2017, Vol. 53
文章信息
- 冯源恒, 李火根, 杨章旗, 黄永利, 罗群凤, 张远
- Feng Yuanheng, Li Huogen, Yang Zhangqi, Huang Yongli, Luo Qunfeng, Zhang Yuan
- 广西马尾松第2代育种群体的组建
- Construction of Second Generation Breeding Population of Pinus massoniana in Guangxi
- 林业科学, 2017, 53(1): 54-61
- Scientia Silvae Sinicae, 2017, 53(1): 54-61.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20170107
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文章历史
- 收稿日期：2015-12-31
- 修回日期：2016-05-19
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作者相关文章
2. 南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室 南京 210037;
3. 南宁市林业科学研究所 南宁 530107
2. Key Laboratory of Forest Genetics and Biotechnology of Ministry of Education Nanjing Forestry University Nanjing 210037;
3. Nanning Forestry Division Nanning 530107
马尾松(Pinus massoniana) 是我国分布最广的针叶树种，也是我国南方地区重要的用材、荒山造林和工业原料树种，其木材和松脂是许多森林工业、林产工业和造纸工业的支柱(周政贤，2000)。马尾松于20世纪70年代末列为主要树种开展研究(周志春等，1997)，历经“六·五”至“十二·五”近40年的时间，我国马尾松育种研究取得了丰富的成果。其中，在通用材改良阶段(“六·五”和“七·五”计划期间) 以生长量为主要研究性状，重点开展了速生种源的选择，完成了马尾松种源区划(全国马尾松种源试验协作组，1987)，评选出云开大山、南岭山地等一批马尾松优良种源(荣文琛等，1994)，并在南方各主要产区建立了一批初级种子园(王章荣等，1990)；在定向改良阶段(“八·五”计划以来)，以纸浆材和产脂林为主要目标，开始了定向选育工作，比较系统地研究了木材材性、产脂能力及纸浆性能在不同层次的变异模式和遗传规律(曾令海等，1994；秦国峰等，1995)。在育种材料收集、育种群体和生产群体建立方面，据不完全统计，各省区共选出优树5 500多株，建立收集区100 hm2，建立初级无性系种子园和实生种子园1 100 hm2(周志春等，1997)。浙江等省份已经开展了马尾松第2代育种研究(张一等，2010)，并建立了第2代种子园(谭小梅等，2012)。但是对于如何制定马尾松的高世代育种策略，各地都还没有进行比较系统的研究(王章荣，2012)。
广西是马尾松主要分布区，也是马尾松最重要的优良种源区，马尾松遗传育种资源极其丰富(杨章旗等，2001)。广西马尾松第1代育种群体于20世纪80年代初完成选择收集工作，共有464个无性系；并于80年代末陆续开展子代测定试验，到21世纪初最早的几个子代测定林都已达到了15年生的速生期，其生长数据比早期测定时更有价值，为组建高世代育种群体提供了丰富的材料。建立高世代育种群体，应重视群体规模和群体结构这2个关键因素。一方面，应满足长期育种的灵活性保持足够大的群体规模。维持群体的一定多样性、长期育种的遗传增益及开展多个性状的选择都需要较宽的遗传基础。已有研究结果认为，如果希望有效群体的家系数大于100，遗传力大于0.25，那么开始选择的亲本应该在300个左右(Jackson et al., 1972；Cotterill et al., 1989；Lindgren et al., 1997)。美国东南部地区湿地松(P. elliottii) 和火炬松(P. taeda) 第2代育种群体、澳大利亚辐射松(P. radiata) 育种群体都是由上百株到上千株优树组成(王章荣，2012)。另一方面，高世代育种群体也应满足在近期育种阶段内获得最大增益的要求，并考虑节约育种成本。因此，为了实现有效管理和系统制定杂交计划，在火炬松、湿地松等树种的研究中往往将庞大的群体更为精细地划分为若干个亚系或育种组(White et al., 1993；2011)。所以建立较大规模育种群体是进行长期可持续多目标遗传改良的基础，而对育种群体进行合理的结构划分是保障高世代育种有计划进行的重要条件。
本研究以8片林龄20年以上的子代测定林为材料，在基于表型子代测定数据进行单株选择的基础上以SSR分子标记为技术手段对第2代育种材料进行父本分析及遗传多样性研究，为马尾松高世代育种研究提供重要材料；并对第2代育种群体进行结构划分，为高世代育种方案的有效制定提供条件。
1 材料与方法 1.1 试验材料本研究调查了南宁市林业科学研究所分别于1988，1992，1994年营建的8个马尾松第1代无性系种子园的子代测定林(表 1)，共计自由授粉家系440个(不同年份的子代测定试验存在相同参试家系)。基于对生长表型数据的统计分析结果选择子代林中的优良单株作为第2代育种材料，并以无性系形式保存在南宁市林业科学研究所马尾松种质资源库。而后采集这些优良无性系的针叶，提取DNA。由于所有的第2代育种材料均选自自由授粉家系，为使其遗传背景更加清晰，研究中还采集了第1代育种群体全部476个无性系的针叶，提取其DNA用于第2代育种材料的亲本分析。同时采集163株第2代候选优树的针叶，提取DNA。
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N88试验采用2010年测定数据，N92系列3个试验采用2013年测定数据，N94系列4个试验采用2014年测定数据，测定树高、胸径等指标，并通过下式计算材积(V)：
| $ V = 0.714{\rm{ }}265{\rm{ }}437 \times {10^{ - 4}}{D^{1.867{\rm{ }}008}}{H^{0.901{\rm{ }}463{\rm{ }}2}}。 $ | (1) |
式中：D为胸径；H为树高。
采用SAS8.1软件，以yijk=μ+Bi+Fj+BFij+Eijk为线性模型对各子代测定林数据分别进行方差分析。式中：yijk表示第i区组第j家系第k个体的表型值；u表示总体平均值；Fj表示家系效应；Bi表示区组效应；BFij表示区组×家系效应；Eijk表示随机误差。并根据方差分析结果进一步估算遗传力：
| $ 单株遗传力h_{\rm{i}}^2 = \frac{{4\sigma _{\rm{f}}^2}}{{\sigma _{\rm{e}}^2 + \sigma _{{\rm{fb}}}^2 + \sigma _{\rm{f}}^2}}; $ | (2) |
| $ 家系遗传力h_{\rm{f}}^2 = \frac{{\sigma _{\rm{f}}^2}}{{\sigma _{\rm{f}}^2 + \frac{1}{b}\sigma _{{\rm{fb}}}^2 + \frac{1}{{nb}}\sigma _{\rm{e}}^2}}; $ | (3) |
| $ 家系内遗传力h_{\rm{w}}^2 = \frac{{3\sigma _{\rm{f}}^2}}{{\frac{{b - 1}}{b}\sigma _{{\rm{fb}}}^2 + \frac{{nb - 1}}{{nb}}\sigma _{\rm{e}}^2}}。 $ | (4) |
式中：b为区组数量；n为区组内每个家系的单株数量；σf2，σfb2，σe2分别为家系、家系内区组和环境方差分量。
单株选择所得遗传增益(ΔGi) 及配合选择所得遗传增益(ΔGf)(黄少伟等，2006) 的估算公式为：
| $ \Delta {G_{\rm{i}}} = (h_{\rm{i}}^2 \times S)/{{\bar X}_{\rm{p}}}; $ | (5) |
| $ \begin{array}{l} \Delta {G_{\rm{f}}} = h_{\rm{w}}^2[({y_{ijk}} - {y_{\cdot j \cdot}}) - {\rm{E}}({y_{ijk}} - {y_{\cdot j \cdot}})] + \\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;h_{\rm{f}}^2[{y_{\cdot j \cdot}} - {\rm{E}}({y_{\cdot j \cdot}})]。 \end{array} $ | (6) |
式中：h2为遗传力; S为选择差; Xp为群体表现型平均数；yijk表示第i区组第j家系第k个体的表型值; y·j·为第j家系的平均值。
变异系数的计算公式为：
| $ {\rm{CV}} = \frac{{{\rm{SD}}}}{{\bar X}} \times 100。 $ | (7) |
式中：X表示性状均值；SD为标准差。
1.3 第2代育种材料的选择方法采用以下3种方法筛选第2代育种群体材料：一是采用配合选择(combined selection)，即从优良家系中选择优良单株，以测定数据为参考，从每个子代测定林材积均值最大的前20%家系中选择单株材积排名在全林分的前15%、干形和冠形均优秀的个体且排除孤立木与边缘木；二是在全部试验林内开展优良单株选择，从每个试验中单株材积排名在全林分的前2%单株中选择干形、冠形均优秀的个体；三是在全部试验林内开展优良干形单株选择，从每个试验中单株材积排名在全林分的前20%单株中选择干形完全通直优秀的个体。
1.4 遗传多样性及亲本分析 1.4.1 DNA的提取松树针叶DNA提取采用CTAB裂解-硅珠吸附法(Doyle et al., 1990)。纯化后DNA经分光光度计检测纯度后置于4 ℃冰箱保存备用。
1.4.2 引物来源及SSR-PCR反应条件所用的SSR引物根据马尾松基因组DNA测序所得序列设计开发，共计318对(Feng et al., 2013)。筛选16对多态性高的SSR引物用于本研究。PCR反应体系为10 μL：Tris-HCl 10 mmol·L-1 pH8.0，KCl 50 mmol·L-1，Mg2+2.5 mmol·L-1，dNTP (dATP，dCTP，dGTP，dTTP各0.2 mmol·L-1)，引物2.5 pmol，Taq聚合酶0.8 U，DNA 10~20 ng。扩增反应程序采用Touch-down PCR：94 ℃15 s，60 ℃15 s (Δt=-0.5 ℃)，72 ℃30 s，16个循环；再进入94 ℃15 s，52 ℃15 s，72 ℃30 s，10个循环；最后72 ℃延伸15 min。SSR-PCR产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染检测并照相记录。
1.4.3 数据分析采用POPGENE32软件(Yeh et al., 1997) 计算群体内的观察等位基因数目(NA)、有效等位基因数目(Ne)、Shannon多样性指数(I)、各位点的观察杂合度(Ho)。采用Coancestry Version 1.0软件(Wang, 2011) 计算群体内的共祖系数Θ(Ritland, 2009；Lynch et al., 1999；Milligan, 2003；Wang, 2007)。利用基于最大似然法的CERVUS2.0软件，对第2代优树进行父本分析。该软件的原理参见文献(Marshall et al., 1998；何田华等，2001)。
2 结果与分析 2.1 马尾松生长性状的遗传力采用SAS8.1软件对8个子代测定林的树高、胸径和材积3项指标进行方差分析并估算遗传力(表 2)。方差分析结果表明，在所有子代试验中3项指标在家系间均存在极显著差异(α < 0.01)。这说明产自马尾松第1代育种群体的自由授粉家系间存在丰富的遗传变异，有很大遗传改良潜力。
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不同子代林的树高平均遗传力为hf2=0.34，hi2=0.18，hw2=0.15；胸径平均遗传力为hf2=0.35，hi2=0.13，hw2=0.11；材积平均遗传力为hf2=0.40，hi2=0.16，hw2=0.13。所有子代测定试验的材积指标家系遗传力均处于中等以上水平(h2≥0.2)，适于开展优良家系选择。
2.2 优树选择与增益 2.2.1 配合选择以测定数据为参考，从每个试验材积均值最大的前20%家系中选择单株材积、干形、冠形等综合表现最为优秀的1个单株，共选出95株优树作为马尾松第2代育种群体材料；平均增益为11.53%~45.37%(表 3)。
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以测定数据为参考，从每个试验单株材积排名在全林分的前2%单株中选择干形、冠形均优秀的个体(入选家系与配合选择不重复)，共选出40株优树作为马尾松第2代育种材料收入马尾松基因库保存；平均增益为12.71%~57.64%(表 4)。
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以测定数据为参考，从每个试验单株材积排名在全林分的前20%单株中选择干形完全通直的优秀个体(入选家系与配合选择、单株选择不重复)。除N92B试验因候选优树与配合选择和单株选择结果完全重复没有新优树入选外，其他7个试验林共选出28株优树作为马尾松第2代育种材料收入马尾松基因库保存；平均增益为8.25%~40.25%(表 5)。
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采用16对SSR引物在163个样本中共检测到16个位点45个等位变异，多态率为100%。每个位点平均观察等位基因数(NA) 为2.7，平均有效等位基因数(Ne) 为1.54。表 6列出了马尾松第2代育种群体不同位点的遗传多样性参数。不同位点的多样性参数差别很大，PF 784位点的Shannon多样性指数(I) 最高(1.03)，PF 620位点的多样性指数最低(0.04)，平均为0.49，平均观测杂合度为0.32。
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采用Coancestry Version 1.0软件计算得到第2代育种群体163个无性系在16个位点的平均共祖系数为0.042，育种群体状态数为11.9。
2.4 第2代育种材料的亲本分析根据16对SSR引物的扩增结果，采用CERVUS2.0软件对得到的第2代育种材料进行父本分析。163个第2代群体成员中有57个个体在置信度95%的情况下可以确定父本，另有102个个体在置信度80%的情况下能够确定父本。根据父本分析结果，父母本明确的159个第2代育种材料共来自201个亲本，其中母本129个、父本114个。在所有的亲本中，桂GC800A的父本贡献率最高(4.14%)，共有7个子代；桂GC443A的母本贡献率最高(2.37%)，共有4个子代。
2.5 第2代育种群体的亚系划分采用POPGENE32软件计算得到163个无性系间的Nei’s标准遗传距离(GD)，共得到13 366对无性系间遗传距离。其中桂GC269D与桂GC848D间GD最大，为0.56；最小的GD出现在桂GC849A与桂GC858A间，为0.014。采用软件NTSYS，根据Nei’s遗传距离，按非加权类平均法(UPGMA) 对163个无性系进行聚类分析。根据聚类结果将遗传距离等于0.06作为划分亚系的最低标准，即GD小于0.06的分支不再独立划分亚系。163个无性系分为10个亚系(GC2-A-GC2-J)，每个亚系无性系数目5~34个不等。由于GC2-A，GC2-C，GC2-D，GC2-E，GC2-F，GC2-I，GC2-J所含个体较多，为了减少因亚系过大而带来的杂交设计难度，又在这些亚系内按遗传距离分为2~4个组，每组5~8个无性系。在此基础上，为便于开展亚系间杂交设计，将亚系及亚系内组重新进行聚类分析(图 1)，简化并明晰各个亚系及其组间的遗传关系。由于亚系间亲缘关系较远，进行第3代杂交育种可以组为单位在不同亚系间进行杂交设计，而亚系内亲缘关系较近不宜进行系内杂交。
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图 1 马尾松第2代育种群体各亚系遗传聚类 Fig.1 Each substrain genetic distance in second generation of Masson pine breeding population |
林木改良中常以全同胞子代选育第2代育种材料，这样既可以获得一般配合力又可以获得特定杂交组合产生的特殊配合力，而且子代遗传谱系清楚，在改良过程中可以有效地避免近交。但该策略的缺陷在于杂交成本较高，难以进行大规模杂交试验，而小规模的杂交试验因为亲本数量有限，往往导致子代的遗传基础过窄，不利于更高世代的改良；同时风媒传粉的树种在杂交过程中在很大程度上还要受到花粉污染的干扰。而以半同胞子代选育第2代育种材料，不受杂交试验的高成本限制，参与亲本数量大，子代遗传多样性较高；其缺点是所获遗传增益可能较全同胞子代相对较低，且父本不明确，但通过提高选择强度和进行亲本分析可以弥补上述缺点。
具体就广西马尾松而言，以林龄20年以上的半同胞测定林作为材料选择第2代育种群体，既节省育种成本又缩短了育种周期，而且进入速生期后的表型表现比早期测定更有价值。另一方面，由于运用SSR分子标记技术，可以较为准确地推测父本，使第2代育种材料的亲缘关系更为清楚。
3.2 第2代育种群体的遗传多样性水平本研究构建的第2代育种群体的平均等位基因数为2.45，多态率为100%，平均有效等位基因数(Ne) 为1.56，Shannon多样性指数(I) 平均为0.49，平均观测杂合度为0.32，均低于广西马尾松第1代育种群体，这说明在较大选择强度下会损失一部分遗传多样性。而这一结果高于浙江淳安马尾松第2代育种群体(I=0.476)(谭小梅等，2012)，说明广西马尾松第2代育种群体的遗传多样性仍处于较高水平。
3.3 第2代育种群体的亚系划分通过种内杂交获得增益的一般方法是：一方面将育种群体分组成亚系并隔离；另一方面对组内成员间选用适当的交配设计开展杂交。整个育种群体分为主群体和精选群体2大部分。主群体各个亚系的成员按育种值高低进行排名，由高育种值的个体组成精选群体建立种子园。高世代育种时每个亚系各自进行系内杂交选择优秀子代组建该亚系的第2代群体，再从各个亚系选出最好的个体组建第2代精选群体，这样可以保证精选群体个体间近交系数维持在低水平；但缺点是如果亚系内成员数目较少则经过2，3个世代亚系内的近交系数会明显上升，若亚系内成员数目较多杂交的工作将十分巨大。美国的火炬松与湿地松均采用这种策略(White et al., 1993；2011)。
本研究则根据遗传距离将亲缘较近的个体划归一个亚系，在建立种子园时从每个亚系中选择一定数量的最佳无性系作为精选群体建园。在进行下一代杂交育种时，不进行亚系内交配，而以亚系为单位进行亚系间的交配。杂交方案以测交设计为主，即所有母本来自同一个亚系而所有父本来自另一个亚系，这样可以保证杂交双亲的亲缘关系较远。从杂交子代中选择优良个体组建第3代育种群体后继续根据遗传距离划分亚系，这样每一代的精选群体近交程度会比上一代有所上升，但育种群体整体的近交程度却能保持在一个相对较低的水平。
4 结论采用配合选择与单株选择相结合的方法进行马尾松第2代育种材料选择，可以较好地兼顾育种群体的遗传增益与遗传多样性，据此初步建立了由163株优树组成的广西马尾松第2代育种群体。该群体具有较高遗传多样性，个体间的近交程度较低。根据遗传距离对第2代育种群体进行亚系结构划分，设计出“系间杂交、系内慎交”的高世代杂交育种策略，可以有效地避免近交，为马尾松有计划地开展高世代杂交育种奠定基础。
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