要调查数百上千的个体。这就急需一种高效、快速、经济、非破坏且准确的测量方法用于此类性状的测量。
20世纪50年代中后期,近红外光谱(NIRS)技术在农副产品的品质性状的分析研究中得到广泛应用(Norris et al., 1961; Norris, 1964)。至今,该技术已扩展到如林产品、生命科学、矿石、天体科学、医学及基础化学等诸多领域(陆婉珍,2007;严衍禄,2005)。
利用近红外光谱技术测定植物水分生理性状,对植物的抗旱机制或辅助抗性育种研究有重要意义,这对结构性群体的大样本评估来说,可大大缩减工作量和成本。田庆久等(2000)用地球光谱仪采集110个活体小麦(Triticum aestivum)叶片的光谱反射率,通过研究其与叶片含水量的关系,提出小麦水分活体测定技术。毛罕平等(2011)用多种回归模型建立成功预测生菜(Lactuca sativa)叶片含水率的光谱校正模型,并证明结合应用不同回归方法得到的模型的预测效果会更好。目前,借助近红外技术进行植物水分相关性状的研究多见于草本等农作物,其在林木水分性状研究方面的报道还较少,且多是国外研究报道。
本研究的目的是利用近红外技术探索用于赤桉和细叶桉水分逆境相关生理指标(叶片RWC和叶片Ψw)的快速和无损测定方法,并建立预测模型。
1 材料和方法 1.1 遗传材料研究中校正集和验证集样本苗木均来自本课题组和中国桉树育种联盟的赤桉和细叶桉育种群体。采样群体共涉及赤桉7个种源21个家系,细叶桉5个种源26个家系(表 1)。广泛的遗传基础能够保证构成校正集和验证集的样本来源具有丰富的代表性,这也是获得稳定的NIRS校正模型的基本要求。
赤桉和细叶桉种子于2014年4月播种,播种基质由60%泥炭和40%珍珠岩构成。播种约4周后将具有2对真叶的幼苗移植到塑料盆(155 mm ~160 mm)中,基质为碳化稻壳、泥炭土和椰糠按等比例混合而成,另施用缓释肥(Agroblen® 9N:14P:19K + 3MgO + 0.5Fe),施肥量为400 g·m-3。
1.3 控水处理移植完成后,将所有苗木放置在自然照明的荫棚中,并在完全一致的灌溉条件下生长2个月。2014年11月,每家系选20株生长一致的苗木,并将其分成5组。随机选择完全浇水的5株苗估算其平均日蒸散量,再对5组苗木分别按日蒸散耗水量的100%,70%,50%,30%和0%进行控水,每2天浇1次水。
1.4 叶片相对含水量和水势的测量控水处理60天后,每家系每处理选出3株苗木,苗高约40 cm,选定其顶端第2对完全展开的叶片,叶片老幼程度适中,生活力旺盛。在采集其光谱信息(光谱采集见1.5) 后,其中一片用ARIMAD 3000(Israel MRC)露点微伏表测量叶片水势Ψw,另一片叶子用来测量叶片相对含水量。具体是:先称其鲜质量(Wf),再沿垂直主叶脉向将其剪成两半,并浸入盛有20 ℃蒸馏水的玻璃皿中,将玻璃皿置于荧光灯下。4 h后取出叶片用纸吸干表面水分称量,即为其饱和质量(Ws)。称量后的叶片装入信封,于60 ℃烘干48 h后再称量,得到叶片干质量(Wd)。连续测量18天。叶片相对含水量计算公式:
RWC=(Wf-Wd)/(Ws-Wd)×100%。
1.5 光谱信息采集和预处理用手持式近红外仪Phazir Rx (1624) (Polychromix, Thermo Scientific, USA)采集叶片光谱数据。仪器基于MEMS技术的可编程微衍射光栅,波长范围为1 600~2 400 nm,光学分辨率12 nm,以仪器自带参考片作为背景校正。对要测量RWC和Ψw的2片叶子,扫描叶片正面叶脉中部两侧的光谱信息各5次,以2片叶子的光谱均值(相当于20次均值)代表对应植株的光谱信息。多次扫描求平均是提高光谱信噪比简单而有效的方法,较单次光谱更具代表性(崔广,2007)。光谱信息采集连续18天,总共获得216条光谱,因其中1个样本光谱曲线明显偏离其他样本曲线,将其作为异常样本予以剔除。最后将所有样本随机分为校正集185个,验证集30个。
由于近红外光谱包含丰富的重叠带,这些谱带又是有机分子键成分和比例信息的直接反映,所以有机物的近红外光谱可以真实反映其主要生化组成(Cozzolino, 2009)。一般来说有多重因素会影响近红外光谱信息,如高频噪音、偏移、样品质地的不均及光的散射等,这些因素对近红外原始光谱产生的影响会大大降低其对未知样品预测的精度。
因此,要获得更好的近红外光谱校正模型,通常需要对原始光谱数据进行一系列预处理。对于多数农产品来说,进行近红外原始光谱的导数处理通常有助于降低其基线影响,增强光谱特征峰信息(严衍禄,2005;Conzen, 2003)。本研究中,通过对比校正模型的适合度,确定Savitzky-Golay二阶导数转换是较好的预处理选择,也有研究采用类似的光谱预处理(Humphreys et al., 2008)。
1.6 光谱异常值的剔除判断光谱异常值有2个方法,一是通过对所有样本作图,可以找出明显离群的样本。另外,在Unscrambler v9.7软件(CAMO, Oslo, Norway)的PCA分析中,样本如果具有较高的剩余方差(residual variance),则表明其为异常值。同时,如果样本具有高的杠杆值(leverage),说明其对校正模型有较强的影响,从而影响模型预测精度,类似样本如是个别现象即可考虑将其剔除。
1.7 光谱数据的分析用Unscrambler v9.7软件进行化学计量分析和光谱建模。PCA分析可以基于数据内部的相关性减少数据的维度,从而降低数据的复杂性。PCA中的载荷图表明不同主成分(PCs)和不同光谱点或光谱区间的关系。如果某个光谱点有大的正向或负向载荷,则表示诸多样本在该波长处的光谱信息存在很大的差异。所以,这种分析有助于偏最小二乘法(PLS)建模前的特征峰确定。一般来说PCA分析中PC1和PC2的得分信息很有用,这2个主成分包含更多的样本差异信息。得分图中越接近的样本越具有相似性。因此,得分图可用于解释样本间的差异性和相似性,可用于样本的分类。
本研究的主要目的是建立用于预测赤桉和细叶桉叶片相对含水量和水势的PLS校正模型。建模的方法有好几种,如神经网络法、偏最小二乘法(PLS)等,偏最小二乘法较其他方法具有更稳定更可靠的特点(Diniz et al., 2015)。本研究利用偏最小二乘法建立PLS校正模型时,采用不确定检验和完全交互式验证。不确定检验可以确定最优主因子数。在预测未知样本时,模型的决定系数(R2)和均方根误差(RMSE)用来判断模型的表现。
2 结果与分析 2.1 校正集和验证集样本的基本信息表 2为校正集和验证集叶片相对含水量(RWC)和水势(Ψw)的均值、变异系数(CV)和值域信息。校正集RWC和Ψw的均值与CV与验证集相应数值的差异都很小,但两者的值域都很宽。这说明中选样本具有丰富的代表性,基于这批样本可以建立一个期望的NIRS校正模型,用于预测赤桉和细叶桉叶片RWC和Ψw。
变异系数可以反映向量数据不同点的变异大小,从而分析各变量间的差异信息。作为具100个点的NIR光谱信息来说,分析光谱点的变异信息很有必要。图 1是所有样本原始近红外光谱的CV曲线。从图 1可看出,CV最显著的波动出现在1 880~ 1 980 nm区间,且其峰值只出现1次。这表明该区间的近红外光谱信息可能适于建立近红外光谱校正模型,但后面的分析表明其建模效果却不一定适宜。
图 2是原始近红外光谱信息经二阶导数转换后的CV曲线,其在全光谱区间显示多个变异峰值,这与原始近红外光谱CV曲线的形状大不相同。二阶导数处理可以显著突出近红外光谱的特征峰,降低基线和偏移等因素的影响,揭示样本中有机成分与近红外光谱间关系的更多信息。这也说明在本研究中应用全谱段的光谱信息建立叶片RWC和Ψw的PLS模型,没必要特意区分不同光谱区间,这与多数关于植物近红外光谱分析的研究结论相似(Abasolo et al., 2013)。
在PCA分析中,由于前2个主成分可以解释所有样本在全光谱区间超过90%以上的差异信息,所以仅展示PC1和PC2在近红外全谱段的分布趋势。图 3为PCA载荷(PC1和PC2) 及对应波长原始近红外光谱反射率。在全光谱区间,PC1和PC2在载荷曲线走势几乎一致。在1 860~1 960 nm区间内出现最大的波动,说明这批样本在该波谱区间存在最大的差异。PC1和PC2的最大波动范围与近红外原始光谱的最大波动区间存在重叠,也几乎一致,两者相互印证。
定量分析是近红外光谱技术应用的主要优势之一,其本质是基于校正样本的近红外光谱信息及其物质特征值,借助不同的化学计量方法建立用于同类未知样本物质特征值的预测模型。图 4, 5是赤桉和细叶桉叶RWC和Ψw的PLS回归模型结果。仅就校正集来说,叶片水势Ψw的近红外光谱模型的测量值与预测值间的决定系数R2为0.92,测量值与预测值间的校正均方根误差RMSEC为0.25(图 4)。叶片相对含水量RWC的R2为0.84,RMSEC为1.31(图 5)。根据决定系数最大,而校正均方根误差最小的原则,确定RWC和Ψw校正模型的建模主因子数分别是19个和20个。
研究所设计测量和采集信息的幼苗遗传基础相当广泛,且将每家系待测幼苗分为5个控水处理,在控水处理后连续18天测量和采集光谱信息,保证这些幼苗尽可能多地处于水分逆境条件,并以此增加样品来源的广泛性和代表性。因此,据此批样本建立的近红外光谱模型具有较好的预测效果,并有可能用于其他桉树的相应性状预测。
2.5 赤桉和细叶桉叶片RWC和Ψw的近红外光谱校正模型的检验对近红外光谱校正模型的检验是确保其稳定性和预测精度的前提,而对于所建模型在取样范围以外的应用更是非常重要,因为这涉及到对已有模型的检验和优化。图 6,7是用30个独立验证集样本对所建赤桉和细叶桉叶片RWC和Ψw的近红外光谱模型的检验结果。结果显示,用于叶片RWC预测的近红外光谱模型较之预测Ψw的效果为好,这可能是由于用于建模的校正集和用于模型预测效果检验的验证集样本组成性质存在差异,即校正集样本和验证集样本的均一性有差异。所有叶片RWC的近红外光谱预测值非常接近其测量值,偏差很小。但有些样本叶片Ψw的近红外光谱预测值与测量值间的差别则较大,偏差较大。这可能与控水后测量持续较长和采集信息时间长有关,比如在测量后期,那些浇水量少(30%和0%)的幼苗已处于严重的水分逆境,生理状态很差。
随植物叶片含水量下降,其近红外光谱反射率在整个波谱区都有增加现象(Jones et al., 2004)。水在近红外光谱区有强的吸收峰,所以处于水逆境的林木在近红外光谱区会有较低的水分吸收峰(Bei et al., 2011)。
3 讨论从研究结果来看,借助近红外光谱技术预测桉树苗期叶片相对含水量和水势的效果还是不错的。该方法能否用于成熟林或自然条件林木水分相关性状的研究,可能需要在研究方法上尝试改进,比如自然条件下样本的定义及选择标准等。李建龙等(2003)利用遥感光谱法,结合卫星数据与地面光谱信息建立遥感信息与土壤含水量之间的遥感光谱监测模型。通过地面实测土壤水分验证显示,0~20 cm土层含水量的监测精度达到90%以上,20~50 cm土层土壤含水量监测精度达到80%以上,不过,实测精度偏低一些。本研究也尝试对比样本遗传距离与其近红外光谱距离间的关系,希望为成熟林或自然林分相关性状的近红外光谱检测提供理论依据。
本研究中赤桉和细叶桉叶片近红外光谱反射率的最大波动出现在1 880~1 980 nm区间,这一波动区间与以往关于纯水近红外光谱特征峰区间的研究结果(Shenk et al., 2001)基本一致。有研究认为1 900~1 950 nm区间和1 400~1 440 nm区间内有很强的水分近红外光谱反射率或吸收带,而且通常该区间都被用于植物含水量分析(Büning-Pfaue, 2003; Workman et al., 2012)。然而,这却很难确定该特异区间与某种特定的化合物有关,因为即便是很小的近红外光谱区间也可能反映诸多而非单一的化合物信息(Foley et al., 1998)。这说明应该采用整个近红外光谱区间而不是一些特异区间进行物质的定性和定量分析,可能是因为植物组织中的成分更为复杂,而非某种或某几种简单的成分。
利用近红外光谱信息建立的PLS模型显示,基于校正集建立的赤桉和细叶桉叶片Ψw的PLS模型(R2=0.92) 较叶片RWC的PLS模型(R2=0.84) 好,但2种模型对验证集样本的预测结果却正好与其相反,可能是用于建立PLS模型的校正集样本组成和用来检验模型的验证集样本组成性质有差异(均一性),因为2个样本集是人为随机抽取的。因此,PLS模型的决定系数R2不是判断模型预测准确性的唯一标准,这是近红外光谱预测模型需要不断检验优化的原因之一。
PLS模型对验证集的预测效果显示,叶片相对含水量的预测值较水势的预测值更接近真实值,即叶片相对含水量PLS模型的预测偏差较小,而水势PLS模型的预测偏差较大。这可能是由于数据的采集过程太长,对于控水处理中浇水较少(30%和0%)的幼苗来说,其叶片生理状态发生较大变化,但就叶片RWC和Ψw来说,两者对水逆境响应方式与程度可能不同。总的来说,近红外光谱技术可为赤桉和细叶桉群体的叶片RWC和Ψw等类似水分相关性状的检测带来极大便利。
研究认为,在利用光谱技术测定植物水分状态时,其叶片通常是较好的研究对象(Cozzolino et al., 2013; Abasolo et al., 2013)。Eitel等(2006)研究表明,选择叶片进行光谱分析可消除大气噪音和背景对光谱的影响,可确保不同样本间的光谱差异只源自叶片特性。角质层或蜡质、栅栏组织和海绵组织都会影响叶片的特性,叶片表面及其内部的化学和结构特征也都会影响叶片对光谱的反射率和吸收度。
所选择样本差异的丰富程度决定了近红外光谱校正模型在预测未知样本时的稳定性和精确性,就近红外光谱技术在林木中的应用来说,可通过选择环境来源与遗传基础尽可能广泛的样本来实现这一目的。就遗传基础来说,由于桉树某些性状具有强遗传力,所以,即便是来自其整个生境的样本也有可能降低其变异丰富度(Stackpole et al., 2011)。因此,要建立稳定的近红外光谱模型用于林木性状预测,未来的一个研究方向应是在取样前评估目标性状的遗传力信息。
4 结论1) 从建立和优化桉树叶片相对含水量和水势近红外光谱预测模型的过程和结果来看,用全谱段近红外光谱信息会更可靠。
2) 在建立桉树叶片相对含水量和水势的近红外光谱模型之前需要对原始光谱信息进行合适的预处理。本研究采用二阶导数平滑处理,所建模型预测效果明显优于用原始光谱所建模型。
3) 桉树叶片相对含水量和水势近红外光谱模型对验证集样本的预测结果表明,近红外光谱技术可成功用于赤桉和细叶桉叶片的RWC和Ψw快速无损检测。近红外光谱技术的应用有助于推进桉树育种过程中对桉树干旱响应和抗旱性能评价的研究。
[] |
崔广. 2007. 基于近红外光谱分析的纺织品中羊毛含量检测技术研究. 镇江: 江苏大学硕士学位论文. ( Cui G. 2007. Detection of wool content in textile based on the near infrared spectroscopy technology. Zhenjiang:MS thesis of Jiangsu University. [in Chinese]) |
[] |
李建龙, 蒋平, 刘培君, 等. 2003. 利用遥感光谱法进行农田土壤水分遥感动态监测. 生态学报, 23(8): 1498–1504.
(Li J L, Jiang P, Liu P J, et al. 2003. The study on dynamic monitoring soil water contents using remote sensing optical method. Acta Ecologica Sinica, 23(8): 1498–1504. [in Chinese]) |
[] |
陆婉珍. 2007. 现代近红外光谱分析技术. 2版. 北京, 中国石化出版社.
(Lu W Z. 2007. Modern near infrared spectroscopy analytical technology. 2nd ed. Beijing, China Petrochemical Press. [in Chinese]) |
[] |
毛罕平, 高洪燕, 张晓东. 2011. 生菜叶片含水率光谱特征模型研究. 农业机械学报, 42(5): 166–170.
(Mao H P, Gao H Y, Zhang X D. 2011. Spectral characteristics model of lettuce leaves'water content. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Machinery, 42(5): 166–170. [in Chinese]) |
[] |
田庆久, 宫鹏, 赵春江, 等. 2000. 用光谱反射率诊断小麦水分状况的可行性分析. 科学通报, 45(24): 2645–2650.
(Tian Q J, Gong P, Zhao C J, et al. 2000. Feasible in monitoring water status in wheat by spectroscopy reflectance. Chinese Science Bulletin, 45(24): 2645–2650. DOI:10.3321/j.issn:0023-074X.2000.24.015[in Chinese]) |
[] |
严衍禄. 2005. 近红外光谱分析基础与应用. 北京, 中国轻工业出版社.
(Yan Y L. 2005. Near infrared spectroscopy foundations and applications. Beijing, China Light Industry Press. [in Chinese]) |
[] | Abasolo M, Lee D J, Raymond C, et al. 2013. Deviant near-infrared spectra identifies Corymbia hybrids. Forest Ecology & Management, 304: 121–131. |
[] | Barbour E L. 2004. Eucalypt hybrids in south-west Western Australia. Kingston:Rural Industries Research and Development Corporation. |
[] | Bei R D, Cozzolino D, Sullivan W, et al. 2011. Non-destructive measurement of grapevine water potential using near infrared spectroscopy. Australian Journal of Grape & Wine Research, 17(1): 62–71. |
[] | Büning-Pfaue H. 2003. Analysis of water in food by near infrared spectroscopy. Food Chemistry, 82(1): 107–115. DOI:10.1016/S0308-8146(02)00583-6 |
[] | Conzen J P. 2003. Multivariate calibration:a practical guide for developing methods in the quantitative analytical chemistry. Ettlingen:Bruker Optic GmbH. |
[] | Cozzolino D. 2009. Near infrared spectroscopy in natural products analysis. Planta Medica, 75(7): 746–757. DOI:10.1055/s-0028-1112220 |
[] | Cozzolino D, Roumeliotis S, Eglinton J. 2013. Monitoring water uptake in whole barley (Hordeum vulgare L.) grain during steeping using near infrared reflectance spectroscopy. Journal of Food Engineering, 114(4): 545–549. |
[] | Diniz P H G D, Pistonesi M F, Araújo M C U. 2015. Using ISPA-PLS and NIR spectroscopy for determination of total polyphenols and moisture in commercial tea samples. Analytical Methods, 7(8): 3379–3384. DOI:10.1039/C4AY03099K |
[] | Eitel J U H, Gessler P E, Smith A M S, et al. 2006. Suitability of existing and novel spectral indices to remotely detect water stress in Populus spp. Forest Ecology & Management, 229(1): 170–182. |
[] | Foley W J, Mcilwee A, Lawler I, et al. 1998. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy:a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia, 116(3): 293–305. DOI:10.1007/s004420050591 |
[] | Humphreys J, O'Reilly-Wapstra J, Harbard L, et al. 2008. Discrimination between seedlings of Eucalyptus globulus, E. nitens and their F1 hybrid using near-infrared reflectance spectroscopy and foliar oil content. Silvae Genetica, 57(4/5): 262–269. |
[] | Jones C L, Weckler P R, Maness N O, et al. 2004. Estimating water stress in plants using hyperspectral sensing//Proceedings for the ASAE/CSAE Annual International Meeting, 2-11. |
[] | Little K M, Van Staden J, Clarke G P Y. 2003. The relationship between vegetation management and the wood and pulping properties of a Eucalyptus hybrid clone. Annals of Forest Science, 60(7): 673–680. DOI:10.1051/forest:2003061 |
[] | Luo J Z, Arnold R J, Lu W H, et al. 2014. Genetic variation in Eucalyptus camaldulensis and E. tereticornis for early growth and susceptibility to the gall wasp Leptocybe invasa in China. Euphytica, 196(3): 397–411. |
[] | Norris K H, Butler W L. 1961. Techniques for obtaining absorption spectra on intact biological samples. IRE Transactions on Bio-Medical Electronics, 8(3): 153–157. DOI:10.1109/TBMEL.1961.4322890 |
[] | Norris K H. 1964. Design and development of a new moisture meter. Agricultural Engineering, 45(7): 370–372. |
[] | Shenk J, Workman J J, Westerhus M O. 2001. Application of NIR spectroscopy to agricultural products//Burns D, Ciurczak E W. Handbook of near-infrared analysis. New York:Marcel Dekker, 419-474. |
[] | Stackpole D J, Vaillancourt R E, Alves A, et al. 2011. Genetic variation in the chemical components of Eucalyptus globulus wood. G3-Genes Genomes Genetics, 1(2): 151–159. |
[] | Warburton P, Brawner J, Meder R. 2014. Handheld near infrared spectroscopy for the prediction of leaf physiological status in tree seedlings. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 22(6): 433–438. DOI:10.1255/jnirs.1137 |
[] | White D A, Battaglia M, Ren S, et al. 2016. Water use and water productivity of Eucalyptus plantations in South-East Asia. Canberra:Australian Centre for International Agricultural Research. |
[] | Workman J R, Weyer L. 2012. Practical guide and spectral atlas for interpretive near-infrared spectroscopy. Boca Raton, CRC Press. |