除草是营林生产过程的重要环节，美国孟山都公司研发的林用除草剂——草甘膦具有杀草广谱、内吸传导性强、适用性广、效果好、经济效益显著等特点，被广泛用于林业生产并在各个环节发挥着重要作用 (贺利中等, 2010)。资料表明，国外人工林抚育化学除草技术应用和研究较早，且发展较快，拥有较高的水平和完善的化学除草技术，业已取得明显的生态、经济和社会效益。瑞典曾大量使用草甘膦消灭欧洲云杉 (Picea abies) 幼林地杂灌草，除草效果明显，印尼、菲律宾等以经济林为主的国家在橡胶 (Hevea brasiliensis)、咖啡 (Coffea arabica) 等种植园喷施草甘膦用于清除热带丛生杂草 (陈国海等, 1993)。草甘膦在我国林业中的应用也取得了明显成效，如广东省1985—1995年10年间林业、果园使用草甘膦除草面积由300万hm²上升至666.7万hm²，安徽省泾县从2002年起使用草甘膦除草开设与维护森林防火线，有效降低了林火发生率 (林静雯等, 2015)。在我国南方，杉木 (Cunninghamia lanceolata) 是重要速生用材树种之一，在我国林业生产中占据重要地位。近年来，由于炼山清理林地杂灌草易引起雾霾、水土流失、地力衰退等系列生态问题被许多地方禁用，草甘膦开始广泛用于采伐迹地清理和幼苗抚育杂草的清除，成为杉木人工林生产中使用量最大的除草剂之一 (林德喜等, 1998; 应金花, 2001)。草甘膦清除杂草的机制为:通过喷施在植物的绿色部分，抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸酯合成酶的活性，阻碍莽草酸-3-磷酸与磷酸烯醇丙酮酸生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸酯，使植物生存必需的芳香氨基酸合成途径受阻，同时引起莽草酸及其衍生物在植物体内大量积累，最终导致植株黄化干枯直至死亡。虽然草甘膦的使用大大提高了除草效率，降低了生产成本，促进了林业生产，但草甘磷是具有毒性、用量大、影响范围广的有机污染物，在保护林木免受杂草危害的同时也污染土壤环境，制约了杉木人工林的可持续发展。

国内外关于草甘膦的研究表明，按正常使用量1 kg·hm^-2计算，表层13 cm土壤中草甘膦残余量可达0.45~2 mg·kg^-1；在草甘膦用量比较大的地区，其残存量高达10~20 mg·kg^-1(Zhou et al., 2013)。虽然草甘膦对控制杂草起到关键作用，但在土壤中残留的草甘膦对后茬作物生长有负面作用，能够造成植物生理紊乱，引起植物养分吸收失衡，最终降低作物生长量和产量。如草甘膦对抗草甘膦大豆 (Glycine max) 幼苗有显著伤害，可增加抗草甘膦的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性，以及丙二醛含量和相对电导率 (原向阳等, 2010)。喷施草甘膦后，向日葵 (Helianthus annuus) 叶片Fe、Mn浓度出现显著降低的症状 (Eker et al., 2006)。以往研究均是针对农作物，而有关土壤残存对林木影响的研究目前鲜有报道。由于林地杂灌众多，林业使用草甘膦要比农业使用的剂量更大且更频繁，林地表层土壤残余量可能要更高，因此草甘膦在人工林的土壤残留量及对苗木生长危害更应引起关注。本研究基于草甘膦残留问题，通过盆栽试验，探究杉木对草甘膦的形态学和生理学响应，分析土壤残存草甘膦对杉木养分吸收的影响机制，为林业生产中草甘膦的合理施用提供理论依据，为杉木人工林的可持续经营提供基础资料。

1 材料与方法 1.1 供试杉木苗

试验所用杉木苗为培育5个月的实生苗，来源于福建漳平五一国有林场杉木半同胞家系。供试苗木于沙床上缓苗1个月，参试苗木为长势均一、根系完整的无病害苗木。

1.2 试验设计

试验在福建农林大学林学院玻璃温室采用沙培方式进行。将洗净河沙过2 mm筛后等量装入口径16 cm、高20 cm的种植盆内，苗木用清水洗净根部后移栽至种植盆，每盆1株，浇足水分，驯化培养1周。参考草甘膦在土壤中的残存量，试验设6个草甘膦浓度 (0、2、5、10、20、50 mg·kg^-1)，每种处理8个重复，共48株。驯化结束后将不同浓度草甘膦用等体积的蒸馏水溶解，均匀浇入对应处理的沙子中，浇入时避免处理液接触植株。为保证苗木对水分和养分的需求，每7天浇30 mL 1/2 Hoagland营养液，营养液组成为：0.136 g·L^-1KH₂PO₄、0.506 g·L^-1 KNO₃、1.181 g·L^-1Ca (NO₃)₂·4H₂O、0.493 g·L^-1MgSO₄·7H₂O、37.250 g·L^-1Na₂EDTA、0.031 g·L^-1FeSO₄·7H₂O、Arnon微量元素 (2.863 mg·L^-1 H₃BO₃、0.075 mg·L^-1 CuSO₄·5H₂O、0.230 mg·L^-1 ZnSO₄·7H₂O、1.801 mg·L^-1 MnCl₂·4H₂O、0.094 mg·L^-1 H₂MoO₄·4H₂O)，调节营养液pH为5.5，并适时补充蒸馏水。胁迫从2015年9月20日始至2015年10月30日止，为期40天 (Zou et al., 2014)。

胁迫结束后各处理选取苗木生长良好的4个重复，剪取苗木相同部位叶片，测定相对电导率、丙二醛 (MDA)、脯氨酸 (Pro)、可溶性蛋白、莽草酸和叶绿素含量，以及超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化物酶 (POD) 活性，并收获苗木测定根系和叶片P、Ca、Mg、Fe、Zn、Cu、Mn等元素含量。

1.3 生理学指标测定

相对电导率采用上海雷磁DDS-307电导仪测定；MDA含量采用硫代巴比妥酸法 (TBA) 测定；Pro含量采用酸性茚三酮法测定；可溶性蛋白含量参考马斯亮兰G-250染色法测定；莽草酸含量参考娄远来等 (2005)的方法测定；叶绿素含量采用等体积丙酮-无水乙醇提取分光光度法测定；SOD活性采用氮蓝四唑 (NBT) 光化还原法测定；POD活性采用愈创木酚法 (Li et al., 2012) 测定。

1.4 杉木养分含量测定

将杉木幼苗根和叶分别经105 ℃杀青后用80 ℃烘干至恒质量，采用HNO₃-HClO₄消煮，用钼锑抗比色法测定P含量 (汪攀等, 2015)，采用原子吸收分光光度法测定Ca、Mg、Fe、Zn、Cu、Mn含量 (Wu et al., 2011)。

1.5 分析方法

采用Microsoft Excel 2003进行数据处理，SPSS 18.0软件进行单因素方差分析 (one-way ANOVA) 和多重比较，LSD法对处理间数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析 2.1 草甘膦对杉木幼苗生长的影响

从图 1可看出，草甘膦处理10天后，大于20 mg·kg^-1草甘膦浓度处理的杉木幼苗顶部新叶均出现明显发黄的现象，这可能是草甘膦抑制了杉木根系吸收养分而引起的缺素症。40天后，低浓度草甘膦处理的杉木幼苗长势较好，一级分枝多且根系发达，而高浓度草甘膦处理的杉木幼苗植株矮小、主根缩短、侧根减少；50 mg·kg^-1草甘膦处理的杉木幼苗甚至出现叶片褐化萎蔫、根部腐烂的现象 (图 2)。

草甘膦处理40天后杉木幼苗的生长情况如表 1所示。可以看出，0~10 mg·kg^-1草甘膦处理的杉木幼苗死亡率较低，20 mg·kg^-1处理死亡率达50%，50 mg·kg处理杉木幼苗全部死亡。此外，2 mg·kg^-1和5 mg·kg^-1草甘膦处理的杉木幼苗生物量增量极显著高于对照杉木苗 (P < 0.01)，而10 mg·kg^-1和20 mg·kg^-1草甘膦处理的杉木幼苗生物量增量则显著低于对照 (P < 0.05)，这说明低浓度草甘膦对杉木幼苗生长具有一定促进作用，而高浓度草甘膦则显著抑制幼苗生长。

2.2 草甘膦对杉木幼苗叶片细胞膜系统和叶绿素含量的影响

从图 3可看出，随着草甘膦浓度升高，杉木幼苗叶片相对电导率和MDA含量均呈上升趋势。草甘膦浓度在2~5 mg·kg^-1时，叶片相对电导率与对照之间差异不显著 (P>0.05)，当草甘膦浓度大于5 mg·kg^-1时，叶片相对电导率极显著高于对照 (P < 0.01)，而幼苗叶片MDA含量除低浓度草甘膦 (2 mg·kg^-1和5 mg·kg^-1) 处理外均显著高于对照 (P < 0.05)，这说明高浓度草甘膦会导致杉木幼苗叶片细胞膜通透性增加，同时增加细胞膜脂过氧化程度，使杉木幼苗的细胞膜系统受到损伤。

由表 2可知，随着草甘膦浓度增大，杉木幼苗叶片叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量先增后降，以5 mg·kg^-1处理为最大，且均显著高于对照 (P < 0.05)。叶绿素a/b处理间差异不显著 (P>0.05)。5 mg·kg^-1草甘膦处理叶片叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量较对照分别提高11.9%、26.9%和16.5%，叶绿素a/b较对照降低11.9%。

2.3 草甘膦对杉木幼苗叶片抗氧化酶活性、叶片渗透调节物质和莽草酸含量的影响

从图 4可看出，随着草甘膦浓度增加，杉木幼苗SOD活性先降后升，POD活性呈上升趋势。高浓度草甘膦 (10 mg·kg^-1和20 mg·kg^-1) 处理杉木幼苗均保持较高的SOD活性和POD活性，在20 mg·kg^-1草甘膦处理时达到最大，2种酶活性分别较对照提高50.0%和66.2%；而低浓度草甘膦 (2 mg·kg^-1和5 mg·kg^-1) 处理与对照差异不显著 (P>0.05)，说明杉木幼苗体内的2种抗氧化酶对高浓度草甘膦反应敏感。

图 5可看出，随着草甘膦浓度增加，杉木幼苗叶片脯氨酸含量大体呈上升趋势，而可溶性蛋白呈下降趋势。其中，20 mg·kg^-1草甘膦浓度处理杉木幼苗叶片脯氨酸含量最大，约为对照的3倍，当草甘膦浓度在2~10 mg·kg^-1时幼苗叶片脯氨酸含量均略低于对照，但二者之间不存在显著差异 (P>0.05)，说明低浓度草甘膦对杉木幼苗叶片脯氨酸积累的影响不明显。幼苗叶片可溶性蛋白以草甘膦浓度20 mg·kg^-1处理降幅最大，比对照叶片减少37.3%。因此，草甘膦浓度过高会诱导脯氨酸合成和积累，同时阻碍细胞内可溶性蛋白的合成。

从图 6可看出，草甘膦浓度较低 (2 mg· kg^-1和5 mg·kg^-1) 时，杉木幼苗叶片莽草酸含量略低于对照；草甘膦浓度较高时，莽草酸含量虽有所增加，但各处理之间差异不显著 (P>0.05)。表明试验浓度范围内，杉木幼苗叶片莽草酸含量受草甘膦影响较小，可能是由于莽草酸合成是在植物叶绿体中进行的，而草甘膦作为大分子结构化合物被杉木根系吸收后，大量积累在根尖细胞，运输到地上部分的较少，因此对叶片细胞叶绿体结构和功能的破坏较小。

2.4 草甘膦对杉木幼苗养分吸收的影响

图 7所示为不同浓度草甘膦处理下微量元素Cu、Mn、Zn、Fe和大量元素Ca、Mg在杉木幼苗根系和叶片中的积累量。可以看出，随着草甘膦浓度增加，杉木幼苗根系Cu、Mg和Ca含量均呈上升趋势，且20 mg·kg^-1处理与对照之间差异极显著 (P < 0.01)，说明草甘膦可有效提高杉木幼苗根系对Cu、Mg、Ca元素的吸收。相反，根系Mn和Fe含量则有所下降，Zn含量先升后降，但各处理之间差异不显著 (P>0.05)。杉木幼苗叶片仅Cu含量随着草甘膦浓度升高而呈显著上升趋势，Mn含量呈先上升后下降的趋势。Zn含量与Mn含量的变化趋势相反，当草甘膦浓度为5 mg·kg^-1时Mn含量显著高于对照 (P < 0.05)，Zn含量则显著低于对照 (P < 0.05)。Fe、Mg、Ca含量在不同浓度草甘膦处理时基本无明显变化。

值得注意的是，杉木幼苗根系Cu、Zn、Fe、Mg含量在不同浓度草甘膦处理时均大于叶片，而幼苗叶片Mn和Ca含量大于根系。然而当草甘膦浓度上升至10 mg·kg^-1时其根系Ca含量超过叶片，这可能是由于草甘膦浓度升高使Ca元素在植物体中的传导途径受阻，根系对Ca元素的吸收速率大于其传导速率。

草甘膦还影响杉木幼苗根系和叶片P含量，即影响杉木对P元素的吸收和运输。由图 8可知，随着草甘膦浓度增加，根系P含量有所减少，但处理间差异不显著 (P>0.05)；叶片P含量呈上升趋势，且不同浓度草甘膦处理叶片P含量均高于对照。

3 讨论

林业生产中不合理施用草甘膦清除杂灌草会引发林地土壤残留问题，加之草甘膦半衰期较长，可达数十天甚至上百天 (Zhou et al., 2012; 林静雯等, 2015)，在土壤环境中长期积累可能会对营林生产过程中苗木的生长发育产生影响。本研究发现，高浓度草甘膦显著抑制杉木幼苗生长，当超过某一浓度范围甚至引起苗木叶片发黄、根部死亡；而低浓度草甘膦处理时杉木生物量增量显著高于对照，这种“低促高抑”现象可能是由于低浓度草甘膦阻碍植物莽草酸代谢途径，抑制木质素等细胞壁物质合成，增大植物细胞壁的延展性 (Duke et al., 2006)，也有研究认为，活性氧分子是实现植物细胞伸展的必要因子 (Rodriguez et al., 2002)，因此低浓度草甘膦诱导下杉木体内产生的活性氧可能促进细胞伸展，但草甘膦浓度增加又使杉木体内活性氧过量积累进而造成细胞损伤，抑制杉木生长 (Bernards et al., 2009)。

MDA是细胞膜脂质过氧化产物之一，同时又可与蛋白质的游离氨基作用，引起蛋白质分子内和分子间交联，导致细胞损伤，相对电导率是反映植物细胞膜透性的一个重要指标，这2个指标对生物体过氧化强度和膜系统受损程度具有重要指示作用 (Li et al., 2012)。本研究中，草甘膦浓度较高时幼苗叶片细胞膜通透性显著提高，且细胞内MDA含量大量积累，可见高浓度草甘膦会对幼苗叶片细胞造成氧化损伤，导致膜结构破坏、膜透性增加和细胞质外渗。江海澜等 (2011)研究也表明，高剂量草甘膦处理使龙葵 (Solanum nigrum) 幼苗MDA含量显著增加。叶绿素是植物光合作用的主要色素，其含量反映植物的光合速率水平，是植物生长的重要因素之一。本研究发现，杉木幼苗叶片叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素总量均随着草甘膦浓度增加呈先升后降趋势，与之类似的是，Cedergreen等 (2010)也发现低剂量草甘膦在促进大麦 (Hordeum vulgare) 生长的同时刺激了其光合能力的提高。然而舒骏等 (2015)研究发现，喷洒草甘膦后，五节芒 (Miscanthus floridulus) 叶绿素a、总叶绿素和叶绿素a/b含量显著降低，分析认为是叶绿体内超氧化物自由基O₂^-·过量积累造成的，这种结果差异可能与试验材料和施药方法不同有关。

植物在逆境条件下往往能够大量产生O₂^·、OH^·、NO、RO^·、ROO^·、H₂O₂、ROOH等活性氧，使蛋白质和生物大分子变性及细胞膜脂过氧化加剧。而抗氧化酶系统作为生物体内活性氧的清道夫，对环境胁迫的反应相当敏感。研究表明，在低浓度污染物胁迫时，抗氧化系统产生适应性诱导反应以清除机体内多余的活性氧，以避免膜脂质过氧化造成细胞氧化损伤；当活性氧的产生超出抗氧化酶系统的清除能力时，抗氧化酶活性就会受到抑制 (Michalková et al., 2009)。SOD和POD是生物体中2种典型的抗氧化酶，其活性变化能够反映生物体对污染物的氧化应激反应从而作为指示污染物生态毒性的指标。本研究发现，随着草甘膦浓度增加，杉木幼苗叶片SOD和POD活性总体呈上升趋势，这是因为叶片细胞在草甘膦作用下诱导SOD活性以清除细胞氧化损伤产生的O₂^·，而POD主要是清除经SOD歧化反应产生的H₂O₂，与张静潮等 (2010)得出的结果相似。同时也说明试验浓度范围内叶片细胞内抗氧化酶的清除速率要大于活性氧的产生速率，可见杉木幼苗叶片细胞对草甘膦的生理适应性较强。

在逆境条件下，植物通过增加渗透调节物质来提高细胞保水能力，以维持植物体正常代谢功能。脯氨酸和可溶性蛋白均是细胞重要渗透调节物质，起到保护细胞膜和细胞生命物质的作用 (Oliveira et al., 2014)。本研究中，杉木幼苗根部受到草甘膦药剂胁迫后，叶片细胞内的脯氨酸含量不断积累，而可溶性蛋白含量明显下降，说明杉木叶片细胞通过不断合成脯氨酸来调节细胞质渗透势，进而缓解草甘膦胁迫对植物细胞造成的伤害，与抗氧化酶系统一样，这也是细胞的自我防御机制之一。与本研究结果相似，黄建丽 (2012)发现草甘膦处理下草本植物紫茎泽兰 (Eupatorium adenoporum) 和白茅 (Imperata cylindrica) 的脯氨酸含量均显著升高。杉木幼苗叶片可溶性蛋白含量下降，也进一步说明草甘膦抑制细胞内蛋白质的合成过程并影响其代谢。然而张磊等 (2010)研究认为，草甘膦作用下细胞繁殖速度较慢、体积较大，细胞内碳水化合物含量较高，因此球形棕囊藻 (Phaeocystis globosa) 细胞可溶性蛋白含量随着草甘膦浓度增加而提高。莽草酸是合成植物芳香族氨基酸的必需物质，Pline等 (2002)研究发现喷施草甘膦后棉花 (Cossypium hirsutum) 莽草酸含量显著升高，指出草甘膦能够阻碍莽草酸途径，使该途径的前体物质——莽草酸不能继续分解生成芳香族氨基酸，导致莽草酸大量积累。因此，莽草酸积累量可反映植物对草甘膦的敏感性。然而本研究中杉木幼苗叶片莽草酸含量在草甘膦处理下基本没有变化，表现为试验浓度范围内杉木幼苗对草甘膦具有较强的耐受性。此外，在本研究中草甘膦随营养液施入沙土，经由根系吸收后传导至叶片细胞的草甘膦浓度较低，而采用喷雾形式时草甘膦药剂直接接触叶面，因此对莽草酸途径的抑制作用较强。

作为内吸传导型除草剂，残留在土壤中的草甘膦可以经由根系吸收传导至整株，不仅会影响叶片的正常生理功能，而且也会影响根系对养分的吸收和传导 (Cakmak et al., 2009)。本研究发现，草甘膦的存在显著提高杉木根系对Cu、Mg、Ca元素的吸收，还促进Cu和P元素在叶片中的积累，Mn和Zn含量也发生波动。与本研究结果不同，Zobiole等 (2011)发现随着草甘膦浓度增加和胁迫时间推移，大豆(Glycine max)中的大量元素和微量元素积累量均逐渐减少，并归因于草甘膦对叶绿素前缀化合物卟啉和δ-氨基乙酰丙酸 (ALA) 形成的抑制作用。但本研究表明，低浓度草甘膦可促进杉木幼苗光合作用，根系吸收更多的Mg和Ca以满足叶绿素合成的需要。另外，Ca元素还具有稳定细胞膜结构、调节细胞渗透性的作用，因此根系细胞会更多地吸收、利用环境介质中的Ca来减少草甘膦对细胞膜的破坏。Cu、P和Zn是植物体内多种酶的组成成分，Mn能催化许多呼吸酶的活性，因此草甘膦对杉木幼苗叶片酶活性的影响也直接反映叶片细胞中这几种元素的积累量变化。此外，杉木幼苗叶片P元素积累过多会导致呼吸作用增强，植物代谢过程消耗大量碳水化合物，茎叶生长受到抑制，这也是高浓度草甘膦抑制杉木幼苗生长的原因之一。

4 结论

从草甘膦对杉木幼苗形态的影响情况来看，土壤中草甘膦残存量过高浓度会抑制杉木幼苗生长，甚至使幼苗全部死亡。这主要是由于草甘膦由根部吸收进入杉木地上部分，从而影响杉木幼苗叶片的细胞膜系统、叶绿素含量、抗氧化酶活性、渗透调节物质含量、莽草酸积累量等生理生化指标。此外，草甘膦作用下杉木幼苗细胞膜脂氧化损伤加剧，膜通透性增加，并诱导SOD和POD活性提高以清除机体内氧化损伤产生的活性氧，渗透调节剂脯氨酸合成并在细胞内积累以降低细胞水势，可溶性蛋白合成受阻。因此，研究结果证实：在林业除草过程中应合理控制草甘膦的用量，喷施草甘膦应远离杉木根系，以减少根系对草甘膦的吸收，降低其不利影响。本研究为实验室的模拟试验，可以评估残存草甘膦对苗木生长的潜在危害，但要确认其真实情况，需要进一步的野外幼林抚育除草试验，以更加明确土壤残留草甘膦对林木幼苗生长的影响机制。