竹笋夜蛾属鳞翅目 (Lepidoptera) 夜蛾科 (Noctuidae)，是竹子笋期的主要害虫之一。竹笋夜蛾钻蛀取食竹笋，活动场所隐蔽，且幼虫期较长，竹笋被危害严重时，被害率高达95%以上。被害竹笋能生长成竹者，亦为断头、折梢、虫孔累累、材质硬脆，竹材利用率低 (徐天森，1962；徐天森等，2004)。被害竹林大量退笋，使竹林日趋退化，影响笋用林产业的发展 (胡正坚等，1992；梁光红等；2003；Yoshimatsu et al., 2005；舒金平等，2012；叶碧欢等，2014)。在我国，研究报道的竹笋夜蛾主要有基夜蛾 (Kumasia kumaso)、竹笋禾夜蛾 (Oligia vulgaris)、笋秀夜蛾 (Apamea apameoides) 和萨夜蛾 (Sapporia repetita)(徐天森等，2004；舒金平等，2012)。这4种竹笋夜蛾均钻蛀取食竹笋，属寡食性昆虫，生活史极其相似，生态位严重重叠，在时间、空间和营养等资源利用上存在激烈竞争 (罗梅浩等，2002；黄琼瑶等，2009)，且在同一地区均有分布 (黄焕华等，2003)。此外，4种竹笋夜蛾成虫体色差异小，大小接近，实际生产生活中难以区分，人们常将其混淆，统称为竹笋夜蛾，导致研究和生产防治中对象模糊，目标不清。

传统昆虫分类学对这4种竹笋夜蛾的分类一直存在争议，拉丁学名一再变更，属的归属难以确定 (徐天森等，2004)。例如：基夜蛾，曾用名淡竹笋夜蛾，其拉丁学名曾为Apamea(秀夜蛾属)kumaso(Sugi)(朱弘复，1964；Inoue et al, 1982；陈一心，1985；1992)；笋秀夜蛾，曾用名笋秀禾夜蛾，其拉丁学名曾为Oligia(禾夜蛾属)apameoidis(Draudt)(陈一心，1985)；竹笋禾夜蛾，曾用名竹笋夜蛾，其拉丁学名曾为Polydesma(纷夜蛾属)vulgaris(Butler)、Oligia vulgaris(Hampson)、Bambusiphila vulgaris(Sugi)(朱弘复，1964；Inoue et al., 1982；陈一心，1985; 1992)；萨夜蛾，曾用名笋连秀夜蛾，其拉丁学名曾为Apamea(秀夜蛾属)repetita(Butler)、Trachea(陌夜蛾属)repetita(Hampson)、Apamea(秀夜蛾属)repetita(Chen)、Sapporia(萨夜蛾属)repetita(Sugi)(Inoue et al., 1982；陈一心，1985；1992)。在研究中更显混乱，竹笋夜蛾的学名难以统一。

随着分子生物学的快速发展，基于DNA所携带的遗传信息进行生物分类已逐渐成为研究热点。其中，昆虫线粒体基因组中细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(mtDNA COⅠ) 基因序列因既具有高度保守序列，又具有足够变异位点的特性，被广泛用于昆虫分类、种群和进化关系研究 (Lunt et al., 1996)。2002年，德国进化生物学家Tautz等首先提出将DNA作为生物分类研究平台的观点，即以DNA序列为基础建立物种鉴定体系 (Tautz et al., 2003)。2003年，加拿大学者Hebert等提出建立DNA条形码鉴定系统，即以线粒体细胞色素氧化酶亚基I (COⅠ) 基因5′端648 bp的序列多样性为基础进行物种鉴定。Hebert等 (2003)还发现这段序列在鳞翅目200个近缘种中鉴定的成功率为100%。本研究针对4种竹笋夜蛾近缘种生物学和生态学特性相似、分类地位上存在争议的问题，克隆4种竹笋夜蛾线粒体COⅠ基因5′端709 bp片段系列，通过构建系统进化树，分析其亲缘关系，为其进一步明确其分类地位提供分子理论基础。

1 材料与方法 1.1 供试虫源

2013年4月—2014年4月，在浙江省安吉市竹博园和富阳竹子产区采集4种供试竹笋夜蛾幼虫各200头，室内饲养至成虫羽化，拍照，搜集活体成虫浸泡于无水乙醇中，-20 ℃保存备用。

1.2 试验材料

TAKALA MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit VER.5.0试剂盒，TaKaRa MiniBest DNA Fragment Purification Kit Ver 3.0试剂盒，PMD-19-T载体，大肠杆菌 (Escherichia coli)感受态细胞，其中扩增4种竹笋夜蛾的线粒体COⅠ基因所用引物来自通用引物 (Folmer et al., 1994):

L1490-5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATT G-3’;

H2198-5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAA AA T-3’。

引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

1.3 试验方法 1.3.1 4种竹笋夜蛾总基因组DNA的提取

分别选取4种竹笋夜蛾成虫样本，按照TAKALA MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit VER.5.0试剂盒操作步骤提取4种竹笋夜蛾总基因组DNA。产物经1%琼脂糖凝胶进行检测，使用紫外成像系统对电泳条带进行观察和拍照。

1.3.2 4种竹笋夜蛾线粒体COⅠ基因的扩增

以提取到的竹笋夜蛾总基因组DNA为模板，引物为上述通用引物，按照如下反应体系和反应条件对4种竹笋夜蛾线粒体COⅠ基因进行扩增。反应体系为：25 μL，其中上下游引物各1 μL，10×扩增缓冲液2.5 μL，4种dNTP混合物2 μL，DNA模板5 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，ddH₂O 13.2 μL。反应条件为：预变性94 ℃ 2 min，变性94 ℃1 min，退火50 ℃1 min，延伸72 ℃1 min，进行35个循环。取3 μL PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用紫外成像系统对电泳条带进行观察和拍照。

1.3.3 4种竹笋夜蛾线粒体COⅠ基因PCR产物纯化、克隆和测序

产物经电泳后，按照TaKaRa MiniBest DNA Fragment Purification Kit Ver 3.0试剂盒操作步骤对4种竹笋夜蛾线粒体COⅠ基因PCR产物进行纯化，纯化的PCR产物与PMD-19-T载体进行连接反应，16 ℃过夜。将连接反应的产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，待菌落长出来后，挑选单个阳性菌落进行菌落PCR验证，鉴定重组质粒。测序公司为生工生物工程 (上海) 测序部，要求双向测通并进行拼接。

1.3.4 数据处理

利用MEGA 5.0软件分析4种竹笋夜蛾的碱基组成、结构特点、碱基替换模式和遗传距离等特性。登录NCBI对4种竹笋夜蛾线粒体COⅠ基因进行同源性搜索，选取其他21条 (15属21种) 线粒体COⅠ基因 (表 1) 的氨基酸序列，分别采用邻接法 (NJ)、最大简约法 (ML) 和最大似然法 (MP) 构建系统发育树。分析其系统进化关系，其中NJ法选用的模型是P-Distance。所有方法均运用Bootstrap检验重复，抽样1 000次，其余参数为默认。

2 结果与分析 2.1 4种竹笋夜蛾成虫形态特征

由图 1可知，4种竹笋夜蛾成虫形态基本接近，主要区别在于其体色和斑纹。4种竹笋夜蛾成虫形态相关指标见表 2。

2.2 4种竹笋夜蛾COⅠ基因目的片段序列的克隆与鉴定

对4种竹笋夜蛾COⅠ基因片段克隆产物进行电泳检测，每个扩增产物均出现1条700 bp左右的特异性条带 (图 2)，与试验目的相符。样品经测序公司测序拼接后，获得4种竹笋夜蛾mtDNA COⅠ基因片段碱基序列，每个样品重复测序3次，结果相同，长度均为709 bp (登录号分别为基夜蛾KR780071、萨夜蛾KR780072、竹笋禾夜蛾KR780073、笋秀夜蛾KR780074)。将该片段序列在NCBI上进行同源性搜索，结果同比对的夜蛾科中Noctua atlantic(AY600452.1) 等昆虫的线粒体COⅠ基因序列相似度极高 (94%以上)。

2.3 4种竹笋夜蛾及其比对昆虫mtDNA COⅠ基因片段的序列特征

4种竹笋夜蛾mtDNA COⅠ基因片段碱基序列同源性达98.2%。在4种竹笋夜蛾样本mtDNA COⅠ基因709 bp序列片段中，多态性位点为30个，仅占整个序列的4.2%，与其他物种同源基因序列进行碱基比对发现，获得的4条样本基因片段均为编码区序列，并且没有碱基插入和缺失。氨基酸序列比对发现，4种竹笋夜蛾的mtDNA COⅠ基因片段均从第3个碱基开始翻译，无移码现象，编码235个氨基酸，同源性高达99.89%，其中仅萨夜蛾第162个氨基酸与其他3种夜蛾不同，其余3种夜蛾氨基酸片段完全相同。

2.4 4种竹笋夜蛾mtDNA COⅠ基因片段的遗传变异分析

使用MEG5.0软件计算4种竹笋夜蛾及其比对昆虫mtDNA COⅠ基因序列的遗传距离，计算模型为p-Distance。结果表明，笋秀夜蛾与基夜蛾间的遗传距离为0.014，与竹笋禾夜蛾间的遗传距离为0.006，与萨夜蛾间的遗传距离为0.069；基夜蛾与竹笋禾夜蛾间的遗传距离为0.008，与萨夜蛾间的遗传距离为0.067；竹笋禾夜蛾与萨夜蛾间的遗传距离为0.063(表 3)。4种竹笋夜蛾中，除了萨夜蛾与其他3种夜蛾的种间遗传距离较大，大于所有比对昆虫的平均种间距离外，其他3种种间遗传距离均较小，与比对昆虫的种内距离相近。

4种竹笋夜蛾及其比对昆虫的碱基替换模式为：Ts >Tv，R值为12.6(表 4)。TC间发生碱基转换次数最多，达16次，占替换总数 (19) 的84.2%；TA发生碱基颠换次数最多，达13次，占颠换总数 (16) 的81.25%，CA和TG间的颠换次数较少，分别为2次和1次，CG间没有替换发生。

在4种竹笋夜蛾样本mtDNA COⅠ基因709 bp序列片段中，检测到保守性位点 (conserved sites)555个，多态性位点 (variable sites)154个，占总检测位点的21.72%；简约信息位点 (parsimony-informative sites)118个，占16.64%；单突变位点 (singleton site)36个，占5.07%。

2.5 4种竹笋夜蛾基于mtDNA COⅠ基因片段的系统进化分析

用4种竹笋夜蛾及其比对昆虫的mtDNA COⅠ氨基酸序列在Mega5.0中构建进化树, 结果如图 3、4、5所示，3种进化树显示结果大致相同。与比对序列相比，4种竹笋夜蛾分属同一支，分支支持率达100%，亲缘关系最近，其中萨夜蛾与其他3种夜蛾分属2个分支，分支支持率为70%左右。MP法进化树中，基夜蛾又与竹笋禾夜蛾和笋秀夜蛾分为2支，分支支持率为30%。3种进化树均显示，4种竹笋夜蛾与禾夜蛾属、秀夜蛾属的昆虫遗传距离较远。

3 讨论

Foster等 (1997)认为，线粒体基因密码子位点在物种进化过程中由于受选择压力影响，会表现出不同程度的碱基突变。在不同的密码子位点上，4种竹笋夜蛾及其比对昆虫mtDNA COⅠ基因片段碱基含量变化规律一致。但密码子第2位点的A+T含量显著高于第1、3位点，说明4种竹笋夜蛾密码子第2位点上的碱基突变由纯化选择导致 (陈星等，2012)。此外，密码子第2位点的碱基突变大多属于同义突变，容易在进化过程中通过自然选择固定下来 (周继亮等，2001)。本研究结果与栎黄掌舟蛾 (Phalera assimilis) mtDNA COⅠ基因密码子位点变异特点不同，其密码子第3位点的A+T含量显著高于第1、2位点 (杨瑞生等，2013)，可能是由于夜蛾种类不同导致。在碱基替换模式上，本研究中4种竹笋夜蛾的mtDNA COⅠ基因均为碱基转换高于颠换，其R值为12.6，与鳞翅目蛾类昆虫的碱基替换模式一致 (杨瑞生等，2008；2011；2013)。生物进化可以说是生物体在基因水平上碱基突变不断累积的结果，一旦同种生物不同个体间的碱基突变累积到一定程度 (量变)，就会产生种的分化 (质变)。Hebert (2003)等对动物界11门13 320种的COⅠ基因序列进行比较研究发现，超过98%的物种间的遗传距离大于0.002，而种内遗传距离多小于0.001，很少超过0.002，而同属种之间的mtDNA COⅠ基因平均距离为0.011 3，除刺细胞动物门的物种外，COⅠ基因的序列多样性足以区分所有动物中的近缘种。本研究结果表明，4种竹笋夜蛾及其比对昆虫种间遗传距离为0.002~0.093，符合Hebert等 (2003)的研究结果。

基于COⅠ基因建立的系统发育树显示，4种夜蛾亲缘关系非常接近，而与秀夜蛾属和禾夜蛾属其他昆虫亲缘关系较远，因未能检索到基夜蛾属和萨夜蛾属其他昆虫COⅠ基因，故无法比较其亲缘关系。分类学上对4种竹笋夜蛾的归属研究一直存在争议，本研究或可提供部分参考。本研究中笋秀夜蛾与基夜蛾、竹笋禾夜蛾、萨夜蛾的遗传距离分别为0.014、0.006、0.069，所建进化树也表明笋秀夜蛾与竹笋禾夜蛾亲缘关系较近，其次为基夜蛾，与萨夜蛾亲缘关系较远。综上所述，本研究建议可将基夜蛾、竹笋禾夜蛾和笋秀夜蛾归为同一个属，萨夜蛾由于其在浙江分布较少，主要分布于广东茶秆竹上，与这3种竹笋夜蛾亲缘关系相对较远，其分类地位可进一步进行确认。此外，4种竹笋夜蛾成虫形态差异较小，生态习性相似，分布区域基本一致，分子进化树初步确定其亲缘关系接近，可作为理想的同域物种进化研究素材。

昆虫线粒体DNA相对于核基因来说，具有进化速率快、物种间序列保守等特点，因而成为筛选条形码标准基因的首选 (Hebert et al., 2003)。研究发现，昆虫线粒体DNA含有13个蛋白质编码基因 (Boore，1999；Taanman，1999)，其中因为mtDNA COⅠ基因的序列保守性强，在种间鉴定上具有较高的可靠性，且易于扩增，被绝大多数研究者选为昆虫的DNA条形码基因。利用DNA条形码鉴定的研究中，63.7%的研究样本来自昆虫，其中又以鳞翅目的研究居多 (李青青等，2010)，其次为双翅目 (Nelson et al., 2007)、鞘翅目 (Monaghan et al., 2005) 等。本研究克隆了4种竹笋夜蛾mtDNA COⅠ基因片段，可为竹笋夜蛾DNA条形码鉴定提供理论基础。线粒体基因上保守基因众多，多基因片段联合的DNA条形码鉴定系统已经成为一个探索的趋势 (肖金花等，2004)，进一步验证DNA条形码技术在物种鉴定和物种亲缘关系研究中的适用性。此外，由于4种竹笋夜蛾亲缘关系较近，今后可通过采集不同地理种群，克隆其mtDNA COⅠ基因及其他保守序列 (COⅡ、16sRNA等)，研究其进化过程，进一步揭示4种竹笋夜蛾的进化关系。

4 结论

本研究利用4种竹笋夜蛾mtDNA COⅠ基因片段构建了进化树，结果表明4种竹笋夜蛾亲缘关系接近，可为4种竹笋夜蛾分类地位的确定提供初步分子基础，同时可为竹笋夜蛾DNA条形码鉴定提供理论基础。鉴于本研究克隆的只是4种竹笋夜蛾mtDNA COⅠ基因的5′端部分序列，今后可通过设计特异性引物，对竹笋夜蛾mtDNA COⅠ序列全长进行扩增，以提高mtDNA COⅠ基因DNA条形码的可靠性。4种竹笋夜蛾形态差异较小，生态习性相似，分布区域基本一致，可作为理想的同域物种进化研究素材。