2017, Vol. 53
文章信息
- 周厚君, 魏凯莉, 江成, 赵岩秋, 宋学勤, 卢孟柱
- Zhou Houjun, Wei Kaili, Jiang Cheng, Zhao Yanqiu, Song Xueqin, Lu Mengzhu
- 杨树GRF1/2d负调控不定根的发生和发育
- Negative Regulation of GRF1/2d on the Formation and Development of Adventitious Roots in Populus alba×P. glandulosa '84K'
- 林业科学, 2017, 53(3): 33-39.
- Scientia Silvae Sinicae, 2017, 53(3): 33-39.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20170304
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文章历史
- 收稿日期：2016-04-25
- 修回日期：2016-06-17
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作者相关文章
生长调节因子 (growth-regulating factor, GRF) 是一类植物特有的转录因子，对植物的生长发育具有重要的调控作用 (Kim et al., 2003; 2015；Zhang et al.，2008; Bazin et al., 2013; Wang et al., 2014; Omidbakhshfard et al., 2015)。GRFs基因通常在幼嫩的组织中表达量较高，在成熟的组织中表达量较低 (Kim et al., 2003)，提示GRFs基因可能参与植物的早期发育。大多数GRF是miR396的靶基因，与miR396一起参与多种植物生长发育过程，包括根的生长 (Kim et al., 2015; Omidbakhshfard et al., 2015)。拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 中大多数AtGRF在根中显示出较高的表达水平 (Bao et al., 2014)，而且调控它们的miR396对根正常发育至关重要 (Hewezi et al., 2012)。干涉miR396a拟南芥根比野生型的长，而miR396a和miR396b过表达植株以及过表达不受miR396调控形式的AtGRF1或AtGRF3(靶位点碱基诱变) 植株的根均变短 (Hewezi et al., 2012; Bao et al., 2014)。同样，研究人员发现苜蓿 (Medicago truncatula) 中MtGRF2、MtGRF4和MtGRF6的RNAi植株表现出根的长度比野生型短的表型 (Bazin et al., 2013)，而在miR396过表达苜蓿中，分生组织细胞数目变少、细胞周期特征基因表达量降低和处于复制期的细胞比例降低，表明miR396-GRF通过影响细胞周期途径实现对根发育的调控 (Bazin et al., 2013)。与大多数拟南芥AtGRFs基因在根中显现出较高的表达水平不同的是，水稻 (Oryza sativa)OsGRFs基因在根中低表达 (Bao et al., 2014)。与此相反，大白菜 (Brassica pekinensis)BrGRF16基因在根中高表达，表明它可能参与根的发育 (Omidbakhshfard et al., 2015)。这些结果表明在根发育方面GRFs的功能存在多样性和差异性。
GRFs对根发育影响的研究主要集中在草本植物，在木本植物生长发育特别是不定根 (adventitious roots) 的发生和发育中的作用目前尚缺乏研究。不定根对木本植物的无性繁殖至关重要，也是决定繁殖成功与否的一个关键步骤。不定根的形成是一个复杂的过程，通常有4个时期：激活期、诱导期、根原基的激活及新组织的形成期和根原基伸长及维管连接建立期。前期研究表明，不定根的这些过程都离不开转录因子的调控 (Legué et al., 2014)。转录因子SCARECROW (SCR)、APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR (AP2/ERF) 蛋白家族AINTEGUMENTA-like亚组[如PLETHORA (AtPLT), BABY BOOM (AtBBM), AINTEGUMENTA (AtANT) 和AINTEGUMENTA-like (AtAIL)]及WUSCHEL-related homeobox (WOX)(Krizek et al., 2000; Mizukami et al., 2000; Nole-Wilson et al., 2005; Imin et al., 2007; Horstman et al., 2014; Liu et al., 2014; Xu et al., 2015) 均与不定根形成相关。杨树不定根形成过程中会发生重要的转录组重塑，其中35个家族的转录因子的表达发生了显著变化 (Ramírez-Carvajal et al., 2009; Rigal et al., 2012; Legué et al., 2014)，表明杨树不定根的形成同样与转录因子的调控密切相关。但对杨树不定根发生和形成的调控机制还缺乏认识。
杨树作为研究树木生长发育的模式树种，研究其不定根的形成和形成过程中的分子调控机制，对研究树木不定根的分子遗传具有非常重要的理论指导意义。本研究从银腺杨84K (Populus alba × P. glandulosa ‘84K’) 中分离了拟南芥AtGRF1和AtGRF2同源基因PtGRF1/2d，并对miR396靶位点的核苷酸进行同义突变，获得了不受miR396调控的突变形式mPtGRF1/2d，通过遗传转化获得过量表达mPtGRF1/2d的转基因杨树，并对其不定根的发生、发育进行分析，为了解GRF调控杨树不定根的形成奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料银腺杨84K组培苗为中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室保存并扩繁；pDNOR222.1、pCAMBIA1300和pMDC164载体、大肠杆菌 (Escherichia coli) DH5α及农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) GV3101菌种均由本实验室保存；PCR引物合成和测序由英潍捷基生物公司完成；KOD PLUS酶购自TOYOBO公司；重组酶购自Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；限制性内切酶购自NEB公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自AxyGen公司；RNA提取试剂盒、DNA酶购自QIAGEN公司；反转录试剂盒购自Invitrogen公司；定量试剂购自TaKaRa公司。
1.2 方法 1.2.1 质粒和载体构建利用拟南芥AtGRF1和AtGRF2基因序列在毛果杨 (Populus trichocarpa) 基因组数据库 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) 进行比对，获取拟南芥AtGRF1和AtGRF2同源基因PtGRF1/2d序列和其启动子序列，据序列设计基因特异PCR引物 (表 1)。通过RT-PCR方法从银腺杨84K cDNA中分离得到PtGRF1/2d基因，并在不改变其编码氨基酸的基础上，将PtGRF1/2d中miR396靶位点处6个核苷酸进行突变，使得mPtGRF1/2d与miR396成熟序列不能严格配对，从而避免在转录水平被miR396降解，获取不受miR396调控的突变形式mPtGRF1/2d，将其克隆至pDNOR222.1载体，测序验证后，重组至pCAMBIA1300过表达载体。从银腺杨84K基因组DNA中分离PtGRF1/2d基因的启动子，克隆至pDNOR222.1载体并重组至带有GUS报告基因的pMDC164植物表达载体。将构建好的载体电击转化至农杆菌GV3101感受态细胞，利用农杆菌介导的叶盘法转化银腺杨84K。
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植物材料培养和遗传转化具体方法见文献 (Liu et al., 2014)。选取表达量较高的3个过表达转基因株系，以野生型银腺杨84K为对照，每个株系至少扩繁15株，定植温室。过量表达mPtGRF1/2d对杨树株高影响的测定至少重复3次。
1.2.3 RNA提取和RT-PCR分析组培30天过表达mPtGRF1/2d杨树的叶用于PtGRF1/2d表达量鉴定；组培扦插4天时处于不定根发育愈伤组织形成阶段 (Liu et al., 2014) 的不定根发生部位，具体为培养基插入部分约1 cm的下端茎段，用于不定根发育相关基因的表达量鉴定。以上表达鉴定均采用实时定量的方法且至少重复3次。RNA提取和反转录具体方法见Liu等 (2014)，定量PCR的引物使用Primer 3软件 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm) 设计 (序列见表 1)。实时定量PCR用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒 (TaKaRa，Dalian，China) 在Roche 480定量PCR仪 (Roche Applied Science) 上完成，每个样品4次重复，ACTIN基因作内参。
1.2.4 GUS染色组培30天的PPtGRF1/2d∷GUS转基因杨树用于GUS染色。GUS的组织化学染色具体方法见文献 (Liu et al., 2014)。
1.3 数据统计用Microsoft Excel和SPSS17.0软件对数据进行处理，并用t检验法检验差异显著性水平。
2 结果与分析 2.1 GRF1/2d在不定根中的表达情况不定根的形成包括R1预诱导阶段、R2愈伤组织形成阶段、R3不定根出现阶段和R4不定根延长阶段 (图 1A)(Liu et al., 2014)。银腺杨84K不定根发育过程中，R1-R2时期PtGRF1/2d的转录活性先急剧下降后逐渐上升，R2时期PtGRF1/2d转录表达活性达到最强；而R3-R4时期PtGRF1/2d转录表达急剧下降到起始时期水平 (图 1 B)。PtGRF1/2d的表达量在R2愈伤组织出现时期显著上调 (图 1B)，提示它可能是根分生组织 (根原基发生) 的关键调控因子。
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图 1 不定根中PtGRF1/2d的表达情况 Fig.1 Expression of PtGRF1/2d during the successive stages of adventitious root (AR) formation A:不定根形成过程 (R1:预诱导阶段; R2:愈伤组织形成阶段; R3:不定根出现阶段; R4:不定根延长阶段); B: PtGRF1/2d动态表达变化; C: PPtGRF1/2d∷GUS杨树GUS染色 (a-c:局部放大图)。 A: The successive stages of adventitious root formation (R1: Preinduction stage; R2: Callus regeneration stage; R3: Adventitious root emergence stage; R4: Adventitious root elongation stage); B: Dynamic expression of PtGRF1/2d during the successive stages of adventitious root formation; C: Total PPtGRF1/2d∷GUS poplar plant GUS staining (a, b and c represent partial enlarged drawing of picture C). |
为进一步考察PtGRF1/2d的组织表达情况，创制了启动子融合GUS报告基因的PPtGRF1/2d∷GUS转基因材料。结果显示GUS信号在叶、茎和根组织中都存在 (图 1C)。进一步观察发现，PtGRF1/2d在根部的信号集中在中柱鞘和根尖位置 (图 1C: b, c)，这与其调控根分生组织活性的假设相一致。
2.2 过表达mPtGRF1/2d对杨树不定根发生、数目和长度的影响为进一步研究PtGRF1/2d对杨树不定根发育的影响，对miR396靶位点核苷酸进行同义突变，创制了不受miR396调控的过表达mPtGRF1/2d杨树。从获得的25个独立转基因株系中选取表达量不同的3个独立转基因株系 (#8、#9和#10) 作为进一步研究对象。
表型观察发现，过表达mPtGRF1/2d杨树根系发育明显变弱 (图 2A)，具体表现为：3个株系不定根的发育明显延迟 (图 2C)；且不定根数目减少，分别为3.1，3.6，2.8，对照杨树为3.9(图 2D)，不定根数目减少了10%~30%，其中2个株系与对照植株的差异达到显著水平 (*, P＜0.05)；此外，3个株系不定根的长度变短，分别为4.241，4.174，4.236 cm，对照杨树则为5.24 cm，不定根长度减少了20%左右，差异均达到极显著水平 (**, P＜0.01)(图 2E)。以上结果表明，PtGRF1/2d可能是不定根发育的负调控因子。
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图 2 过表达mPtGRF1/2d杨树的不定根相关性状分析 Fig.2 Analysis of adventitious root (AR) traits of mPtGRF1/2d overexpression transgenic poplars WT:对照植株；#8, #9, #10:过表达mPtGRF1/2d杨树。WT: Wide type; #8, #9, #10: mPtGRF1/2d overexpression transgenic poplars. t-test: *, P＜0.05; **, P＜0.01.下同。The same below. |
不定根发育受多种转录因子调控 (Legué et al., 2014)。为了进一步明确PtGRF1/2d与这些不定根发育相关调控因子SCR，AIL，BBM2，PLT1以及WOX11的关系，利用qRT-PCR技术对这些基因的表达量进行了检测。结果显示，在不定根形成的起始阶段，杨树相应转录因子PtSCR，PtAIL9，PtBBM2，PtPLT1.2以及PtWOX11b基因的表达量在过表达mPtGRF1/2d杨树中被显著下调 (图 2F)，表明PtGRF1/2d在不定根发育的起始阶段发挥作用，可能是通过影响与根原基形成及不定根发育的相关转录因子的表达，负调控杨树不定根的形成和伸展。
生长90天的过表达mPtGRF1/2d杨树株高生长明显低于对照 (图 3A)。统计结果显示：过表达mPtGRF1/2d杨树3个株系株高分别为22.17，23.83，26.00 cm，而对照为36.5 cm (图 3B)，3个株系的株高均低于对照，达到显著水平 (P＜0.05) 或极显著水平 (P＜0.01)，表明PtGRF1/2d对杨树不定根发生和发育的负调控所导致的不定根数目及长度的减少，严重影响了杨树的生长。
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图 3 温室定植90天的对照植株 (WT) 和过表达mPtGRF1/2d杨树 (#8, #9, #10) Fig.3 Ninety-day-old wide type (WT) and mPtGRF1/2d overexpression transgenic poplars (#8, #9, #10) in greenhouse |
根作为重要的植物器官，解析生长调节因子 (GRFs) 对根的发育影响非常重要。但目前这类研究工作主要集中在拟南芥、苜蓿、水稻等草本植物中，在木本植物生长发育中的作用研究很少。决定木本植物扦插繁殖一个重要方面就是不定根的发生和发育，因此本研究在木本植物杨树中分析GRFs的作用，对于揭示杨树不定根发生、发育的调控机制及其在扦插繁殖技术上的应用具有重要的意义。
本研究克隆了杨树PtGRF1/2d基因，表达分析显示其在不定根发育的起始阶段即根原基形成时期表达变化显著 (图 1B)；启动子驱动的GUS染色分析表明PtGRF1/2d在不定根的中柱鞘和根尖高表达 (图 1C: b, c)，表明该基因在根的形成和发育中的重要作用。通过对miR396靶位点的核苷酸进行同义突变，获取不受miR396调控的突变形式mPtGRF1/2d，用于获得该基因的高表达转基因植株。过表达mPtGRF1/2d杨树生长受到抑制，主要是其不定根发育延迟，并且数目和长度均减少 (图 2)。上述结果说明，GRF对杨树不定根的影响与对其他植物如拟南芥根发育的影响一致，都具有负调控作用。
为了揭示其负调控作用的机制，利用qRT-PCR分析了过表达mPtGRF1/2d杨树不定根发育早期与不定根形成有关的转录因子PtSCR，PtAIL9，PtBBM2，PtPLT1.2及PtWOX11b基因的表达。研究表明，SCR对不定根根原基形成过程中分生组织决定和维持有重要功能，而根原基的建立伴随PtAIL1，PtAIL9，PtBBM2，PtPLT1.1和PtPLT1.2基因表达量的上调，根原基的分化则与PtAIL1，PtAIL5，PtAIL9，PtBBM2，PtPLT1.1和PtPLT1.2的表达调控相关 (Legué et al., 2014)。另外，WOX11a和WOX11b同样参与不定根的发育 (Liu et al., 2014; Xu et al., 2015)。过表达PtoWOX11/12a杨树不定根数目增多 (Liu et al., 2014)，而过表达PeWOX11a和PeWOX11b的杨树不仅不定根的数目增加，茎上还会诱导出不定根，此外过表达PeWOX11b杨树还会在叶腋诱导出不定根和不定根上诱导出芽 (Xu et al., 2015)。本研究发现，在过表达mPtGRF1/2d杨树中其中5个基因的表达量被下调 (图 2F)，表明PtGRF1/2d的过量表达抑制了根原基发生和不定根发育的关键调控因子的表达。其中在过表达mPtGRF1/2d杨树中，WOX11b的表达下调2倍，表明PtGRF1/2d可通过抑制WOX11b表达影响根原基的分化，起到负调控作用。值得注意的是，PtGRF1/2d能够抑制多个根原基发生与不定根形成相关转录因子的转录，来抑制根原基的发生，延缓不定根的形成，最终导致不定根数目与长度的变化。这说明PtGRF1/2d位于不定根调控途径的上游，具有重要的调控作用。
4 结论本研究通过转基因技术，分析了PtGRF1/2d在不定根发生和发育中的作用。结果表明PtGRF1/2d是杨树不定根形成的负调控因子，主要通过下调能够促进不定根形成的相关转录因子的表达，来抑制根分生组织和根原基的形成，最终导致不定根发生延迟、数目和长度减少。PtGRF1/2d如何抑制不定根转录因子，从而负调控不定根形成的具体机制有待进一步深入解析。
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