细叶桉群体的遗传多样性和受选择位点

DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160905

文章信息

宋志姣, 杨合宇, 翁启杰, 周长品, 李发根, 李梅, 卢万鸿, 罗建中, 甘四明

Song Zhijiao, Yang Heyu, Weng Qijie, Zhou Changpin, Li Fagen, Li Mei, Lu Wanhong, Luo Jianzhong, Gan Siming

细叶桉群体的遗传多样性和受选择位点

Genetic Diversity and Selective Loci in Eucalyptus tereticornis Populations

林业科学, 2016, 52(9): 39-47

Scientia Silvae Sinicae, 2016, 52(9): 39-47.

DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160905

文章历史

收稿日期：2015-08-20

修回日期：2015-09-16

作者相关文章

宋志姣

杨合宇

翁启杰

周长品

李发根

李梅

卢万鸿

罗建中

甘四明

引用本文

宋志姣, 杨合宇, 翁启杰, 周长品, 李发根, 李梅, 卢万鸿, 罗建中, 甘四明. 2016. 细叶桉群体的遗传多样性和受选择位点[J]. 林业科学, 52(9): 39-47. 复制到剪切板

Song Zhijiao, Yang Heyu, Weng Qijie, Zhou Changpin, Li Fagen, Li Mei, Lu Wanhong, Luo Jianzhong, Gan Siming. 2016. Genetic Diversity and Selective Loci in Eucalyptus tereticornis Populations. Scientia Silvae Sinicae, 52(9): 39-47. DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160905 复制到剪切板

细叶桉群体的遗传多样性和受选择位点

宋志姣^1,2,4, 杨合宇², 翁启杰², 周长品², 李发根², 李梅², 卢万鸿³, 罗建中³, 甘四明^1,2

1. 林木遗传育种国家重点实验室(中国林业科学研究院) 北京 100091;
2. 中国林业科学研究院热带林业研究所热带林业研究国家林业局重点实验室广州 510520;
3. 国家林业局桉树研究开发中心湛江 524022;
4. 保山学院保山 678000

收稿日期：2015-08-20; 修回日期：2015-09-16

基金项目：国家高技术研究发展计划(2013AA102705) ;国家自然科学基金面上项目(31270702)

通讯作者：甘四明

摘要： 【目的】 分析细叶桉天然群体的多样性水平和遗传结构，为种质资源管理和育种利用提供有用信息；检测细叶桉与原产地气候因子显著关联的基因组位点，探索气候适应过程中趋异选择的分子证据。 【方法】 以细叶桉9个群体的77株样品为材料，基于覆盖巨桉全基因组的108个SSR位点（包括44个基因组SSRs和64个EST-SSRs），利用不偏离哈-温平衡、F_ST值非异常的25个中性的基因组SSRs进行群体多样性水平和遗传结构分析，利用所有位点进行F_ST异常值检测、再利用空间分析法查找与原产地气候因子关联的适应性位点，注释适应性位点的功能，并通过等位片段在各群体的频率与气候因子的一元线性回归进一步验证关联的显著性。 【结果】 25个中性的基因组SSR位点对细叶桉9个群体扩增，共检测到556 个等位片段、平均每个位点22.2个等位片段，位点多态性较高；群体多样性水平都较高，期望杂合度为0.711~0.847（平均0.800）、基因丰富度为3.054~3.386（平均3.246），各群体特有等位片段数为6~26（平均14.4）；群体间分化水平较低，25个中性位点平均F_ST仅0.012，分子方差分析中群体间方差分量仅占1.2%，表明细叶桉遗传变异主要存在于群体内；聚类分析也表明群体分化水平较低。所有108个位点中，共检测到78个F_ST值异常的位点，与年均气温、年均降水、最热月最高温度和季节性降水变异系数相关的F_ST值异常的位点数分别为27，10，51和42个，即为受选择位点；其中，4个F_ST值异常的位点各有1个等位片段在空间分析法中与1个或者2个气候因子显著关联，EUCeSSR485与季节性降水变异系数相关、为富含羟脯氨酸的蛋白家族基因，EUCeSSR0497与年均气温和年均降水均相关、与跨膜内切1，4-β-葡聚糖酶基因同源，而另外2个没有明确的功能注释；线性回归分析验证了1个等位片段（EUCeSSR485-140 bp）与季节性降水变异系数的回归显著性（P≤0.05）。 【结论】 细叶桉群体的遗传多样性高，育种利用的潜力大，种质资源管理应重视多样性较高和特有等位片段较多的群体；细叶桉群体的遗传分化较低，其适于关联遗传分析；受选择位点的鉴定有助于理解林木适应环境的分子机制和探索林木环境适应性的潜力。

关键词: 细叶桉 SSR标记遗传多样性群体结构适应性

Genetic Diversity and Selective Loci in Eucalyptus tereticornis Populations

Song Zhijiao^1,2,4, Yang Heyu², Weng Qijie², Zhou Changpin², Li Fagen², Li Mei², Lu Wanhong³, Luo Jianzhong³, Gan Siming^1,2

1. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding(Chinese Academy of Forestry) Beijing 100091 ;
2. Key Laboratory of State Forestry Administration on Tropical Forestry Research Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry Guangzhou 510520 ;
3. China Eucalypt Research Centre Zhanjiang 524022 ;
4. Baoshan University Baoshan 678000

Abstract: 【Objective】 Genetic diversity and population structure were analyzed in an important tree species Eucalyptus tereticornis to provide useful information for germplasm management and breeding. Genomic loci significantly associated with habitat climatic variables were identified to explore the molecular signature of divergent selection during climatic adaptation. 【Method】 A total of 77 individuals sampled from nine E. tereticornis populations were analyzed using 108 simple sequence repeats (SSR) markers spanning the E. grandis genome, including 44 genomic SSRs and 64 expressed sequence tag (EST) derived SSRs. The genetic diversity and population structure were assessed using 25 putatively neutral genomic SSR loci that neither departed from Hardy-Weinberg equilibrium nor showed F_ST outlying values. F_ST outlying loci and their significant associations with habitat climatic variables were investigated for all the 108 SSRs, with further functional annotation of the significantly associated loci. The significance of associations was also tested through univariate linear regression analysis between the allelic frequency and the climatic factor. 【Results】 A total of 556 alleles were detected, averaging at 22.2 alleles per locus and indicating high levels of locus polymorphism. Population diversity was high, with expected heterozygosity 0.711-0.847 (mean 0.800), allelic richness 3.054-3.386 (mean 3.246) and number of private alleles 6-26 (mean 14.4). Population differentiation was extremely low, with mean F_ST=0.012 at 25 putative neutral genomic SSRs as well as among-population variation percentage of 1.2% in analysis of molecular variance (AMOVA), indicating within-population accounting for the majority of genetic variations. The clustering analysis indicated also a low level of population differentiation. A total of 78 F_ST outliers were identified as selective loci form all the 108 SSR loci, and the numbers of outliers related with mean annual temperature, mean annual precipitation, maximum temperature of the warmest month and precipitation seasonality were 27, 10, 51 and 42, respectively. Four alleles from independent outlier loci were revealed with spatial analysis methods (SAM), each associated with one or two climatic factors. Of the four selective loci, EUCeSSR485 associated with precipitation seasonality climatic factors was functionally annotated as a member of hydroxylproline-rich glycoprotein gene family, and EUCeSSR0497 with mean annual temperature and mean annual precipitation was homologous to membrane-anchored endo-1,4-beta-glucanase gene, while the rest two loci were of unknown function. One significant association between frequency of EUCeSSR485-140 bp and precipitation seasonality was validated with univariate linear regression (P≤0.05). 【Conclusion】 The high levels of genetic diversity in E. tereticornis may suggest that great potential can be expected in breeding and attention should be paid to those populations with higher diversity and more private alleles in germplasm management. The low genetic differentiation may indicate that E. tereticornis populations are suitable for further association genetics analysis. The selective loci indentified herein may help in understanding the molecular mechanism of adaptation to environments and exploring the adaptation potential in forest trees.

Key words: Eucalyptus tereticornis SSR marker genetic diversity population structure adaptation

桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)双蒴盖亚属(Symphyomyrtus)细叶桉(E. tereticornis)是优良的纸浆和人造板工业用材树种，在全球热带和亚热带地区广为引种(Eldridge et al.，1993)。细叶桉天然分布于巴布亚新几内亚南部和澳大利亚东海岸(9°—38°S)海边至内陆100 km的广大区域，海拔范围0～1 500 m，分布区包括多种气候类型、年降雨量500～1 500 mm(Eldridge et al.，1993)。相应地，细叶桉表型性状的变异较大，种源/家系试验表明其生长、干形、分枝和木材性质等性状均变异显著(王豁然等，1988；徐建民等，1993；2003；梁坤南等，1995；Chamshama et al.，1999；陆钊华等，2000；Varghese et al.，2009；Luo et al.，2014)，一些种源甚至可耐受-7.9℃的冻害(林睦就等，2003)。但是，细叶桉分子水平上的变异却较少研究，只有Butcher等(2009)利用简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)和限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析了3个群体，张党权等(2009)利用简单重复序列区间(inter-simple sequence repeats，ISSR)分析了4个小群体，更大范围乃至全分布区的群体多样性研究尚待开展。多样性水平的研究有助于阐明群体变异的范围和结构，对种质资源管理和育种策略制定亦有重要的参考价值(Yanchuk，2001)。

细叶桉广泛的分布区和原产地多种气候类型也为群体适应性研究提供了材料。适应性是生境条件对群体长期自然选择的结果，从而导致群体间基因频率的不同(Jump et al.，2006)，进而引起表型和遗传结构的分化(Savolainen et al.，2007)。因此，阐明与自然选择有关的基因或基因组位点对理解适应性的遗传基础和指导种质资源的保护均有重要意义(Savolainen et al.，2013；Alfaro et al.，2014)。桉属中，目前仅在棒头桉(E. gomphocephala)(Bradbury et al.，2013)和毛果桉(E. tricarpa)(Steane et al.，2014)中研究了自然选择相关位点，2个树种分布范围均较窄(前者为西澳海岸30.4°—33.6°S，后者为南澳沿海36.7°—37.5°S)，而对分布范围较广的树种却没有报道。本研究基于覆盖全基因组的44个基因组SSRs和64个开发自表达序列标签(expressed sequence tag，EST)的SSRs，利用25个中性的基因组SSRs分析9个细叶桉群体的遗传多样性和群体结构，利用全部标记分析受自然选择的候选位点，旨在明确该树种的遗传多样性和群体分化水平以及探索适应性的分子机制，并为种质资源管理和育种利用提供有用信息。

1 材料与方法 1.1 试验材料

选取细叶桉9个天然群体的77个半同胞家系，每个家系选取1株生长正常的植株，各群体包含4～19株(表 1)。叶样采自2012年8月营建的、位于广东省遂溪县的细叶桉种源/家系试验林，参试家系的种子均采自天然林、母树间隔100 m以上，由澳大利亚林木种子中心和Kylisa种子公司提供。叶样采后临时保存在放有冰袋的泡沫盒中，带回实验室即置于-80℃冰箱备用。

表 1 参试的细叶桉9 个天然群体及其地理位置^① Tab.1 The nine populations of E． tereticornis tested and their geographical origins

1.2 DNA提取和SSR标记试验

称取0.3 g叶样放入1.5 mL Eppendorf管，液氮冷冻后通过球磨仪MM400(Retsch GmbH，德国)粉碎，采用改良CTAB法提取DNA(Gan et al.，2003)。利用NanoDrop 2000(Thermo Scientific，美国)测定DNA浓度和纯度。

基于已经发表的桉树SSR标记，选取在巨桉(E. grandis)全基因组上分布较均匀的108个SSR位点(包括44个基因组SSRs和64个EST-SSRs)(表 2)。考虑到所选SSR位点在基因组上相距较远，认为位点间不存在连锁不平衡。SSR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

表 2 参试的108 个SSR 位点^① Tab.2 The 108 SSR loci used in this study

表 2 参试的108 个SSR 位点^①

Tab.2 The 108 SSR loci used in this study

序号 No.	SSR位点 SSR locus	参考文献 Reference
1^a	EUCeSSR1061	Zhou et al.，2014
2^b	EUCeSSR1039	Zhou et al.，2014
3^a	Embra180	Brondani et al.，2006
4^b	Embra366^*	Brondani et al.，2006
5^b	EUCeSSR485	He et al.，2012
6^c	Embra100	Brondani et al.，2006
7	EUCeSSR0333	Zhou et al.，2014
8^a	EUCeSSR347	He et al.，2012
9^b	EUCeSSR1136	周长品等，2010 (Zhou et al.，2010)
10^a	Embra98^**	Brondani et al.，2006
11^b	EUCeSSR0502	Zhou et al.，2014
12^a	EUCeSSR0224	Zhou et al.，2014
13^b	EUCeSSR0276	Zhou et al.，2014
14	Embra333	Brondani et al.，2006
15^a	Embra201^**	Brondani et al.，2006
16	EUCeSSR0930	Zhou et al.，2014
17	EUCeSSR410	He et al.，2012
18^b	EUCeSSR0979	Zhou et al.，2014
19	Embra115	Brondani et al.，2006
20	Embra227^*	Brondani et al.，2006
21^a	EUCeSSR1060	周长品等，2010 (Zhou et al.，2010)
22	Embra280	Brondani et al.，2006
23^a	Embra377	Brondani et al.，2006
24^b	Embra321^*	Brondani et al.，2006
25^b	EUCeSSR313	He et al.，2012
26^b	EUCeSSR0857	Zhou et al.，2014
27^b	EUCeSSR384	He et al.，2012
28^b	Embra125^*	Brondani et al.，2006
29	EUCeSSR0599	Zhou et al.，2014
30^b	Embra130	Brondani et al.，2006
31	EUCeSSR0035	Zhou et al.，2014
32^b	EUCeSSR0803	Zhou et al.，2014
33^c	EUCeSSR151	He et al.，2012
34^a	EUCeSSR686	He et al.，2012
35^b	EUCeSSR0862	Zhou et al.，2014
36^a	Embra242	Brondani et al.，2006
37^c	EUCeSSR840	He et al.，2012
38^b	Embra120	Brondani et al.，2006
39^b	Embra41^*	Brondani et al.，2006
40^b	EUCeSSR626	He et al.，2012
41^c	Embra64	Brondani et al.，2006
42^a	Embra111	Brondani et al.，2006
43	Embra370^*	Brondani et al.，2006
44	EUCeSSR0455	Zhou et al.，2014
45^a	Embra358	Brondani et al.，2006
46^a	Embra304^*	Brondani et al.，2006
47	EUCeSSR0103	Zhou et al.，2014
48^a	Embra188	Brondani et al.，2006
49	EUCeSSR0906	Zhou et al.，2014
50^a	Embra37	Brondani et al.，2006
51	EUCeSSR1134	Zhou et al.，2014
52^b	Embra187^*	Brondani et al.，2006
53^b	EUCeSSR346	He et al.，2012
54^a	EUCeSSR0755	Zhou et al.，2014
55^c	EUCeSSR0705	Zhou et al.，2014
56	Embra196	Brondani et al.，2006
57^c	Embra233	Brondani et al.，2006
58^a	EUCeSSR338	He et al.，2012
59^b	EUCeSSR231	He et al.，2012
60^b	EUCeSSR0959	Zhou et al.，2014
61^b	EUCeSSR739	He et al.，2012
62	EUCeSSR0620	Zhou et al.，2014
63^a	Embra135^**	Brondani et al.，2006
64^b	Embra345^***	Brondani et al.，2006
65^b	EUCeSSR0776	Zhou et al.，2014
66^b	EUCeSSR880	He et al.，2012
67	Embra81	Brondani et al.，2006
68^a	EUCeSSR1042	Zhou et al.，2014
69^b	Embra7^*	Brondani et al.，2006
70^a	Embra83^**	Brondani et al.，2006
71	EUCeSSR0875	Zhou et al.，2014
72^b	Embra369	Brondani et al.，2006
73^b	EUCeSSR1087	Zhou et al.，2014
74^b	EUCeSSR683	He et al.，2012
75	EUCeSSR522	He et al.，2012
76^b	Embra197	Brondani et al.，2006
77^b	Embra150^*	Brondani et al.，2006
78^b	EUCeSSR0163	Zhou et al.，2014
79	EUCeSSR1070	Zhou et al.，2014
80^b	Embra88	Brondani et al.，2006
81^a	Embra53^**	Brondani et al.，2006
82	EUCeSSR0226	Zhou et al.，2014
83^b	EUCeSSR0497	Zhou et al.，2014
84	EUCeSSR0845	Zhou et al.，2014
85^b	EUCeSSR1125	Zhou et al.，2014
86	EUCeSSR0592	Zhou et al.，2014
87^c	EUCeSSR0909	Zhou et al.，2014
88^c	Embra217	Brondani et al.，2006
89^b	EUCeSSR0679	Zhou et al.，2014
90^a	EUCeSSR596	He et al.，2012
91^a	Embra40	Brondani et al.，2006
92^b	EUCeSSR1044	Zhou et al.，2014
93	EUCeSSR0568	Zhou et al.，2014
94^a	EUCeSSR0126	Zhou et al.，2014
95	Embra394	Brondani et al.，2006
96^b	Embra87	Brondani et al.，2006
97^b	Embra165^*	Brondani et al.，2006
98^b	Embra326^*	Brondani et al.，2006
99	EUCeSSR1117	Zhou et al.，2014
100^a	EUCeSSR0893	Zhou et al.，2014
101	Embra269	Brondani et al.，2006
102	EUCeSSR1021	Zhou et al.，2014
103^a	EUCeSSR292	He et al.，2012
104	EUCeSSR349	He et al.，2012
105^a	EUCeSSR209	He et al.，2012
106	EUCeSSR0849	Zhou et al.，2014
107^b	Embra258^*	Brondani et al.，2006
108^a	EUCeSSR1145	Zhou et al.，2014
① 前缀为EUCeSSR的标记为EST-SSR标记(64个)，其余为基因组SSR(44个)。：偏离哈-温平衡的基因组SSR(P ≤ 0.01；13个位点)；：F_ST值异常的基因组SSR(5个位点)；*：既偏离哈-温平稳(P ≤ 0.01)又是F_ST异常值的基因组SSR(1个位点)。a：1个或多个气候因子分组中大于95%置信水平的F_ST值异常位点(趋异选择位点，28个)；b：1个或多个气候因子分组中低于5%置信水平的F_ST值异常位点(平衡选择位点，42个)；c：不同气候因子分组中F_ST异常值既有大于95%置信水平的、又有低于5%置信水平的位点(8个)。The prefix EUCeSSR indicates EST-SSRs(64 markers)while the rest are of genomic SSRs(44 markers). ：Genomic SSR departed from Hardy-Weinberg equilibrium(P ≤ 0.01; 13 loci)；：Genomic SSR being F_ST outlier(five loci)；*: Genomic SSRs both departed from Hardy-Weinberg equilibrium(P ≤ 0.01)and being F_ST outlier(one locus). a：F_ST outlier above 95% confidence interval in one or more climatic partitions(divergent selection，28 loci)；b：F_ST outlier below 5% confidence interval in one or more climatic partitions(balancing selection，42 loci)；c：F_ST outlier above 95% or below 5% confidence interval in different climatic partitions(eight loci).

SSR分型通过在10 μL PCR反应中加入荧光dUTP(Fermentas，加拿大)、采用降落PCR扩增程序、PCR产物利用ABI 3130xl测序仪(Applied Biosystems，美国)检测，具体参考Li等(2011)，PCR反应的Mg²⁺浓度和扩增的退火温度视SSR标记而定。

1.3 数据分析 1.3.1 位点多样性分析

对于各位点，利用Genepop 4.2软件(Rousset，2008)检测哈-温平衡(P ≤ 0.01，随机检测1 000次)，利用PowerMarker 3.25(Liu et al.，2005)计算多态性信息量(polymorphism information content，PIC)，利用GenAlEx 6.4.1(Peakall et al.，2006)计算等位片段数(number of alleles，N_a)、观测杂合度(observed heterozygosity，H_o)、期望杂合度(expected heterozygosity，H_e)和固定指数(fixation index，F)，利用FSTAT 2.9.3.2(http://www2.unil.ch/popgen/softwares/fstat.htm)计算等位片段丰富度(allelic richness，A_R；基于最小群体的样品数)、群体间分化系数(between-population differentiation，F_ST)、群体内近交系数(inbreeding coefficients of individuals relative to the sub-population，F_IS)和群体间近交系数(inbreeding coefficients of individuals relative to the total population，F_IT)，利用FreeNA(Chapuis et al.，2007)计算哑等位频率(null allele frequency，NAF)。

1.3.2 群体多样性分析

因中性标记更适于群体分析(Black et al.，2001)，只将既不偏离哈-温平衡、也在LOSITAN分析中(见下文)F_ST非异常值的25个中性的基因组SSR用于群体多样性和群体结构分析。

利用GenAlEx 6.4.1(Peakall et al.，2006)计算各群体N_a，H_o，H_e和F等参数，利用FSTAT 2.9.3.2(http://www2.unil.ch/popgen/softwares/fstat.htm)计算A_R(基于最小群体的样品数)，手动统计特有等位片段数(number of private alleles，N_pa)。

1.3.3 群体结构分析

利用EXCEL计算25个中性位点对所有群体的F_ST，F_IS和F_IT平均值，利用GenAlEx 6.4.1(Peakall et al.，2006)进行分子方差分析(analysis of molecular variances，AMOVA)；利用PowerMarker 3.25(Liu et al.，2005)计算群体间Nei’s遗传距离，采用非加权分组算术平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)进行聚类分析。

1.3.4 受选择位点的检测

对所有108个SSRs，受选择位点的检测采用F_ST异常值和与气候因子关联分析2种方法。因部分群体较小，参考Prunier等(2011；2012)首先根据原产地的气候因子进行群体分组，从http://www.worldclim.org/(Hijmans et al.，2005)下载原产地1950—2000年的19个气候因子的数据，用R软件的cor.test功能检测气候因子之间的相关性，只取相关不显著的气候因子(P ≤ 0.05)进行9个群体的K-means分组(Legendre et al.，1998)。

根据各气候因子的群体分组，利用LOSITAN(Antao et al.，2008)通过F_ST与H_e的分布确定F_ST值异常的位点，选项设置为无限等位突变模型、模拟重复100 000次，F_ST值高于95%置信区间则为趋异选择(或正向选择)、低于5%置信区间则为平衡选择，假阳性率设为0.01

对于F_ST异常值的位点，再通过空间分析法(spatial analysis method，SAM)(Joost et al.，2007)检测等位频率与气候因子的关联，采用似然比值G和Wald检测(α=0.01)以及Bonferroni校正，关联显著性的置信水平为99.99%。显著关联位点的功能注释通过BlastX比对GenBank非冗余蛋白库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi；E ≤ 10^-5)。为校正等位频率的自相关，通过等位片段在各群体的频率与气候因子的一元线性回归进一步验证关联的显著性(Narum et al.，2010)。

2 结果与分析 2.1 位点和群体多样性

4 4个基因组SSR位点中，14个偏离哈-温平衡，6个显示F_ST值异常，其中1个同时偏离哈-温平衡和显示F_ST值异常(表 2)，其余25个中性的基因组SSR用于群体多样性和群体结构分析。表 3列出了这25个位点对细叶桉9个群体的多样性参数，共检测到556个等位片段、平均每位点22.2个等位片段；位点多态性均较高，如PIC为0.680～0.954(平均0.904)，按PIC ≥ 0.5的标准(Botstein et al.，1980)均为多态性高的位点。

表 3 25 个中性的基因组SSR 位点的多样性参数^① Tab.3 Diversity indices for 25 putatively neutral genomic SSRs tested

表 3 25 个中性的基因组SSR 位点的多样性参数^①

Tab.3 Diversity indices for 25 putatively neutral genomic SSRs tested

序号 No.	SSR位点 SSR locus	N_a	PIC	NAF	A_R	H_o	H_e	F	F_ST	F_IS	F_IT
1	Embra269	22	0.924	0.041	3.428	0.768	0.830	0.064	0.026	0.166	0.187
2	Embra130	23	0.902	0.048	3.383	0.747	0.830	0.100	0.003	0.144	0.146
3	Embra120	22	0.931	0.052	3.532	0.743	0.841	0.115	0.011	0.207	0.216
4	Embra87	29	0.948	0.171	3.488	0.533	0.854	0.382	-0.004	0.439	0.437
5	Embra64	21	0.906	0.079	2.951	0.640	0.782	0.193	0.036	0.248	0.275
6	Embra394	17	0.783	0.116	3.035	0.521	0.725	0.289	0.014	0.340	0.348
7	Embra115	18	0.910	0.141	3.395	0.560	0.816	0.309	0.014	0.402	0.410
8	Embra88	21	0.928	0.057	2.883	0.756	0.774	-0.020	0.013	0.200	0.210
9	Embra369	17	0.905	0.046	3.360	0.767	0.839	0.086	0.003	0.137	0.140
10	Embra280	21	0.930	0.259	3.159	0.349	0.813	0.583	-0.013	0.564	0.558
11	Embra333	16	0.834	0.088	3.098	0.619	0.772	0.197	-0.003	0.275	0.273
12	Embra37	20	0.922	0.104	3.125	0.585	0.790	0.267	0.029	0.269	0.291
13	Embra180	18	0.916	0.106	3.176	0.609	0.799	0.246	0.037	0.239	0.267
14	Embra233	20	0.906	0.237	3.108	0.363	0.734	0.452	-0.002	0.688	0.688
15	Embra242	15	0.866	0.141	2.953	0.509	0.750	0.332	0.043	0.340	0.368
16	Embra40	19	0.914	0.039	3.343	0.747	0.811	0.078	0.031	0.168	0.194
17	Embra111	27	0.933	0.069	3.547	0.684	0.841	0.194	0.007	0.207	0.213
18	Embra358	31	0.949	0.311	3.025	0.259	0.826	0.699	-0.001	0.678	0.677
19	Embra196	33	0.954	0.136	3.502	0.574	0.846	0.325	0.010	0.429	0.434
20	Embra100	25	0.934	0.070	3.325	0.713	0.766	0.042	0.035	0.196	0.224
21	Embra188	31	0.928	0.055	3.415	0.695	0.810	0.155	0.021	0.222	0.239
22	Embra197	16	0.680	0.050	2.649	0.572	0.675	0.154	-0.007	0.247	0.241
23	Embra217	24	0.920	0.082	3.580	0.732	0.836	0.121	0.005	0.205	0.209
24	Embra377	23	0.941	0.139	3.283	0.556	0.795	0.265	-0.006	0.410	0.406
25	Embra81	27	0.928	0.137	3.418	0.601	0.846	0.299	0.015	0.331	0.341
合计 Total		556
平均值(标准误) Mean(SE)		22.2 (5.1)	0.904 (0.060)	0.111 (0.072)	3.246 (0.241)	0.608 (0.016)	0.800 (0.006)	0.237 (0.021)	0.012 (0.003)	0.316 (0.032)	0.324 (0.030)
① N_a：等位片段数； PIC：多态性信息量； NAF：哑等位频率；A_R：等位片段丰富度； H_o：观测杂合度； H_e：期望杂合度； F：固定指数； F_ST：群体间分化系数； F_IS：群体内近交系数； F_IT：群体间近交系数； SE：标准误。下同。N_a: Number of alleles； PIC: Polymorphism information content； NAF: Null allele frequency； A_R: Allelic richness； H_o: Observed heterozygosity； H_e: Expected heterozygosity； F: Fixation；F_ST: Between-population differentiation； F_IS: Inbreeding coefficients of individuals relative to the sub-population； F_IT: Inbreeding coefficients of individuals relative to the total population； SE: Standard error. The same below.

表 4列出了细叶桉9个群体的SSR多样性参数。群体多样性水平都较高，如H_e为0.711～0.847(平均0.800)、A_R为3.054～3.386(平均3.246)。各群体均有特有等位片段，数量为6～26(平均14.4)。但固定指数相对较高，平均达0.237，表明多数群体内存在一定程度的近交。

表 4 细叶桉9 个天然群体的SSR 多样性参数^① Tab.4 SSR diversity indices of nine populations of E． tereticornis tested

2.2 群体结构

群体间分化水平较低，25个中性的基因组位点平均F_ST仅0.012(表 3)；AMOVA分析也表明群体间方差分量仅占1.2%(表 5)。这表明细叶桉的群体分化水平较低。同时，25个位点的平均近交系数与AMOVA结果较一致，如F_IS分别为0.316(表 3)与0.386(表 5)、F_IT分别为0.324(表 3)和0.394(表 5)，表明细叶桉群体变异主要存在于群体内。并且，聚类分析中9个群体逐步聚类(图 1)，很难再区分亚类，也表明细叶桉具有较低分化的群体结构。

表 5 细叶桉群体内和群体间AMOVA 分析结果^① Tab.5 AMOVA results for within- and among-population variations in E． tereticornis

图 1 细叶桉9个群体的聚类分析 Fig.1 UPGMA clustering of nine E. tereticornis populations 群体缩写见表 1 Population abbreviations are listed in Tab. 1

2.3 受选择的SSR位点

群体产地的19个气候因子中，年均气温、年均降水、最热月最高温度和季节性降水变异系数4个因子互不相关，用于K-means分组可将9个群体分别分为4，2，4和4组。F_ST异常值检测和SAM分析均基于气候分组进行。

利用LOSITAN(Antao et al.，2008)共检测到78个(72.2%)F_ST值异常的位点(表 2)，即为受选择的位点；年均气温、年均降水、最热月最高温度和季节性降水变异系数相关的F_ST值异常的位点数分别为27，10，51和42个(数据未显示)，各气候因子上F_ST异常值大于95%置信水平的位点数分别为21，8，35和15个，而小于5%置信水平的位点数分别为6，2，16和27个。F_ST值异常的位点再进行SAM分析，发现其中4 个位点各有1个等位片段与1个或者2个气候因子显著关联(表 6)。功能注释表明：与季节性降水变异系数相关的EUCeSSR485位点与富含羟脯氨酸的蛋白家族[hydroxylproline-rich glycoprotein family protein(Vitis vinifera)；2E-14]有关，与年均气温和年均降水均相关的位点EUCeSSR0497与跨膜内切1，4-β-葡聚糖酶[membrane-anchored endo-1，4-beta-glucanase(Gossypium hirsutum); 2E-12]基因同源，而EUCeSSR880和EUCeSSR1125没有明确的功能注释。进一步的线性回归分析也验证了其中1个等位片段(EUCeSSR485-140 bp)与季节性降水变异系数存在显著的线性关系(P ≤ 0.05)(图 2)，而其余等位片段与相关气候因子的线性回归不显著，可能存在非线性关系。

表 6 SAM 分析中与气候因子显著关联的位点和等位片段^① Tab.6 Loci and their alleles significantly associated with climatic factors in SAM analyses

图 2 EUCeSSR485-140 bp 频率与季节性降水变异系数的线性回归 Fig.2 Univariate linear regression of the frequency of EUCeSSR485-140 bp with precipitation seasonality

3 讨论

细叶桉群体的遗传多样性水平高，基于25个中性的基因组SSR位点的H_e为0.711～0.847(平均0.800)(表 3)。这与Butcher等(2009)基于SSR分析3个细叶桉群体H_e为0.67～0.83的结果较一致，也与基于SSR分析的其他一些桉属树种的多样性水平类似，如尾叶桉(E. urophylla)群体的平均H_e为0.739(Payn et al.，2008)、棒头桉群体的平均H_e为0.75(Bradbury et al.，2013)、蓝桉(E. globulus)群体的平均H_e为0.82(Steane et al.，2006)。细叶桉较高的遗传多样性应是其分布范围广、异交系统和有效群体较大所致，这也是多数桉属树种的特点。

细叶桉的群体分化水平却偏低，平均F_ST仅0.012(表 3；表 5)。这类似于尾叶桉F_ST为0.031(Payn et al.，2008)，但显著低于同样分布广泛的赤桉(E. camaldulensis，F_ST=0.08)(Butcher et al.，2009)和蓝桉(F_ST=0.09)(Steane et al.，2006)。聚类分析(图 1)也表明细叶桉群体分化水平较低。这表明细叶桉较广的分布范围和不同的气候类型并未引起明显的遗传分化，其原因可能与连续分布、虫媒授粉和较为频繁的基因流有关。另一方面，尾叶桉(Payn et al.，2008)和本文的材料均是天然林采种育苗的子代、F_ST较低，而赤桉(Butcher et al.，2009)和蓝桉(Steane et al.，2006)的材料是天然林直接采集的植株样品，可能天然林的生境条件已在幼苗期对适应性差的迁移个体进行了选择、从而导致相对较高的群体分化参数(Kalisz et al.，2001)。

细叶桉群体的自然选择和适应可能涉及大量的基因组位点，一些位点具有明确的功能。基于不相关的4个气候因子的群体分组，共检测到F_ST值异常的78个SSR位点(72.2%)，表明受选择的位点较多。虽然SAM分析只检测到其中4个位点与年均气温、年均降水和季节性降水变异系数的1～2个因子显著关联，但并不能认为其余F_ST值异常位点是假阳性的受选择位点(Prunier et al.，2011)。4个显著关联的位点中，与季节性降水变异系数相关的EUCeSSR485位点与富含羟脯氨酸的蛋白家族有关，该类蛋白主要位于植物细胞的细胞壁、是细胞壁伸展蛋白的主要成分(郭联华等，2010)，其参与多种发育过程，如细胞胁迫反应(Showalter，1993)和细胞伸长的停止(Ito et al.，1998)，考虑到季节性降水变异系数对植物发育的复杂影响，该位点应具有多种功能；与年均气温和年均降水均显著关联的位点EUCeSSR0497与跨膜内切1，4-β-葡聚糖酶基因同源，该酶为普遍存在于植物体内的水解酶，自然条件下植物生长、开花、果实成熟和器官脱落等过程均可诱导其基因表达，Shani等(1997)发现该酶的基因cel2在拟南芥(Arabidopsis thaliana)开花茎秆的生长区高效表达，考虑到气温和降水对开花等过程的显著影响，该位点的功能较好理解；另外2个相关位点没有明确的功能注释，可以作为参与相关环境适应的候选位点，或者也可能是因为这些位点与目的基因连锁导致的‘搭便车’效应(Schlötterer，2003)。

相对较小的群体仍可有效估算群体多样性参数。虽然本研究的多数群体较小、个体数不多，但与之前桉属树种中利用SSR估算的群体参数相近。类似地，Elliott等(2003)利用10个群体、每群体10株有效地进行了西方桉(E. occidentalis)的多样性分析。

本研究的结果对细叶桉种质资源管理和利用具有重要作用。资源保存和育种利用需要重视遗传多样性较高和特有等位片段数较多的群体，如Lav，Mar，Cal和Nor等群体，同时群体多样性水平普遍较高也表明育种利用的潜力较好。虽然细叶桉分子水平的群体遗传分化极低，但分子与表型的变异水平可能不同(Steane et al.，2006)，之前的研究也表明细叶桉具有较大的表型变异(Varghese et al.，2009; Luo et al.，2014)，因此育种中仍需进行种源/家系的表型选择，尤其是考虑到林木表型易受环境条件的影响。并且，因群体结构对标记与性状的关联分析具有较大影响，细叶桉低的群体分化水平表明该树种适于进一步进行标记与经济性状的关联研究。另外，检测到的受选择位点有助于理解细叶桉适应环境的分子机制，在当前气候变化背景下，这对探索多年生林木的环境适应潜力有积极作用。

4 结论

本文首次系统地分析了细叶桉的群体多样性，检测了细叶桉与原产地气候因子显著关联的基因组位点，得到以下主要结论：1)细叶桉群体的遗传多样性高，育种利用的潜力大，种质资源管理应重视多样性较高和特有等位片段较多的群体； 2)细叶桉群体的遗传分化较低，其适于关联遗传分析； 3)鉴定了一批受选择位点，有助于理解林木适应环境的分子机制和探索林木环境适应性的潜力。

参考文献(References)

[1]	郭联华, 尹佟明, 李淑娴, 等. 2010. 植物细胞壁伸展蛋白研究述评. 林业科学 , 46 (12) : 144–152. ( Guo L H, Yin T M, Li S X, et al.2010. A review of extensins in plant cell wall. Scientia Silvae Sinicae , 46 (12) : 144–152. [in Chinese] ) (0)
[2]	梁坤南, 周文龙. 1995. 细叶桉种源-家系选择. 林业科学研究 , 8 (3) : 252–257. ( Liang K N, Zhou W L.1995. Study on selections of provenance and family for Eucalyptus tereticornis. Forest Research , 8 (3) : 252–257. [in Chinese] ) (0)
[3]	林睦就, 李柏海. 2003. 湖南桉树引种研究. 桉树科技 , 20 (1) : 1–12. ( Lin M J, Li B H.2003. The study on introduction of cold tolerant Eucalyptus in Hunan. Eucalypt Science and Technology , 20 (1) : 1–12. [in Chinese] ) (0)
[4]	陆钊华, 徐建民, 白嘉雨, 等. 2000. 细叶桉和赤桉种源间材性变异研究. 林业科学研究 , 13 (4) : 370–376. ( Lu Z H, Xu J M, Bai J Y, et al.2000. Study on wood property variation between Eucalyptus tereticornis and Eucalyptus camaldulensis. Forest Research , 13 (4) : 370–376. [in Chinese] ) (0)
[5]	王豁然, BanksJ C G, PryorL D. 1988. 细叶桉地理变异的多变量研究. 林业科学 , 24 (3) : 257–267. ( Wang H R, Banks J C G, Pryor L D.1988. A multivariate study of geographical variation in Eucalyptus tereticornis Sm. Scientia Silvae Sinicae , 24 (3) : 257–267. [in Chinese] ) (0)
[6]	徐建民, 陆钊华, 白嘉雨, 等. 2003. 细叶桉种源-家系综合选择的研究. 林业科学研究 , 16 (1) : 1–7. ( Xu J M, Lu Z H, Bai J Y, et al.2003. Study on integrated selection of provenances-families of Eucalyptus tereticornis. Forest Research , 16 (1) : 1–7. [in Chinese] ) (0)
[7]	徐建民, 吴坤明, 吴菊英, 等. 1993. 细叶桉地理种源生长性状遗传变异的分析与评价. 林业科学研究 , 6 (3) : 242–248. ( Xu J M, Wu K M, Wu J Y, et al.1993. An analysis on genetic variation in growth characters of geographical provenances of Eucalyptus tereticornis. Forest Research , 6 (3) : 242–248. [in Chinese] ) (0)
[8]	张党权, 田华, 谢耀坚, 等. 2009. 细叶桉遗传多样性的ISSR分析. 中南林业科技大学学报 , 29 (5) : 91–94. ( Zhang D Q, Tian H, Xie Y J, et al.2009. Genetic diversity of Eucalyptus tereticornis by ISSR. Journal of Central South University of Forestry&Technology , 29 (5) : 91–94. [in Chinese] ) (0)
[9]	周长品, 李发根, 翁启杰, 等. 2010. PCR产物直接测序和混合克隆测序进行桉树EST-SSR标记开发. 分子植物育种(网络版) , 8 (1) : e1. ( Zhou C P, Li F G, Weng Q J, et al.2010. Comparison between direct sequencing and pool-cloning-based sequencing of PCR products in EST-SSR marker development in Eucalyptus. Molecular Plant Breeding (online) , 8 (1) : e1. [in Chinese] ) (0)
[10]	Alfaro R I, Fady B, Vendramin G G, et al.2014. The role of forest genetic resources in responding to biotic and abiotic factors in the context of anthropogenic climate change. Forest Ecology and Management , 33 : 76–87. (0)
[11]	Antao T, Lopes A, Lopes R J, et al.2008. LOSITAN:a workbench to detect molecular adaptation based on a F_st-outlier method. BMC Bioinformatics , 9 : 323. DOI:10.1186/1471-2105-9-323 (0)
[12]	Black W C, Baer C F, Antolin M F, et al.2001. Population genomics:genome-wide sampling of insect populations. Annual Review of Entomology , 46 : 441–469. DOI:10.1146/annurev.ento.46.1.441 (0)
[13]	Botstein D, White R L, Skolnick M, et al.1980. Construction of genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics , 32 (3) : 314–331. (0)
[14]	Bradbury D, Smithson A, Krauss S L.2013. Signatures of diversifying selection at EST-SSR loci and association with climate in natural Eucalyptus populations. Molecular Ecology , 22 (20) : 5112–5129. DOI:10.1111/mec.12463 (0)
[15]	Brondani R P V, Williams E R, Brondani C, et al.2006. A microsatellite-based consensus linkage map for species of Eucalyptus and a novel set of 230 microsatellite markers for the genus. BMC Plant Biology , 6 : 20. DOI:10.1186/1471-2229-6-20 (0)
[16]	Butcher P A, McDonald M W, Bell J C.2009. Congruence between environmental parameters,morphology and genetic structure in Australia's most widely distributed eucalypt,Eucalyptus camaldulensis. Tree Genetics&Genomes , 5 (1) : 189–210. (0)
[17]	Chamshama S A O, Mugasha A G, Wate P A.1999. Variation in performance of Eucalyptus tereticornis provenances at Michafutene,Mozambique. Silvae Genetica , 48 (6) : 261–266. (0)
[18]	Chapuis M P, Estoup A.2007. Microsatellite null alleles and estimation of population differentiation. Molecular Biology and Evolution , 24 (3) : 621–631. (0)
[19]	Eldridge K, Davidson J, Harwood C, et al.1993. Eucalypt domestication and breeding. New York:Oxford University Press : 139–142. (0)
[20]	Elliott C, Byrne M.2003. Genetic diversity within and between natural populations of Eucalyptus occidentalis (Myrtaceae). Silvae Genetica , 52 (3/4) : 169–173. (0)
[21]	Gan S, Shi J, Li M, et al.2003. Moderate-density molecular maps of Eucalyptus urophylla S. T.Blake and E.tereticornis Smith genomes based on RAPD markers.Genetica , 118 (1) : 59–67. (0)
[22]	He X, Wang Y, Li F, et al.2012. Development of 198 novel EST-derived microsatellites in Eucalyptus (Myrtaceae). American Journal of Botany , 99 (4) : e134–e148. DOI:10.3732/ajb.1100442 (0)
[23]	Hijmans R J, Camerson S E, Parra J L, et al.2005. Very high resolution interpolated climate surfaces for global land areas. International Journal of Climatology , 25 (15) : 1965–1978. DOI:10.1002/(ISSN)1097-0088 (0)
[24]	Ito M, Kodama H, Komamine A, et al.1998. Expression of extensin genes is dependent on the stage of the cell cycle and cell proliferation in suspension-cultured Catharanthus roseus cells. Plant Molecular Biology , 36 (3) : 343–351. DOI:10.1023/A:1005913818129 (0)
[25]	Joost S, Bonin A, Bruford M W, et al.2007. A spatial analysis method (SAM) to detect candidate loci for selection:towards a landscape genomics approach to adaptation. Molecular Ecology , 16 (18) : 3955–3969. DOI:10.1111/mec.2007.16.issue-18 (0)
[26]	Jump A S, Hunt J M, Martinez-Izquierdo J A, et al.2006. Natural selection and climate change:temperature-linked spatial and temporal trends in gene frequency in Fagus sylvatica. Molecular Ecology , 15 (11) : 3468–3480. (0)
[27]	Kalisz S, Nason J D, Hanzawa F M, et al.2001. Spatial population genetic structure in Trillium grandiflorum:the roles of dispersal,mating,history,and selection. Evolution , 55 (8) : 1560–1568. DOI:10.1111/evo.2001.55.issue-8 (0)
[28]	Legendre P,Legendre L.1998.Numerical ecology.2nd ed.Amsterdam&New York:Elsevier.
[29]	Li F, Gan S.2011. An optimised protocol for fluorescent-dUTP based SSR genotyping and its application to genetic mapping in Eucalyptus. Silvae Genetica , 60 (1) : 18–25. (0)
[30]	Liu K, Muse S V.2005. PowerMarker:an integrated analysis environment for genetic marker analysis. Bioinformatics , 21 (9) : 2128–2129. DOI:10.1093/bioinformatics/bti282 (0)
[31]	Luo J, Arnold R, Lu W, et al.2014. Genetic variation in Eucalyptus camaldulensis and E. tereticornis for early growth and susceptibility to the gall wasp Leptocybe invasa in China.Euphytica , 196 (3) : 397–411. (0)
[32]	Narum S R, Campbell N R, Kozfkay C C, et al.2010. Adaptation of redband trout in desert and montane environments. Molecular Ecology , 19 (21) : 4622–4637. DOI:10.1111/mec.2010.19.issue-21 (0)
[33]	Payn K G, Dvorak W S, Janse B J H, et al.2008. Microsatellite diversity and genetic structure of the commercially important tropical tree species Eucalyptus urophylla,endemic to seven islands in eastern Indonesia. Tree Genetics&Genomes , 4 (3) : 519–530. (0)
[34]	Peakall R, Smouse P.2006. GenAlEx 6:genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research.Molecular Ecology Notes , 6 (1) : 288–295. (0)
[35]	Prunier J, Gérardi S, Laroche J, et al.2012. Parallel and lineage-specific molecular adaptation to climate in boreal black spruce. Molecular Ecology , 21 (17) : 4270–4286. DOI:10.1111/j.1365-294X.2012.05691.x (0)
[36]	Prunier J, Laroche J, Beaulieu J, et al.2011. Scanning the genome for gene SNPs related to climate adaptation and estimating selection at the molecular level in boreal black spruce. Molecular Ecology , 20 (8) : 1702–1716. DOI:10.1111/mec.2011.20.issue-8 (0)
[37]	Rousset F.2008. Genepop'007:a complete reimplementation of the Genepop software for Windows and Linux. Molecular Ecology Resources , 8 (1) : 103–106. DOI:10.1111/j.1471-8286.2007.01931.x (0)
[38]	Savolainen O, Lascoux M, MeriläJ.2013. Ecological genomics of local adaptation. Nature Reviews Genetics , 14 (11) : 807–820. DOI:10.1038/nrg3522 (0)
[39]	Savolainen O, Pyhäjärvi T, Knürr T.2007. Gene flow and local adaptation in trees. Annual Review of Ecology,Evolution,and Systematics , 38 : 595–619. DOI:10.1146/annurev.ecolsys.38.091206.095646 (0)
[40]	Schlötterer C.2003. Hitchhiking mapping-functional genomics from the population genetics perspective. Trends in Genetics , 19 (1) : 32–38. DOI:10.1016/S0168-9525(02)00012-4 (0)
[41]	Shani Z, Dekel M, Tsabary G, et al.1997. Cloning and characterization of elongation specific endo-1,4-beta-glucanase (cel1) from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology , 34 (6) : 837–842. DOI:10.1023/A:1005849627301 (0)
[42]	Showalter A M.1993. Structure and function of plant cell wall proteins. Plant Cell , 5 (1) : 9–23. DOI:10.1105/tpc.5.1.9 (0)
[43]	Steane D A, Conod N, Jones R C, et al.2006. A comparative analysis of population structure of a forest tree,Eucalyptus globulus (Myrtaceae),using microsatellite markers and quantitative traits. Tree Genetics&Genomes , 2 (1) : 30–38. (0)
[44]	Steane D A, Potts B M, Mclean E, et al.2014. Genome-wide scans detect adaptation to aridity in a widespread forest tree species. Molecular Ecology , 23 (10) : 2500–1513. DOI:10.1111/mec.12751 (0)
[45]	Varghese M, Kamalakannan R, Harwood C E, et al.2009. Changes in growth performance and fecundity of Eucalyptus camaldulensis and E. tereticornis during domestication in southern India.Tree Genetics&Genomes , 5 (4) : 629–640. (0)
[46]	Yanchuk A D.2001. A quantitative framework for breeding and conservation of forest tree genetic resources in British Columbia. Canadian Journal of Forest Research , 31 (4) : 566–576. DOI:10.1139/x00-133 (0)
[47]	Zhou C, He X, Li F, et al.2014. Development of 240 novel EST-SSRs in Eucalyptus L'Hérit. Molecular Breeding , 33 (1) : 221–225. DOI:10.1007/s11032-013-9923-z (0)