白蚁 (Isoptera) 是利用纤维素类物质最为成功的昆虫，全世界白蚁种类有近3 000种 (Krishna et al., 2013)，作为生态系统的高效分解者发挥着重要的生态作用 (Bignell et al., 2000)。白蚁每年能够消耗74%~99%的木材纤维素，强大的纤维素消化能力与其具有丰富的纤维素酶密切相关 (Breznak et al., 1994；Watanabe et al., 2010)。白蚁体内通常包括3种类型的纤维素酶，即内切葡聚糖酶 (endo-β-1, 4-glucanases，EG，EC 3.2.1.4)、β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidase，BG，EC 3.2.1.21)、外切葡聚糖酶 (exo-β-1, 4-glucanases，C1，EC 3.2.1.91)。外切葡聚糖酶包括纤维二糖水解酶 (cellobilohydrolase，1, 4-β-D-glucancellobiohydrolase，CBH) 和外葡萄糖水解酶 (exoglucohydrolase，1, 4-β-D-glucanexoglucohydrolase)(相辉等，2009；Li et al., 2009)。

在白蚁类群中，约2.8%的物种对木材、建筑材料等构成严重危害 (Watanabe et al., 2001；Rust et al., 2012)，白蚁安全防治技术一直是白蚁防治研究的重要方向之一 (Verma et al., 2009)。随着环境与人类健康问题的日益突出以及POPs公约的全面实施，对白蚁预防与防治替代性药物与新措施的研究再次受到关注 (Rust et al., 2012)。台湾乳白蚁 (Coptotermes formosanus)(等翅目Isoptera:鼻白蚁科Rhinotermitidae) 是已知危害严重且易传播蔓延的世界性有害白蚁种类之一，在我国华南地区为害尤为严重 (Evans et al., 2013)。目前利用病原微生物控制白蚁并没有明显的应用价值，而利用植物源活性成分控制白蚁的研究日益受到重视 (Verma et al., 2009；Chouvenc et al., 2011)。植物源活性成分的研究报道多关注于白蚁触杀、驱避和拒食活性，用于保护木材与建筑结构等 (Maistrello et al., 2003; Raina et al., 2012)。

氧化苦参碱 (oxymatrine) 是从豆科植物苦参 (Sophora flavescens) 中提取的一种生物碱。苦参在我国分布广泛，苦参生物碱具有广谱的杀虫效果及抑菌活性，可用于防治多种农业害虫如桃蚜(Myzus persicae)、褐飞虱 (Nilaparvata lugers)等，对白蚁也有一定的防治效果 (袁静等，2004；Mao et al., 2007)。Mao等 (2007)研究发现氧化苦参碱对台湾乳白蚁的毒性较低，高剂量具有显著的拒食活性，但对白蚁取食消化过程中纤维素酶活性是否产生影响尚无报道。1%氧化苦参碱对白蚁具有一定的慢性胃毒作用，本文研究氧化苦参碱对台湾乳白蚁滤纸酶活性 (filter paper activity，FPA) 及纤维素酶EG、BG、CBH活性的影响，为探讨氧化苦参碱在白蚁预防与控制方面的应用提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试白蚁

供试虫源采自广州国际生物岛，带回实验室用10 L塑料箱 (内含松木板) 饲养。饲养条件：温度 (26±1)℃，相对湿度65%±5%，黑暗无光照。试验前挑取活力较好、大小一致的台湾乳白蚁工蚁供试。

1.1.2 主要试剂

氧化苦参碱 (oxymatrine，美伦生物)，0.9%氯化钠溶液，SAB缓冲液 (醋酸-醋酸钠缓冲液)，羧甲基纤维素钠 (CMC-Na，AR，天津福晨)，D-水杨苷 (D-Salicin，AR，上海阿拉丁)，葡萄糖 (BR)，对硝基苯-β-D-纤维二糖苷 (p-NPC，Sigma)，对硝基苯酚 (p-NP，Sigma)，碳酸钠 (Na₂CO₃，AR)，3，5-二硝基水杨酸 (DNS，AR，广州光华)，酒石酸钾钠 (AR，天津福晨)，结晶酚 (AR，北京鼎国)，无水硫酸钠 (AR)，考马斯亮蓝G-250(广州化学)，牛清血蛋白组分V (BSA，北京鼎国)。

1.2 方法 1.2.1 台湾乳白蚁喂食处理

挑取活力较好且大小一致的台湾乳白蚁工蚁若干，饥饿处理2天后，分为对照组和处理组，用直径7 cm的滤纸喂食，2组均重复6次，其中3次重复用于酶活测定，3次重复用于活力与存活情况观察。处理组滤纸用500 μL 1%氧化苦参碱溶液润湿，对照组滤纸用500 μL灭菌蒸馏水润湿，稍晾干后放入直径9 cm的培养皿中。对用于酶活测定的重复，每培养皿放入白蚁约150头，置于26 ℃恒温培养箱，每天分别添加1次适量灭菌蒸馏水保持湿润状态。在处理后6 h、12 h、1天、3天、5天、7天，分别在每个重复中选取活力较好的白蚁各15头，提取粗酶，用于纤维素酶活性测定。用于生长发育观察的重复，每培养皿各放入白蚁100头，测定质量后，进行同上的滤纸喂食试验，于第7天测定白蚁质量，记录累计死亡率。

1.2.2 粗酶制备

将选取的15头白蚁用预冷的0.9%氯化钠溶液漂洗，用滤纸吸干白蚁表面水分，分别放入装有500 μL预冷SAB缓冲液 (0.1 mol·L^-1，pH 5.6) 的离心管中，用电动组织研磨器 (TIANGEN，OSE-Y10) 冰浴研磨。4 ℃、12 000 r·min^-1离心 (Scilogex，D3024R) 匀浆液10 min，取上清液；4 ℃、12 000 r·min^-1再次离心5 min，取上清液即粗酶液于-20 ℃保存，待酶活测定。

1.2.3 蛋白质浓度的测定

蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法 (Bradford，1976) 测定。根据制备的粗酶液浓度按一定比例进行稀释，取50 μL稀释后的粗酶液加入350 μL考马斯亮蓝G-250显色剂，混匀后静置3 min，显色后采用多功能酶标仪 (PerkinElmer，1420-012 victor3) 测定595 nm波长处的吸光值。根据同时测定的牛血清蛋白标准曲线计算粗酶液的蛋白质浓度。每个反应体系重复3次。

1.2.4 滤纸酶活性 (FPA) 的测定

参照Miller (1959)方法，采用还原糖法测定。每个离心管中放入1张滤纸小圆片 (每张滤纸小圆片约3.5 mg，高温灭菌)，再加入120 μL SAB缓冲液 (0.1 mol·L^-1，pH 5.6) 浸润滤纸。加入12 μL粗酶液，混匀后于37 ℃恒温水浴60 min，对照管用SAB缓冲液 (0.1 mol·L^-1，pH 5.6) 代替粗酶液。反应完毕后加入120 μL DNS溶液，沸水浴5 min显色后迅速冰浴冷却，用SAB缓冲液定容到500 μL，用酶标仪测定540 nm波长处各样品的吸光值，同时测定葡萄糖标准曲线的吸光值，根据测定结果计算FPA。每个反应体系重复3次。酶活力单位 (U) 定义为在37 ℃、pH 5.6反应条件下，每分钟水解底物产生1 μg还原糖的酶量；比活力 (IU) 定义为每毫克酶蛋白的酶活力单位数 (U·mg^-1)。

1.2.5 内切-β-1, 4-葡聚糖酶 (EG) 和β-葡糖苷酶 (BG) 活性的测定

EG和BG的活性均采用还原糖法测定，分别以1% CMC-Na溶液和1% Salicin溶液为底物。取120 μL底物溶液和12 μL粗酶液，37 ℃恒温水浴60 min，对照管用SAB缓冲液代替粗酶液。反应完毕后加入120 μL DNS溶液终止反应，沸水浴5 min显色后迅速冰浴冷却，用SAB缓冲液定容到500 μL，用酶标仪测定540 nm波长处各样品的吸光值，同时测定葡萄糖标准曲线的吸光值，根据测定结果计算EG和BG活性。每个反应体系重复3次。酶活力单位 (U) 与比活力 (IU) 定义同1.2.4。

1.2.6 纤维二糖水解酶 (CBH) 的活性测定

CBH的活性测定以0.1 mol·L^-1 p-NPC为底物，取120 μL底物溶液和12 μL粗酶液，37 ℃恒温水浴60 min，对照管用SAB缓冲液代替粗酶液。反应完毕后加入120 μL 1 mol·L^-1 Na₂CO₃溶液终止反应，用SAB缓冲液定容到500 μL，用酶标仪测定405 nm波长处各样品的吸光值，根据同时测定的p-NP标准曲线计算CBH活性。每个反应体系重复3次。酶活力单位 (U) 定义为在37 ℃、pH 5.6反应条件下，每分钟水解底物产生1 μg p-NP的酶量；比活力 (IU) 定义同1.2.4。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010软件进行酶活力和比活力计算，SPSS 17.0软件进行单因素方差分析 (ANOVA) 及酶活性抑制作用的Duncan多重比较，统计数据以均值±标准误 (mean±SE) 表示。

纤维素酶活性抑制率 (%)=(对照纤维素酶活性-氧化苦参碱处理后纤维素酶活性)/对照纤维素酶活性×100。

2 结果与分析 2.1 氧化苦参碱对台湾乳白蚁

FPA的影响由表 1可见，处理组FPA均低于对照，除处理后6 h的测定结果无显著差异 (F₅=5.898, P=0.072) 外，处理后12 h (F₅=28.003, P=0.006)、1天 (F₅=155.078, P < 0.001)、3天 (F₅=45.506, P=0.003)、5天 (F₅=63.965，P=0.001)、7天 (F₅=24.779, P=0.008) 的测定结果均与对照差异极显著。

2.2 氧化苦参碱对台湾乳白蚁EG活性的影响

由表 2可见，处理组EG活性均低于对照。处理后6 h (F₅=13.013, P=0.023)、1天 (F₅=19.475, P=0.012)，处理组测定结果与对照差异显著；处理后12 h (F₅=62.058, P=0.001)、3天 (F₅=33.333, P=0.004)、5天 (F₅=77.212, P=0.001)、7天 (F₅=122.283, P < 0.001)，处理组测定结果与对照差异极显著。

2.3 氧化苦参碱对台湾乳白蚁BG活性的影响

由表 3可见，处理组BG活性均低于对照。处理后6 h (F₅=9.282, P=0.038)、1天 (F₅=11.558, P=0.027)、3天 (F₅=18.868, P=0.012)，处理组测定结果与对照差异显著；处理后12 h (F₅=66.627, P=0.001)、5天 (F₅=54.559, P=0.002)、7天 (F₅=342.264, P < 0.001)，处理组测定结果与对照差异极显著。

2.4 氧化苦参碱对台湾乳白蚁CBH活性的影响

由表 4可见，处理组CBH活性均低于对照。除处理后6 h的测定结果无显著差异 (F₅=2.148, P=0.217) 外，处理后12 h (F₅=10.915, P=0.030)、1天 (F₅=8.522, P=0.043)、3天 (F₅=10.196, P=0.033)、5天 (F₅=12.972, P=0.023)、7天 (F₅=16.830, P=0.015) 的测定结果均与对照差异显著。

2.5 氧化苦参碱对台湾乳白蚁纤维素酶活性抑制率的影响

氧化苦参碱对台湾乳白蚁FPA、EB、BG、CBH酶活性的抑制率见表 5，整体表现为FPA＞EG≥BG＞CBH。除3天及5天的EG抑制率、3天BG抑制率、12 h CBH抑制率外，整体抑制效果均随处理时间的延长而增强。

本研究表明，氧化苦参碱对台湾乳白蚁的纤维素酶活性具有抑制作用，对FPA和EG、BG、CBH活性均有一定的抑制效果，其中最大抑制率为5天的FPA抑制率53.76%±4.86%，分别高于7天的EG、BG和5天的CBH活性最大抑制率33.62%±1.39%、34.37%±0.70%、22.59%±4.01%，说明氧化苦参碱对于纤维素酶系统整体抑制效果更明显。

2.6 氧化苦参碱对台湾乳白蚁质量和死亡率的影响

表 6可见，对照组和处理组白蚁的初始质量无显著差异 (F₅=0.165, P=0.705)，处理7天后，处理组的质量显著低于对照组 (F₅=1 075.109, P < 0.001)，其死亡率显著高于对照组 (F₅=78.400, P=0.001)。处理组白蚁的活动水平弱于对照组。

3 讨论

白蚁已进化出独特而高效的消化系统，能够依靠自身和共生微生物分泌的纤维素酶降解食物中的纤维素类成分 (Nakashima et al., 2002；杨天赐等，2006)，低等白蚁可借以维持全部的生长发育需求 (Watanabe et al., 2010)。目前，化学防治仍然是白蚁最普遍、最主要的防治方法，但对白蚁安全防治技术的探索从未停止，其中包括植物源白蚁药剂的研究 (Chouvenc et al., 2011)。纤维素酶具有广谱或专性的抑制剂，广泛存在于自然界中 (Mandels et al., 1965)，因此，寻找天然纤维素酶抑制剂，通过抑制纤维素酶活性干扰白蚁新陈代谢，达到防治目的，是一种值得探索的防治理念。

氧化苦参碱和苦参碱作为从豆科植物苦参中提取的喹嗪啶类生物碱，具有显著的生物活性，在医学、农业上已得到了广泛应用。在植物体内氧化苦参碱为较稳定的天然存在形式，其与苦参碱在提取后也存在着相互转化 (Lu et al., 1996；罗万春等，1997)。氧化苦参碱和苦参碱对于昆虫的乙酰胆碱酯酶活性有明显的抑制作用和拒食活性 (罗万春，1995)，Du等 (2004)研究表明苦参碱对棉铃虫(Helicoverpa armigera)钠通道具有浓度依赖性阻滞作用，但目前并无阐明氧化苦参碱对于纤维素酶消化的抑制作用机制是使蛋白变性或抑制分泌，因此苦参提取物的作用机制还有待进一步研究。

4 结论

氧化苦参碱对白蚁具有一定的胃毒作用，本研究结果说明氧化苦参碱对纤维素酶活性的抑制是其作用机制之一。研究表明白蚁取食量随着氧化苦参碱浓度的提高而减少，高浓度氧化苦参碱将引起白蚁取食量显著降低 (Mao et al., 2007)，氧化苦参碱浓度太低在实际应用中将影响防治效果，0.1%~1%的氧化苦参碱可能是适宜的应用浓度。因此，将苦参植物提取物与诱食饵料结合，可研制白蚁抑食剂及消化干扰剂，作为诱杀饵剂应用于白蚁的防治。