欧美杨细菌性溃疡病是由欧美杨细菌性溃疡病原菌 (Lonsdalea quercina subsp. populi) 引起的一种毁灭性林木病害，国内于2005年首次在河南省濮阳市发现 (郭利民等，2008)。该病主要在中林46杨 (Populus×euramericana cv.‘Zhonglin 46’)、107杨 (P. × euramericana cv. ‘74/76’) 等欧美杨品种茎干上危害，造成树木病部枝条和树干顶梢枯死，影响树木的健康生长，并导致树木材积和其他可利用部分减少 (Li et al., 2014)。目前对于该病害防治尚未得到有效解决。

微生物是地球上最多变、适应性最强的有机体，为了适应多样的生态环境，必须具备一套复杂而精密的信号系统来应答外界或体内环境的变化，从而适应环境并得以生存。目前已发现多种细胞信号转导途径，其中蛋白质磷酸化信号转导途径广泛存在于各种微生物中 (Mizuno，1997；王梁燕，2008)。双组分信号转导系统是Ninfa等 (1986)在研究大肠杆菌 (Escherichia coli) 氮调节蛋白系统时首次发现的，是广泛存在于原核和真核细胞中的信号转导系统，主要由具有保守的组氨酸位点的组氨酸激酶 (histidine kinase，HK) 和与其偶联的反应调节蛋白 (response regulator，RR)2个基本组分组成。该系统是细菌对外界各种环境信号刺激做出反应的一个重要机制，通常组氨酸激酶 (HK) 是一个跨膜蛋白，以检测环境变化，在外界环境刺激下，组氨酸激酶能迅速感受到环境刺激，并催化其自身磷酸化，随后磷酸基团从高能磷酸化的残基转移至RR接收区，接收区则通过磷酸化调节输出区的活性，以此来调控目的基因表达或使目标蛋白的功能发生适应性变化 (Hoch，2000；单世平等，2014)。

双组分信号转导系统参与调解细胞分裂、控制病原菌的致病性、抗逆性、双氧水的耐受性、渗透压调节等，尤其是在不利的生存环境中起着不可或缺的作用。因此，为了明确欧美杨细菌性溃疡病病原菌中双组分信号转导系统在致病过程中的作用，通过该病原菌全基因组生物信息学检索，得到16个组氨酸激酶基因序列，采用基因敲除方法获得1个有表型的基因，将其命名为LqHK1，并对此基因进行功能研究，分析该基因对欧美杨细菌性溃疡病病原菌的生长速率、生物膜、游动性及致病性等方面的影响，以期为探索欧美杨溃疡病病原菌的致病机制和信号转导奠定基础。

1 材料与方法 1.1 供试菌株、质粒及培养条件

本研究所用菌株、质粒及性状见表 1。大肠杆菌用LB培养基37 ℃培养16 h；欧美杨细菌性溃疡原菌N-5-1菌株及其衍生菌株用LB培养基30 ℃培养24 h。所用抗生素终浓度分别为氨苄霉素 (Amp^R)100 μg·mL^-1、氯霉素 (Cm^R) 20 μg·mL^-1、庆大霉素 (Gm^R) 30 μg·mL^-1、利福平 (Rif^R) 20 μg·mL^-1。所用引物在天一辉远 (北京) 公司合成。

1.2 供试植物

107杨树苗为采自北京林业大学森保研究室苗圃地的1年生扦插苗。选取相同生长状况的树苗，截取30 cm长枝段，每个菌株接种5个枝段，重复3次。

1.3 L.quercina LqHK1敲除突变体的构建

基因敲除采用同源重组方法 (图 1)，根据LqHK1基因序列设计引物 (表 2)。使用LqHK1-UF/LqHK1-UR、LqHK1-DF/LqHK1-DR 2对引物从菌株L. quercina N-5-1基因组中分别扩增LqHK1基因的上、下游同源臂。将纯化后的同源臂片段按1:1混合作为模板，以LqHK1-UF/LqHK1-DR引物，通过SOE PCR将同源臂连接起来。用Xho Ⅰ/NotⅠ双酶切同源片段和自杀质粒pWM91。将酶切后的自杀质粒和融合片段按适当比例混合，加入T4连接酶连接过夜，再将连接产物热激转化到E.coli-S17感受态细胞中，构建一个两侧具有LqHK1基因上、下游同源臂的重组自杀性质粒pWM91-ΔLqHK1，并进行双酶切和测序验证。

1.4 L. quercina LqHK1基因敲除突变体的获得

以携带重组自杀质粒pWM91-LqHK1的E.coli-S17为供体菌、L.quercina N-5-1为受体菌进行自杀性质粒的接合转移。分别将培养至对数生长期的受体菌与供体菌等体积混匀后，滴加到铺有LB琼脂平板表面的无菌微孔滤膜上，37 ℃放置1 h后，转到30 ℃放置48 h。用LB洗下滤膜上菌液，涂布双抗性LB琼脂平板 (100 μg·mL^-1 Amp，20 μg·mL^-1 Rif)，30 ℃培养72 h，长出的菌落用N-5-1菌株特异性引物Infb238/Infb579(申请专利) 和自杀载体上的SacB基因引物SacB1/SacB2作PCR验证。验证的菌落转到含有20 μg·mL^-1 Rif 5 mL的LB试管中连续摇培，7天后将稀释1 000倍的100 μL菌液涂到含有5%蔗糖的LB琼脂平板上，30 ℃培养48 h，各挑取20个有蔗糖耐性的菌落分别点到含有20 μg·mL^-1 Rif的LB琼脂平板和含100 μg·mL^-1 Amp的LB琼脂平板上，在含有Rif的LB平板上能生长而在含有Amp的LB平板上不能生长的菌株为缺失突变株。然后用引物LqHK1-UF和LqHK1-DR进行PCR验证 (王薇等，2014)。

1.5 LqHK1基因互补突变体的获得

以野生菌株N-5-1基因组为模板，PCR扩增出互补片段，与穿梭质粒pBBR1M-CS-5共同用HindⅢ和XbaⅠ限制性内切酶进行酶切后，将供体菌、受体菌、Helper菌株取出适量进行三亲杂交，将构建正确的互补载体转化到LqHK1突变菌株中，PCR验证转化子，得到互补菌株HBLqHK1。互补菌株的构建可以保证通过回补后表型的恢复来确定该基因的功能 (李宾等，2015)。

1.6 生长曲线测定

将野生菌株、缺失突变体和互补菌株接种于LB液培养基中过夜培养至稳定生长期，用新鲜LB液体培养基将各菌株稀释到OD₆₀₀=0.5，以体积比1:100的比例将浓度相同的各菌株接种于100 mL的LB液体培养基中，30 ℃、200 r/min摇培，每隔12 h取1次样, 每个菌株3次重复，测定各菌株在600 nm处的吸光值，绘制生长曲线。

1.7 游动性的测定

将野生菌株、缺失突变体和互补菌株接种于LB液体培养基中过夜培养至稳定生长期，吸取10 μL滴于含有0.3%琼脂的半固体LB培养基上无菌风吹干，30 ℃静置培养48 h，测量各菌株游动晕圈直径，重复3次 (Khajanchi et al., 2009)。

1.8 生物膜的测定

将野生型菌株N-5-1、△LqHK1和HBLqHK1接种于LB液体培养基中过夜培养至稳定生长期, 以体积比1:100稀释到含有3 mL新鲜的LB液体培养基的试管中 (15 mL)，30 ℃静置培养48 h，将培养液缓慢倒掉, 加入0.1%的结晶紫染色15 min，用移液器轻轻吸尽结晶紫溶液，然后用无菌水清洗3遍试管，于37 ℃烘干试管，可观察到试管壁上一圈紫色痕迹即是固液交界处形成的坚固的生物膜。加入2.5 mL 95%的乙醇充分溶解与生物膜结合的结晶紫，取1 mL测量OD₅₇₀(Morohoshi et al., 2007)。

1.9 致病性反应测试

将野生菌株、突变体菌株和互补菌株分别接种到含有相应抗生素的LB液体培养基中，30 ℃、200 r·min^-1摇床震荡培养24 h，用无菌水将菌液浓度稀释到10⁷ cfu·mL^-1。用自来水清洗欧美杨107枝段，然后用脱脂棉加75%酒精在接种点处进行表面消毒，再用消毒的刀片划十字伤口，大小为1 cm×1 cm，深度达到木质部，分别用注射器吸取80 μL各菌株菌液接种到枝段伤口处。培养条件：接种好的枝条放在水桶中，再放入温湿度气候箱中 (30 ℃、RH80%)，接种3天后去掉保鲜膜和棉团。每个菌株接5个枝段，每个枝段接1个点，重复3次，LB液体培养基接种为阴性对照。培养7天后观察、记录发病情况 (Yang et al., 2014)。

1.10 荧光定量PCR检测发病部位病原菌含量 1.10.1 欧美杨接种枝条总DNA的提取

按照1.9的方法，接种欧美杨枝条，在发病达到高峰期，第7天，取接种点处100 mg杨树组织。将组织剪碎，在液氮冷冻下研磨成粉末状，按照天根植物基因组提取试剂盒的方法提取总DNA。

1.10.2 欧美杨组织中病原菌DNA的Real-time PCR定量分析

应用特异性引物InfB 238/InfB 579扩增L. quercina DNA, 使用ABI 7500 system (Applied Biosystem，Carlsbad，CA，USA) 进行Real-time PCR扩增。从LB液体培养基的细菌中提取野生型基因组DNA, 用nano-drop 2000定量并10倍梯度稀释后，用引物InfB 238/InfB 579进行定量PCR，制作标准曲线。根据标准曲线测定样品中的DNA质量浓度 (Shang et al., 2015)。

1.11 游动性相关基因表达量分析

采用TaKaRa Total RNA提取试剂盒的方法提取各菌株总RNA。经电泳检测质量后按照反转录试剂盒Prime ScriptTM RT Master Mix (for Real Time)(TaKaRa) 的方法合成cDNA。以cDNA为模板，进行实时定量PCR反应，定量PCR反应采用Super Real Premix Plus (天根，中国)、SYBR Green染料和ABI7500实时PCR系统 (Applied Biosystem，Carlsbad，CA，USA)。以16S rRNA作为内参基因 (引物序列见表 2)。每个反应进行3个平行试验，每个试验重复3次。相对表达量是由2^-△△CT方法计算 (Livak et al., 2001)。

2 结果与分析 2.1 LqHK1基因缺失突变体的获得与验证

以引物LqHK1-UF和LqHK1-DR进行PCR扩增菌株N-5-1和突变体的基因组DNA, 电泳检查证明缺失突变体LqHK1的碱基大小为1 488 bp (图 2A)。

提取细菌基因组，分别用EcoRI和NotI双酶切突变体和野生型基因组DNA，以LqHK1-UF/LqHK1-UR扩增产物为探针，进行Southern杂交验证 (图 2B)。由于LqHK1突变体比野生型缺少了1 350 bp，野生型杂交信号带大小为2 298 bp, 而突变体菌株杂交信号带大小为948 bp，证明确实是突变体。

2.2 LqHK1基因互补突变体的获得与验证

挑取转化子，用引物InfB 238/InfB579、引物pBBR1MCS-5多克隆位点上下游引物MCS1/MCS2(图 3) 进行PCR验证。分别可扩增到342 bp和2 182 bp片段，大小与预期一致，即LqHK1基因互补菌株构建正确。

2.3 LqHK1缺失突变体的生长速率

以横坐标为时间、纵坐标为活菌数的对数 (OD₆₀₀值) 绘制出一条生长曲线，结果显示，野生型菌株N-5-1、△LqHK1和HBLqHK1的生长曲线无明显差异，在液体LB培养基中均可正常生长 (图 4)。

2.4 LqHK1基因突变影响生物膜的形成

生物膜是指附着于惰性物体或活动实体表面的细菌包体以及由自身分泌的含水聚合性基质包裹所形成的被膜状细菌菌落 (宋菲等，2010)。通过结晶紫染色，可以在试管壁上观察到紫色环状的生物膜形成。在本试验中，△ LqHK1、HBLqHK1、野生菌株N-5-1均可形成生物膜 (图 5A)，但突变体形成生物膜的能力显著降低，OD₅₇₀的吸光值平均为0.33，明显小于野生型菌株OD₅₇₀平均吸光值0.42(P < 0.05)，对应的互补菌株恢复野生型状态，说明L. quercina N-5-1的LqHK1基因在其生物膜形成过程中发挥重要作用 (图 5B)。

2.5 LqHK1缺失影响病原菌游动性及相关基因的表达

经过48 h培养，欧美杨细菌性溃疡病原菌野生型菌株的游动圈平均直径为3.54 cm，突变株△LqHK1的游动圈平均直径为2.51 cm，互补菌株的游动圈平均直径为3.50 cm (图 6)。数据结果显示，突变株与与野生型N-5-1的游动能力存在显著差异 (P < 0.05)，HBLqHK1游动圈大小与野生型无显著差异，运动能力基本恢复，表明LqHK1在病原菌游动性中具有重要作用。

利用qRT-PCR方法进一步检测游动性相关基因flgB、flgC、flgE在突变菌株中的表达情况。野生菌株的表达水平设为1。分析表明，游动性相关基因的表达量与野生型菌株相比存在显著差异 (P < 0.01)(图 7)，说明LqHK1对所选游动性基因为正调控。

2.6 LqHK1基因突变体对致病性的影响 2.6.1 突变体对致病性的影响

用野生菌株N-5-1、LqHK1突变体和互补菌株分别接种1年生107杨树枝条，接种4天后杨树枝条开始发病，在第7天，发病达到高峰期。剖开接种部位的树皮，可以明显看到野生型菌株造成病斑长度较长，平均长度为4.3 cm，并且危害较严重；突变体造成的病斑长度较短，平均长度为2.2 cm (P < 0.01)，互补菌株恢复至野生型水平 (图 8)。

2.6.2 突变体对病原菌在寄主植物上的定殖能力的影响

将欧美杨溃疡病病原菌2 ng DNA进行5次10倍梯度稀释，用引物InfB 238/InfB579进行Real-time PCR分析，制作标准曲线。线性方程为y=-3.605 9x+17.057(R²=0.997 8，P < 0.05)。其中, y为CT值，x为细菌性溃疡病菌DNA浓度常用对数Lg值。

应用Real-time PCR定量分析 (图 10) 表明，发病达到高峰期时，在接种点部位△LqHK1突变体的DNA含量明显少于野生菌株N-5-1和互补菌株, 说明在寄主植物上LqHK1基因的缺失导致病原菌的定殖能力下降。

3 讨论

由欧美杨细菌性溃疡病原菌引起的欧美杨细菌性溃疡病是杨树上一种严重的细菌性病害，目前，对于该病原菌的研究主要集中在病原菌鉴定 (任飞娟，2011)、病原菌检测方法和技术 (商靖，2014)、病原菌的Ⅲ型分泌系统 (type Ⅲ secretion system，T3SS)(杨莉等，2014) 等方面。本研究以欧美杨细菌性溃疡病病原菌双组分信号系统的LqHK1基因为对象，从野生型菌株N-5-1的全基因组中克隆到相应的双组分系统基因，然后通过同源重组方法构建了LqHK1基因缺失突变体。通过对L. quercina双组分信号转导系统中LqHK1基因的敲除，使突变体菌株在寄主植物上的致病能力降低，且病原菌的游动能力和生物膜形成能力减弱。这说明双组分系统中的LqHK1基因可对欧美杨细菌性溃疡病原菌的游动能力、生物膜形成能力造成影响，进而导致病原菌的致病能力减弱，为揭示欧美杨溃疡病原菌的致病机制和信号转导提供了试验依据。并且通过对鞭毛相关基因的表达量检测，发现LqHK1基因对游动性相关基因起正调控作用，这也在转录水平对上述结论进行了进一步印证，从而证明该病原菌中双组分信号转导系统发挥着重要的作用。

在许多植物病原细菌中，双组分调控系统已被证明在病原菌的侵入和致病性等方面起重要作用，如根癌土壤农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 中调控致病性的ChvG/Chvl和VirA/VirG (Charles et al., 1993；Pan et al., 1993)、软腐病菌 (Dickeya dadantii) 中，导致寄主植物马铃薯 (Solanum tuberosum) 和胡萝卜 (Daucus carota var.sativus) 致病性完全丧失的CpxA/CpxR(Bontemps et al., 2015)、梨火疫病菌 (Erwinia amylovora) 中EnvZ-OmpR和GrrA-GrrS调节病原菌致病毒力的释放和致病力 (Zhao et al., 2009) 等。在有的病原细菌中，双组分信号转导系统对病原菌的其他方面也存在影响，水稻条斑病菌 (Xanthomonas oryzae pv. oryzicola) 中ColR/ColS的突变，不仅导致病原菌的致病性丧失，而且ColR/ColS也在脂多糖产生、过氧化氧酶活性、环境耐受力 (如苯酚、铜和过氧化氢) 等方面起着重要作用 (Yang et al., 2007)。在本研究中，LqHK1基因并未对病原菌的生长速率、胞外多糖产生、纤维素酶活性等造成影响，这说明不同植物病原细菌的双组分信号转导系统所起的生理功能有所不同。此外，在双组分信号转导系统中，不同双组分信号转导系统之间存在着信号交流，可以使病原细菌中双组分信号转导系统中某个组分的缺失不一定会影响病原菌的表型。

欧美杨细菌性溃疡病菌LqHK1基因与病原菌的致病性相关，为了解该病原菌的致病机制提供了新的研究方向。但是，目前只进行了组氨酸激酶基因研究，并未对其偶联的反应调节蛋白进行功能研究，开展此项研究将有助于进一步了解双组分结构与功能。此外，对于L. quercina N-5-1中LqHK1基因是如何调节病原菌的信号的传导、毒力以及参与到其他致病基因的调控等方面也需要进行深入研究。

4 结论

LqHK1基因缺失突变体在107杨树上的致病能力显著下降，Ream-time PCR检测表明发病部位的病原菌含量减少；突变体菌株的游动能力和生物膜的形成能力显著降低，说明LqHK1基因在病原菌的致病过程中发挥着重要的作用。