杨树是重要的绿化能源树种，大力发展杨树产业，对于丰富森林资源、改善自然生态环境大有裨益(刘敏等，2014)。杨树在我国主要分布于华北、西北等干旱和半干旱地区(孙梅霞等，2004)，干旱不仅会影响叶片的光合速率、枝条生长速率和干物质积累，也会使杨树干物质量减轻、材积减少，从而制约着杨树的速生丰产(何梅等，2015)。干旱往往与高盐度引起的渗透胁迫有关，影响杨树的生长和产量。杨树作为重要的木本模式植物，在抗旱、抗高盐等抗逆境胁迫等分子遗传改良方面的研究成效显著。随着基因工程技术的不断发展，抗逆基因的研究也越来越受到大家的青睐。而如何准确地检测与分析抗逆基因的表达水平对于杨树抗逆优良植株的分子选育工作至关重要。

实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)是最常用、最快速、最简单的基因表达水平定量分析的方法，它不仅能分析基因在不同生长时期、不同组织器官及不同环境条件下的样本间基因表达量的差异，而且相较于以往的分子技术具有更宽泛的动态范畴(Gachon et al., 2004；Nolan et al., 2006；Wong et al., 2005)。也正是这些优点使得它对内参基因的选取十分严苛(Bustin, 2000)。由于在PCR过程中的各种差异，结果的校正和标准化仍然是最具挑战性的问题(Guénin et al., 2009)，使用内参基因可以灵敏地修正RNA起始量和反转录效率等的差异(Udvardi et al., 2008)，进而获取靶基因特异表达的真差，因而被认为是最合适的标准方法(Huggett et al., 2005)。

理想的内参基因应当在任何情况下都能够稳定表达。由于看家基因是细胞的重要组分，且表达稳定，因此在实时荧光定量PCR表达分析中是最常用的内参基因。甘油醛磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate, GAPDH)、肌动蛋白(Actin)、泛素(ubiquitin, UBQ)、泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme, UBC)、18S核糖体RNA(18S rRNA)、25S核糖体RNA(25S rRNA)、转录延伸因子(elongation factor 1 alpha, EF1α)、微管蛋白(tubulin beta, TUB)和翻译延长因子(translation elongation factor, TEF)等看家基因常被用来作为内参基因校正目的基因的表达(Kim et al.，2003)。研究(Mehdi et al., 2012)发现，在红车轴草(Trifolium pratense)叶片中，UBC2和UBQ10表达最稳定；在茎中，UBC2和YLS8表达较为稳定；在根中，EIF-4α和UBC2表达稳定。然而，由于植物发育阶段和试验条件的不同，大多数看家基因的表达量也会有所变化(Suzuki et al., 2000；Thellin et al., 1999；Vandesompele et al., 2002)。目前，仍未鉴定到一个广谱的内参基因适用于所有基因和条件(Schmittgen et al., 2000)。为保证基因表达水平分析的准确性，现大都采用双内参基因的方法。然而，为了降低这种方法带来的数据处理的难度以及减少试剂的消耗，研究者坚持在寻找一个在大多数情况下表达稳定的内参基因。随着生物信息学的发展，通过基因芯片技术和转录组测序技术可以全面快速地获得基因在不同组织和生长时期下的表达信息，这为筛选时空表达谱下稳定表达的基因作为广谱性内参基因提供了一种有效方法，而这种方法仍未在木本植物中广泛应用。

为了提高实时荧光定量PCR数据的准确性，筛选合适的内参基因就显得尤为重要。目前，Actin, PtUBQ, 18S rRNA, EF1α, TUB8和PtUKN1常被作为内参基因应用于杨树的实时荧光定量PCR分析中。本研究系统分析了这6个传统的内参基因和通过基因芯片技术筛选得到的6个新内参基因(PtRG1-PtRG6)在NaCl及PEG处理下的南林95杨(Populus deltoides ‘Nanlin95’)组培苗叶中的表达，荧光定量PCR获得的数据经geNorm(Vandesompele et al., 2002)、NormFinder(Andersen et al., 2004)和BestKeeperet(Pfaffl et al., 2004)3个统计学软件分析从而评价候选内参基因的稳定性。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验材料为生长4周、株高约10 cm的南林95杨组培苗，培养条件为每天光照16 h，光照强度30 lx，室温(25±3) ℃。

1.2 试验方法 1.2.1 杨树叶片总RNA的提取、质量检测和反转录

1) 选取约10 cm高的南林95杨组培生根苗，分别对其叶片进行盐和干旱诱导处理。诱导处理方法为：25% PEG喷洒叶片处理0，1，4，8，12，24 h，200 mmol·L^-1 NaCl喷洒处理0，1，4，8，12，24 h，对照苗木喷洒等量的纯净水。叶RNA的提取采用Trizol方法(Bio Basic Inc)。为了使试验结果更准确，均进行3次生物学重复和4次技术重复。

2) 完整性检测：将SYBRGreenⅠ, Loading Buffer和RNA按1:2:5体积比混匀，使用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳，使用凝胶成像系统拍摄照片并保存。纯度和含量的检测：吸取1 μL总RNA滴加到微量分光光度计探头，进行检测。一般OD₂₆₀/OD₂₈₀介于1.8~2.0且电泳条带清晰无杂带，提取的总RNA质量合格。

3) RNA反转录成cDNA：利用TAKARA公司反转录试剂盒PrimeScript TM RT Master Mix(R036A)将提取的RNA反转录成cDNA。

1.2.2 新内参基因的筛选

1) 从已公布的数据库中获取杨树叶片在不同的生长发育时期(编号为GSE13990)、不同的处理条件下的基因芯片数据(编号为GSE15242，GSE21171，GSE23637)。

2) 利用昂飞公司开发的归一化基因芯片数据的软件Expression Console，对4个芯片数据进行归一化处理。首先，通过软件提供的MAS5算法计算出所有数据的P值，筛选P < 0.05的探针；再利用软件提供的RMA算法计算出所有探针在不同试验条件下的信号表达值及变异系数(CV)。综合考虑每个探针的P和CV值，对探针进行排序。

3) 以探针的P < 0.05、CV值越小越好为原则，初步鉴定内参基因。

4) 根据内参基因的功能预测，进一步筛选功能保守的基因。

5) 通过检索公开数据库，确保筛选的内参基因在相关研究中未有报道，最终筛选出了6个候选内参基因，按照染色体位置排序，分别命名为PtRG1, PtRG2, PtRG3, PtRG4, PtRG5和PtRG6。

1.2.3 引物设计

除了通过基因芯片技术筛选出的6个候选内参基因外，本研究还选择了PtUKN1, PtUBQ, Actin, EF1α, 18S rRNA和TUA8这6个传统内参基因进行对比研究。用Primer5.0软件设计引物，参数设置如下:扩增长度80~200个碱基对，引物序列长度17~25个碱基，GC含量45%~55%，正向引物和反向引物的退火温度差值的绝对值小于3 ℃。引物由上海生工工程公司合成，详细情况见表 1。

1.2.4 实时荧光定量PCR分析

使用Bio-Radi Cycler IQ实时定量PCR仪和96孔板，选用大连宝生物工程有限公司的SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行基因的表达分析。每个孔按照20 μL体系添加样品：1 μL模板cDNA，1 μL上游引物(10 μmol·L^-1)，1 μL下游引物(10 μmol·L^-1)，10 μL 2× SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ, 7 μL无菌水。每个样品重复4次。扩增反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火18 s，72 ℃延伸15 s，39个循环，采集溶解曲线荧光信号。试验数据采用相对定量法分析。

1.2.5 数据整理与分析

首先通过Bio-Rad iQ5软件，导出经过不同处理的南林95杨组培苗叶片的C_t值。然后根据公式Q=E^{(minCt -sampleCt)}(Livak et al., 2001；Schmittgen et al., 2008)计算出试验样品中每一个基因的相对表达量(E为基因的扩增效率，E值取2，minC_t为最小C_t值，sampleC_t为各基因的C_t值)，然后将该数据分别导入至geNorm和NormFinder软件中，对基因表达的稳定性进行分析。BestKeeper软件可直接对样品的C_t值进行分析。

2 结果与分析 2.1 RNA的质量评价

使用DNase Ⅰ处理RNA样品后，经过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测未发现杂带，说明所提取的RNA未降解。通过Nanodrop ND-1000紫外分光光度计检测样品的OD值(OD₂₆₀/OD₂₈₀)均在1.8~2.0之间，且为单峰曲线，这表示样品的纯度和完整性符合试验要求。

2.2 引物特异性验证

通过对实时荧光定量PCR溶解曲线的分析，发现各内参基因都只产生单溶解峰(图 1)，这表示设计的引物特异性良好，实时荧光定量PCR反应的专一性高，试验结果可信度高。

2.3 盐和干旱胁迫下内参基因稳定性分析 2.3.1 C_t值分析

实时荧光定量PCR的C_t值是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，它能直观地反映出基因的表达量大小，基因的表达量与C_t值成反比关系。实时荧光定量PCR的结果表明，在NaCl和PEG处理下，12个内参基因中C_t值最小的基因均为18S rRNA，表达量最大；而PtUKN1的C_t值最大，表达量最小。其他基因的C_t值介于15~35之间。这说明在相同的条件下，不同的内参基因表达量有所差异；而在盐和干旱处理不同时间后，这12个内参基因自身的表达量也存在差异。

2.3.2 geNorm分析

geNorm程序是利用M值(平均表达稳定指数)评价内参基因的稳定性，即geNorm会通过计算出的M值对基因的稳定性进行排序，M值越低则表示基因的表达越稳定。如果某个基因的M值小于1.5，那么该基因可以作为备选的内参基因(Vandesompele et al., 2002)。geNorm软件分析表明，在NaCl处理下，内参基因的稳定性从高到低排序为PtRG2=PtRG3> PtRG4> PtRG1> PtRG5> PtRG6> TUA 8> PtUKN1 >EF1α> Actin>PtUBQ>18S rRNA，其中PtRG2, PtRG3, PtRG4, PtRG1, PtRG5, PtRG6的M值均低于或接近1.5，表明它们相对较为稳定(图 2A)。

在PEG处理下，内参基因的稳定性从高到低排序为PtRG3=PtRG5> PtRG1> PtRG6> TUA8> PtRG4> PtRG2> EF1α> PtUBQ> Actin> PtUKN1> 18S rRNA，其中6个基因PtRG1, PtRG3, PtRG4, PtRG5, PtRG6, TUA8的M值均小于1.5，表明它们的表达较为稳定，且PtRG3, PtRG5的M值最小，表示它们相对于其他基因来说表达更为稳定(图 2B)。

综上所述，发现PtRG3在NaCl和PEG处理下表现均为最稳定，适宜做内参基因；此外，与传统的看家基因相比较，通过基因芯片技术筛选得到的新内参基因更为稳定。

2.3.3 NormFinder分析

NormFinder软件是通过EXCEL软件计算基因的稳定指数M，M值越低，则该基因的表达越稳定。

在NaCl处理下，12个候选基因的M值如表 2所示，其稳定性按从高到低依次排序。TUA8的M值最低，稳定性最好；18S rRNA的M值最高，稳定性最差。此外，发现新内参基因的稳定性相对传统内参基因排名靠前，前5个基因中仅有1个传统内参基因TUA8。

在PEG处理下，12个候选基因的M值如表 3所示，其稳定性按从高到低依次排序。其中PtRG1的M值最低，稳定性最好；而18S rRNA的M值最高，稳定性最差。同时发现，与在NaCl处理下的情况相似，新内参基因的稳定性相对传统内参基因排名靠前，前5名中仅只有1个传统内参基因TUA8，只是排名的顺序有所不同。

2.3.4 BestKeeper分析

BestKeeper程序可以直接使用内参基因的C_t值，并经过EXCEL软件计算得到标准差SD。SD值与基因的稳定性成负相关性。在NaCl和PEG处理下，稳定性最好的基因均为PtRG5，稳定性最差均为18S rRNA，其他基因的稳定性排序略有不同(表 4，表 5)。同时也发现，新内参基因相对传统看家基因稳定性更高。

2.3.5 内参基因稳定性验证

为了验证PtRG1, PtRG3和PtRG5是否适宜作为杨树在盐和干旱胁迫下的内参基因，分别以PtRG1, PtRG3和PtRG5为内参基因，运用qPCR法分析了受盐和干旱胁迫诱导表达的3个杨树VQ基因(PtVQ6, PtVQ13, PtVQ37)(Chu et al., 2016)的相对表达量。发现以PtRG1, PtRG3和PtRG5为内参基因时，在盐和干旱胁迫下各个时间段的表达变化趋于一致(图 3、图 4)，且其结果与Chu等(2016)的研究结果基本一致，均表明PtRG1, PtRG3和PtRG5能够稳定表达，这将为进一步研究杨树VQ基因的功能奠定基础。

3 讨论

实时荧光定量PCR技术作为常用的基因表达分析方法，其内参基因的选择至关重要，合适的内参基因能更好地校正试验数据，减小误差。理想的内参基因应当在任何情况下都表达稳定，然而许多研究表明这样的理想内参基因是不存在的。不同的细胞、不同的生长阶段、不同的生长环境，内参基因的表达也不同(Hu et al., 2009；Die et al., 2010)。苏晓娟等(2013)发现，杨树在锌胁迫下ubiquitin, EF1α, 18S rRNA和Actin的稳定性较好，GAPDH的稳定性最差；Lovdal等(2009)发现在氮缺乏，低温和弱光胁迫的番茄(Solanum lycopersicum)叶片中ACT最适宜作为内参基因。这些研究结果证实了在不同的胁迫条件下，所选择的内参基因也不尽相同。因此，本文对杨树在盐和干旱胁迫下内参基因的选择问题进行了深入的研究，以筛选出在这2个处理下表达稳定的内参基因。

选择看家基因作为实时荧光定量PCR表达分析中的内参基因是普遍得到共识的，但看家基因在不同的试验条件下表达也会有很大的差异，前期的研究结果已经表明，常用的内参基因在一定条件下由于不稳定性的表达不适合作为内参基因，它们已逐渐被新的参考基因所取代。而新内参基因的发掘可以通过基因芯片的表达数据筛选得到，目前基因芯片技术仍未在木本植物中广泛应用，使得并不适合所有试验条件的传统内参基因仍被不少研究者沿用。为了找到更合适的内参基因，在本研究中，通过基因芯片技术筛选出了6个新内参基因。目前，关于这6个基因的功能未有报道，通过基因编码蛋白的保守结构域以及功能预测分析，发现它们主要参与维持细胞基本功能的作用(表 1)。为了比较内参基因的稳定性，将传统的内参基因与本研究中通过基因芯片筛选的内参基因进行实时荧光定量PCR试验，从而选择一种合适的内参基因用于校正目的基因的表达量。

为了进一步比较这12个待定的内参基因在盐和干旱胁迫下的稳定性，本研究使用geNorm, NormFinder和BestKeeper这3个软件进行统计学分析，结果表明：通过基因芯片技术筛选得到的新基因比传统看家基因更稳定，其中geNorm软件分析得出PtRG3在盐胁迫和干旱胁迫下表现均为最稳定，最适宜做内参基因；NormFinder软件分析得出在盐胁迫下，TUA8稳定性最好，最适宜做内参基因，而在干旱胁迫下，PtRG1的稳定性最好，最适宜做内参基因；BestKeeper程序分析得出在盐胁迫和干旱胁迫下，PtRG5稳定性最好，最宜做内参基因。这3款软件分析得出的结果略有不同，这种不一致性可能是由于计算机软件的统计学算法不同及试验数据的误差造成的。geNorm程序是通过两两对比的方式，同时对2个以上候选基因进行筛选，从而筛选得到2个以上的内参基因，geNorm程序可以减小系统误差，使数据更加准确，尤其对微小表达差异的基因的表达研究具有十分重要的意义；NormFinder程序能够对2个变异的来源进行平衡，但无法规避样品制备过程中存在的系统误差，这种统计分析方法适用于无法适当地细分样品的数据统计；BestKeeper程序是根据数据的离散程度来分析基因的稳定性，但极端值对结果的影响很大，且无法规避系统误差。

4 结论

在盐胁迫和干旱胁迫下，通过基因芯片技术筛选出的新内参基因表达稳定，丰富了杨树内参基因的选择。其中，PtRG1, PtRG3和PtRG5相较于传统内参基因更适合作为杨树在盐和干旱胁迫下实时荧光定量PCR的内参基因。