笃斯越橘(Vaccinium uliginosum)为杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)多年生落叶小灌木，集中分布于我国大、小兴安岭及长白山地区，抗寒性极强，营养价值极高，是极具开发价值的天然寒地浆果资源(伏鸿峰，2013)。在大兴安岭的林间空地、针叶、阔叶及混交林中有大面积的笃斯越橘分布，丰产期果实年产量每公顷可达数十万吨，具有“越橘之乡”之美誉(刘金江，2013)。近年来，由于气候变暖、林火频发以及人们对笃斯越橘高营养价值的青睐引起的破坏性采摘等原因，使得笃斯越橘分布面积和产量大幅下降，种质多样性逐渐减少，极大的限制了我国笃斯越橘的资源保护、开发利用和产业化发展(王贺新等，2012)。

杜鹃花科植物根系在自然生境中可与土壤真菌形成一种特殊类型的互惠共生体，即杜鹃花类菌根(ericoid mycorrhizal, ERM)，对宿主植物不但没有损伤作用(Koron et al., 2000; Carrillo et al., 2015)，还可激发宿主植物对生物和非生物胁迫的防御机制(Brundrett, 2002; Scagel, 2005; Pigna et al., 2013)。为探讨ERM真菌在笃斯越橘栽培及繁育中的积极作用，Powall等(1984)用锤舌菌属(Hymenoscyphus)的H. ericae菌株接种高丛越橘(Vaccinium corymbosum)后，宿主生长量及果实产量明显增加；Korno等(2000)用树粉孢属(Oidiodendron)的O. rhodogenum和O. griseum接种1年生越橘(Vaccinium corymbosum)后，宿主叶面积和干质量较对照明显增加。上述研究为了解ERM真菌对笃斯越橘的回接效应提供了参考，但对于特殊立地类型的笃斯越橘根系内生真菌多样性尚不清楚，况且内生真菌为专性共生菌，必须依靠与宿主植物建立共生关系并从中获取宿主光合产物以维持正常生长和发挥其功能(Burggraaf et al., 1989)，研究内生真菌侵染对笃斯越橘矿质元素的影响是明确内生真菌与宿主植物共生的关键因素。对于笃斯越橘根系内生真菌多样性分析，以往多采用的传统分离培养法存在自身局限性，一方面是部分真菌目前尚不能人工分离培养(袁继鑫，2013)，其次是分离过程中不同消毒时间分离得到的真菌数量差异显著(何映霞等，2008)，现代生物学高通量测序技术(ITS)为全面准确地了解特殊立地环境中的微生物多样性提供了便利(Hultman et al., 2015)。因此，本研究在分子生物学鉴定和侵染特性分析相结合的基础上，进一步探究笃斯越橘根系内生真菌侵染率与宿主矿质元素的相关性，旨在为研究内生真菌与宿主植物共生的生态学意义及合理开发利用笃斯越橘内生真菌资源提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验区域概况及样品采集

2015年8月，选取大兴安岭地区笃斯越橘集中分布的3种立地类型进行调查分析，每种立地类型布设3个20 m×20 m的样地，每个样地选取1 m×1 m的标准样方进行调查并采样，同时记录各样地的采集信息(表 1)，参照尹德洁等(2011)的分类标准，将3种立地类型分为水湿地有土壤类型、水湿地无土类型、山地类型，由于本研究区域水湿地无土类型中永冻层距离地表较近，除大多根系分布于苔藓层外，部分根系直接与永冻层接触，因此在尹德洁等(2011)分类标准的基础上，根据实地环境特点将其命名为水湿地冻土类型。其中，水湿地有土壤类型根系层主要为腐殖质和沼泽土，主要伴生植物为兴安落叶松(Larix gmelinii)、白桦(Betula platyphylla)、红豆越橘(Vaccinium vitis-idaea)、杜香(Ledum palustre)、忍冬(Lonicera caerulea)、柴桦(Betula fruticosa)；水湿地冻土类型根系层主要为苔藓，主要伴生植物为落叶松、红豆越橘、杜香、柴桦、杜鹃(Rhododendron simsii)；山地类型根系层为少许腐殖质和含有石块的棕壤土，该立地类型中森林资源较丰富，主要伴生植物除水湿地有土壤类型的6种外，其伴生植物还有杜鹃。

在每个样方内随机采集5株长势良好的笃斯越橘及根系分布层土壤，剪取部分直径为0.5~1 mm的笃斯越橘根系洗净混匀后，一部分固定于多聚甲醛固定液中，用于内生真菌的侵染率计算及侵染结构观察；一部分保鲜盒冷藏，带回实验室储存于-80 ℃冰箱，用于内生真菌多样性分析；剩余根系及植株地上部全部带回实验室，用于植株矿质元素含量测定；土壤样品拣出杂质后带回实验室自然晾干，用于土壤矿质养分测定。

1.2 笃斯越橘根系内生真菌多样性分析 1.2.1 根系样品总DNA提取

取-80 ℃冰箱保存的根系，使用PowerSoil DNA Isolation Kit(Mibio，美国)试剂盒并参照说明书进行样品根系总DNA提取，-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增

真菌ITS1区的扩增采用引物ITS1-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。扩增体系(50 μL)：模板DNA30 ng；正反向引物(10 μM)各2 μL；4 μL dNTPs(2.5 mmol·L^-1)；5 μL 10×Pyrobest Buffer；0.3 μL Pyrobest DNA Polymerase(2.5 U·μL^-1, Takapa D Code: DR0055A)；无菌ddH₂O补足至50 μL。扩增程序：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，25个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃恒温保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测(电压：150 V；电泳时间：30 min)，-20 ℃保存备用。

1.2.3 单个样品复杂性分析

基于OTUs(operational taxonomic units)的分析结果，试验对单个样品进行alpha多样性分析。真菌多样性可用alpha多样性来表示，其alpha多样性包括Shannon index(H′)，Phylogenetic diversity(PD, whole tree)和Observed number of species。其中，Observed number of species是用来表示实际观测到的OTUs数目；Shannon index是用来评估反应内生真菌的物种数量及其分布的均匀度；Shannon index指数越大，物种越丰富。

1.3 测定指标及方法

多聚甲醛固定液中固定的根系顺序经10% KOH脱水透明、1% HCl酸化处理后，使用0.02%台盘蓝染色，在光学显微镜下观察内生真菌侵染结构和计算真菌侵染率(Chapman, 1992)。

将自然风干的土壤样品除尽杂质后过筛分级备用，用于测定土壤全N(凯式定氮法)，碱解N(碱解扩散法)，全P(NaOH熔融-钼锑抗比色法)，有效P(NaHCO₃浸提-钼锑抗比色法)，全K、速效K(原子吸收火焰法)。笃斯越橘植株(地上部、地下部)在105 ℃杀青后恒温至80 ℃烘干，经粉碎、过筛后用于测定全氮(N)(凯式定氮法)，全磷(P)(NaOH熔融-钼锑抗比色法)，全钾(K)、钠(Na)、钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe)、锰(Mn)、锌(Zn)、铜(Cu)(原子吸收火焰法)(鲍士旦，2005)。采用Excel 2003处理原始数据，采用SAS 9.2软件对试验数据进行整理统计分析，对真菌侵染率与宿主矿质养分的关系进行相关性分析。

2 结果与分析 2.1 3种立地类型中笃斯越橘根系内生真菌多样性比较

笃斯越橘根系内生真菌多样性如图 1、2所示。Alpha多样性分析表明，3种立地类型中笃斯越橘根系内生真菌OTUs在468~789之间(图 1A)，以水湿地冻土类型最高，山地类型次之，水湿地有土壤类型最低；3种立地类型中的shannon index为H′=3.58~4.36(图 1B)，其中水湿地冻土类型H′=4.36，水湿地有土壤类型H′=3.58，说明水湿地冻土类型内生真菌最丰富。如图 2所示，3种立地类型中鉴定出Phialocephala、Meliniomyces、Rhizoscyphus、Tomentella、Archaeorhizomyces、Cistella、Parmella、Oidiodendron、Clavaria 9属真菌，同一菌属在不同立地类型中所占比例各异，其中山地类型和水湿地有土壤类型以Phialocephala为优势真菌，所占比例分别为40.1%、51.2%，水湿地冻土类型以Meliniomyces为优势真菌，所占比例为49.2%，以上两类优势菌均属于子囊菌(Hambleton et al., 2005; 邓勋等，2015)，说明笃斯越橘根系内生真菌以子囊菌为优势菌。同时，由图 2还可以看出，部分内生真菌表现出了明显的立地类型特异性，如Cistella真菌仅分布于山地类型，占比2.53%，Tomentella真菌仅分布于水湿地冻土类型，而山地类型中未检测出Meliniomyces真菌，为水湿地冻土类型中的优势菌属(49.2%)，水湿地有土壤类型中未检测出Oidiodendron真菌。

2.2 笃斯越橘根系内生真菌侵染特性

3种立地类型中笃斯越橘根系内生真菌侵染率差异显著(P < 0.05)(图 3)，以水湿地冻土类型最高(68.09%)，山地类型次之(62.33%——水湿地有土壤类型最低(54.98%)，这可能是因为水湿地冻土类型中笃斯越橘根系内生真菌多样性最丰富(图 1C)，推测不同菌株间的相互作用可能对宿主植物的侵染具有促进作用。显微观察发现，3种立地类型中均有根外菌丝(图 4A)、胞间有隔菌丝(图 4B)、胞内菌丝团(图 4D)、表皮细胞缺失现象(图 4E)，而水湿地有土壤类型和山地类型中还出现胞间无隔菌丝的侵染结构(图 4C)，5种侵染结构中根外菌丝在3种立地类型中出现的频次均最高。胞内菌丝团作为杜鹃花类菌根的典型侵染结构(Peterson, 1980)，说明本研究区域的3种立地类型中笃斯越橘根系存在典型的菌根真菌侵染体；而表皮细胞缺失现象可能是菌丝侵染宿主根系细胞一段时间后，根系中细胞原生质膜破裂，细胞内含物分解导致细胞缺失。

2.3 笃斯越橘矿质营养及根系分布层土壤养分状况 2.3.1 笃斯越橘常量元素含量

3种立地类型中笃斯越橘地上部、地下部常量元素含量分析结果(图 5)显示，除Na和地上部P元素外，不同立地类型中笃斯越橘地上部、地下部矿质元素含量均存在显著差异(P < 0.05)，其中，地上部N、Ca元素含量高且差异较大，均以水湿地冻土类型含量最高，水湿地有土壤类型含量最低，而地上部及地下部Mg元素含量却以水湿地有土壤类型最高，地上部以水湿地冻土类型最低(0.09%)，地下部以山地类型最低(0.07%)。由图 5可知，水湿地冻土类型的笃斯越橘地上部、地下部N、P、K、Ca元素含量显著高于其余2种立地类型，而水湿地有土壤类型中地上部N、K、Ca，地下部N、P元素含量均最低，总体而言，水湿地冻土类型的植株矿质元素含量较其余2种类型高，水湿地有土壤类型总体较低，说明立地类型对笃斯越橘吸收矿质元素的影响较大。

2.3.2 笃斯越橘微量元素含量

由图 6可知，水湿地有土壤、水湿地冻土及山地3种立地类型中笃斯越橘地上部和地下部Mn元素含量均较高，但差异不显著，其含量在742.88~776.81 mg·kg^-1之间。除Mn和地下部Cu元素外，其余3种微量元素(Fe、Zn、Cu)含量在不同立地类型中差异显著(P < 0.05)，其中水湿地冻土类型中地上部及地下部Fe元素含量均最高(地上部397.98 mg·kg^-1，地下部593.31 mg·kg^-1)，而Zn元素含量则最低；水湿地有土壤类型中地上部及地下部Fe、Cu元素含量均最低，而Zn元素含量则最高，由此可知，笃斯越橘吸收微量元素具有地域间差异。

2.3.3 根系分布层土壤养分含量

由图 7可知，3种立地类型的笃斯越橘根系分布层土壤中，水湿地冻土类型的全N、全P、碱解N、有效P含量均最高，而全K和速效K含量则最低；山地类型中的养分含量状况则与水湿地冻土类型相反，即呈现全K、速效K含量最高，全N、全P、碱解N、有效P含量均最低。3种立地类型中，除全K和有效P外，其他各种养分在3种立地类型中均呈现不同程度的差异水平，其中，山地类型的全N含量与水湿地有土壤类型和水湿地冻土类型差异显著(P < 0.05)，水湿地冻土类型的全P含量与水湿地有土壤类型和山地类型差异显著(P < 0.05)。此外，水湿地有土壤类型中的碱解N、有效P、速效K含量分别为对应全效养分的8.99%、17.7%、6.9%；水湿地冻土类型中的碱解N、有效P、速效K含量分别为对应全效养分的9.66%、14.51%、6.79%；山地类型中的碱解N、有效P、速效K含量分别为对应全效养分的12.17%、15.61%、7.42%，由此可知，水湿地冻土类型中有效P、速效K占对应全效矿质元素的比例均最低，说明该立地类型中可供植物吸收利用的有效养分含量相对较低。

2.4 笃斯越橘矿质元素间及其与根系内生真菌侵染率的关系

对笃斯越橘矿质养分和宿主植物根系内生真菌侵染率的相关性分析(表 2)发现，笃斯越橘植株N、P、K、Ca、Fe元素间呈显著或极显著正相关，但均与Zn元素呈极显著负相关；此外，Na元素与Mg元素显著正相关，Ca元素与Mn元素显著负相关。笃斯越橘植株矿质元素含量与宿主植物根系内生真菌侵染率的相关性分析结果(表 2)显示，宿主植物根系内生真菌侵染率与植株N、P、K、Ca、Fe元素呈极显著正相关，与Zn元素呈极显著负相关(r= -0.944^**)。由此可知，笃斯越橘体内N、P、K、Ca、Fe元素间可能具有一定的相互促进作用，而对Zn元素具有一定的抑制作用；根系内生真菌侵染可以促进笃斯越橘植株对N、P、K、Ca、Fe元素的吸收，对Zn元素的吸收可能具有一定的限制作用。

3 讨论 3.1 笃斯越橘根系内生真菌多样性

大兴安岭地区3种立地类型中笃斯越橘根系内生真菌多样性shannon index在3.58~4.36之间(图 1)，远高于已报道的南极苔藓(H′=0.91~1.99)(Zhang et al., 2013)、维管植物(H′=1.44)(Rosa et al., 2010)和野生青檀(Pteroceltis tatarinowii) (H′=2.05~2.32)(Chai et al., 2011)，说明大兴安岭地区笃斯越橘根系内生真菌较为丰富，而不同立地类型中笃斯越橘根系内生真菌具有一定的立地类型特异性，如Cistella属真菌仅在山地类型出现，Tomentella属真菌仅出现于水湿地冻土类型，可能是因为内生真菌对笃斯越橘根系的侵染与不同时空环境及土壤等条件的变化有关(杨秀丽，2010)。为深入探讨土壤理化性质对笃斯越橘根系内生真菌侵染特性的影响，本研究对3种立地类型中的土壤理化性质(全N、全P、全K、碱解N、有效P、速效K)进行了测定，发现3种立地类型中，除全K和有效P外，其余土壤养分在3种立地类型中呈现不同程度的显著性水平(图 7)，说明不同立地类型中土壤养分差异使得笃斯越橘根系生理状况及化学组成发生了变化(Carroll, 1988)，从而对部分内生真菌的侵染产生地域特异性。ITS分析得到的9属内生真菌中，先前研究从杜鹃花科植物根系中分离得到Oidiodendron和Meliniomyces属真菌(Berch et al., 2002; Bougoure et al., 2005)，并且Phialocephala属真菌作为宿主植物根际重要的益生菌，具有促进宿主植物生长及增强宿主植物抗性等作用(邓勋等，2015)；Phialocephala、Meliniomyces、Oidiodendron、Cladophialophora、Devriesia、Cryptosporiopsis、Clavaria等真菌也相继从不同宿主植物中分离得到(Peterson et al., 1980; Fisher et al., 1984; Seifert et al., 2004; Hambleton et al., 2005; Vohník et al., 2005; Davey et al., 2007; Kowalski et al., 2011)，说明本研究区域的笃斯越橘资源是后续研究中选择分离材料的较好样本。此外，冻土环境中由于土壤受到低温、供氧限制及养分可利用性等极端因素的影响，大部分生长于冻土环境中的生物很大程度上是依靠根系微生物活性来适应逆境环境(D’Amico et al., 2006; Buzzini et al., 2012; Jansson and Tas, 2014; Beat et al., 2016)，本研究结果中水湿地冻土类型的内生真菌多样性最丰富与上述研究结果较一致，推测大兴安岭地区笃斯越橘根系内生真菌是影响笃斯越橘生长的重要因素。

3.2 笃斯越橘根系内生真菌侵染特性

宿主根系不但是共生真菌的生长载体，还为共生真菌的生长提供必要的生长物质，而共生真菌可从土壤中吸收矿质养分供宿主植物生长而被誉为“生物肥料”(刘润进等，2007)。本研究表明，3种立地类型中笃斯越橘根系内生真菌侵染率均较高且差异显著(P < 0.05)，与前人研究结果较一致(Goulart et al., 1993; 袁继鑫，2013)，可能是本研究区域内生真菌多样性较丰富(图 1)，不同菌属间的相互作用提高了侵染率；而水湿地冻土类型中侵染率最高，可能是因为该立地类型中苔藓物质较多，苔藓中较多的活性物质有利于真菌侵染宿主根系(唐雪东等，2005)。此外，显微观察结果表明，3种立地类型中存在根外菌丝、胞内有隔菌丝、胞内无隔菌丝、胞内菌丝团、表皮细胞缺失现象等，说明不同真菌在笃斯越橘根系中可能形成不同的侵染结构，而3种立地类型中均以根外菌丝的侵染结构最丰富，根外菌丝在土壤中可形成类似于网络结构的庞大菌丝体，菌丝可将各种植物的根系连接在一起，使宿主植物之间进行物质交换、能量流动、信息传递，同时还可以改善土壤的物理化学性状，从而提高土壤稳定性，增加土壤肥力，改善植物根系生长状况(Miransari, 2010)。因此，后续试验中可选取本研究区域的笃斯越橘根系作为研究材料，通过分离培养手段获得此类真菌，以此作为微生物菌肥应用于笃斯越橘栽培中，降低笃斯越橘的栽培成本和减轻对环境的污染(Carrillo et al., 2015)。

3.3 笃斯越橘矿质营养特性及其与内生真菌侵染率间的相关性

菌根真菌对植物的促生长作用已被广泛研究，如外生菌根(Ectomycorrhiza, ECM)可促进马尾松对N、P、K元素的吸收及利用(高悦等，2009)；丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza, AM)能够显著促进湖北海棠实生苗对P、Zn、Cu元素的吸收(Liu, 2005)；Morandi等(1986)接种杜鹃花类菌根真菌1~4周后其宿主植物茎部、根部的生物量显著增加。本研究表明，水湿地冻土类型中有效P、速效K占对应全效矿质元素的比例均最低，山地类型中碱解N、有效P、速效K含量占对应全效矿质元素的比例总体较高，但笃斯越橘矿质元素含量并未与根系层土壤养分相对应，反而水湿地冻土类型的笃斯越橘除Zn元素外，N、K、Ca、Fe元素含量均最高(图 5、6)，一方面可能是水湿地冻土类型中笃斯越橘根系内生真菌较丰富(图 1)，大量的菌丝可以扩大宿主植物根系与土壤的接触面而增加宿主的根际范围，进而促进宿主吸收矿质养分；亦可能是水湿地冻土类型中大量的共生真菌可以产生广泛的水解酶及氧化酶类，其对活化土壤中复杂的有机质有重要作用(Bending et al., 1996)，笃斯越橘根系真菌侵染率与其矿质养分相关性分析结果与之对应，即真菌侵染率与植株N、P、K、Ca、Fe元素含量呈极显著正相关，与Zn元素呈极显著负相关(表 2)，说明笃斯越橘根系菌根真菌侵染可增加宿主植物体内的N、P、K、Ca、Fe元素含量(Malmer et al., 2003; Scagel, 2005; 徐丽娟等，2012)；真菌侵染则减少笃斯越橘体内Zn元素含量，与前人(Bradley et al., 1981; Martino et al., 2000; Martino et al., 2002)对杜鹃花的研究结果较一致。此外，Mn元素含量在笃斯越橘地上部及地下部中均较高，这对于其它果树可能引起中毒(安贵阳等，2004; 唐玉琴等，2013)，但笃斯越橘能够正常生长，说明笃斯越橘对锰元素具有较强的耐性范围。罗淑华(1997)研究发现，茶树中Mn元素可促进植物体内硝态氮迅速转化为铵态氮，进而合成氨基酸，当植物吸收硝态氮时，其体内Mn元素含量会相应增加。对于大兴安岭地区笃斯越橘体内高含量的Mn元素是否与茶树中Mn元素的作用一致，有待进一步试验验证。

4 结论

大兴安岭地区笃斯越橘根系内生真菌种类较丰富(9属)；侵染率较高(54.98%~68.09%)；侵染结构多样，ITS测序分析得到Phialocephala、Meliniomyces真菌是3种立地类型中笃斯越橘根系优势内生真菌，而不同立地类型中笃斯越橘根系内生真菌具有一定的地域特异性；笃斯越橘内生真菌侵染能够显著增加宿主植物体内N、P、K、Ca、Fe元素含量，而对宿主Zn元素的积累具有一定的抑制作用。因此，筛选不同立地类型中，尤其是不同根系养分水平下优良的笃斯越橘根系内生真菌群落，进一步发掘利用，将对减少化肥污染乃至生态环境可持续发展具有重要意义。